从柴胡（Bupleurum）地上部分提取的黄酮类化合物，在黄羽肉鸡急性热暴露后开始恢复时使用，可以减轻其肝脏和肺部的残留损伤

《Poultry Science》：A flavonoid extract from Bupleurum aerial parts given at recovery onset attenuates residual liver and lung injury in yellow-feathered broilers after acute heat exposure

　　王泽辉|李振宇|杜玉光|李凯
山西大学现代中医研究中心，中国山西省太原市

**摘要**
大多数关于肉鸡热应激的研究都集中在暴露阶段，而热暴露后的最初几小时却鲜有研究。我们测试了从柴胡地上部分提取的黄酮类化合物（BAPF），在恢复期开始时给予该化合物，是否能够减少暴露在35°C环境中6小时，随后在24°C环境中冷却6小时的黄羽肉鸡的肝脏和肺部损伤。结果表明，这种提取物改善了肝脏和肺部的组织结构，降低了血清中的损伤标志物以及循环中的白细胞介素-1β和白细胞介素-18水平，并提高了肝脏的氧化还原指数。其中，每天46至68毫克/千克体重的剂量效果最为显著。探索性综合分析也表明，这一剂量范围最为有效。在另一个使用鸡成纤维细胞系DF-1的热应激和复温模型中，同样在恢复期开始给予该提取物，可以降低活性氧水平，增加核因子红细胞2相关因子2（NRF2）的核表达，并减少NLR家族的pyrin结构域蛋白3、切割型caspase-1和切割型caspase-3以及切割型gasdermin E的免疫印迹信号。ML385预处理组部分缓解了这些变化，支持了这一途径的作用。总体而言，这些发现表明，在热暴露后的早期恢复期可能是一个有效的干预窗口，值得进一步评估在恢复期开始时给予BAPF以限制黄羽肉鸡的器官损伤。

**引言**
热应激是肉鸡生产中的一个主要限制因素。近期的一些综述总结了热暴露对家禽的氧化应激及其更广泛的生理影响（Oke等人，2024年），同时也探讨了营养干预措施（Olayiwola和Adedokun，2025年）。然而，大多数干预研究都集中在暴露阶段，而非热暴露后的最初几小时。在本研究中，我们将早期恢复视为热暴露后的一个独立阶段，因为氧化损伤可能在热暴露后持续数小时（Yang等人，2010年）。选择80日龄的黄羽肉鸡进行研究，因为这个阶段接近该品种的生产关键生长时期，且在生理上可能与常用的快速生长型商业肉鸡不同。实验设计为35°C环境中暴露6小时，随后进行6小时的程序性冷却，旨在施加急性但非致命的热负荷，并隔离热暴露后的早期恢复期，而不是模拟慢性或循环性的热暴露。

**植物化学研究**
研究表明，柴胡地上部分含有抗炎成分，这为评估黄酮类化合物提取物（BAPF）在热损伤模型中的作用提供了依据（Li等人，2024年）。针对黄羽肉鸡的研究发现，热应激会导致进食行为和福利指标的改变（Feng等人，2024年；Uea-Anuwong等人，2025年）；而更广泛的研究则指出热负荷会损害肉鸡的生长和生理反应（Beckford等人，2020年；Kim等人，2025年）。在肉鸡中，热暴露会破坏肝脏的氧化还原平衡，在慢性模型中还与肝脏炎症信号传导和肺血气屏障损伤有关（Liu等人，2022年；Tang等人，2022年；Wu等人，2023年）。最近关于肉鸡营养的研究主要测试了在慢性或循环性热暴露前或期间给予的补充剂，如花青素单宁、白藜芦醇、芦丁和葛根素，而不是仅在恢复期开始时给予的干预措施（Zhao等人，2024年；Ding等人，2025年；Ma等人，2025年；Xu等人，2025年）。也有综述总结了用于缓解肉鸡热应激的植物源策略（Oni等人，2024年）。

**实验方法**
我们在80日龄的黄羽肉鸡中建立了急性热暴露和程序性恢复模型，以测试在恢复期开始时给予治疗是否能够从生理、组织学、生化和选定的分子指标上限制肝脏和肺部的损伤。本研究仅使用探索性综合评分对剂量进行排序。为了补充体内实验，我们还使用了鸡胚胎成纤维细胞系DF-1作为简化的鸟类热应激和复温模型，以研究核因子红细胞2相关因子2（NRF2）的反应。鸟类细胞研究表明，DF-1成纤维细胞和鸡肝细胞中的NRF2与氧化应激有关（Gao等人，2023年；Yang等人，2024年）。为了使细胞模型与体内治疗窗口一致，我们在热暴露后的恢复期开始给予BAPF处理，而ML385则作为预处理组用于途径分析。

**材料与方法**
**肉鸡、饲养环境和实验设计**
所有动物实验程序均经过山西农业大学机构动物护理和使用委员会的审查和批准（批准编号：SXAU-EAW-2025SD0237）。体内实验于2025年10月在一家认证的家禽设施中进行（许可证编号：SYXK (Shanxi) 2025-0010）。实验计划遵循PREPARE指南，报告遵循ARRIVE 2.0标准，动物护理和使用遵循《农业动物在研究和教学中的护理和使用指南》第4版（Smith等人，2018年；FASS，2020年；Percie du Sert等人，2020a,b）。

**人道终点**
预定了以下人道终点：严重的呼吸困难、无法站立、失去平衡反射或濒死状态、明显的拒食或拒水、严重脱水、体重迅速下降超过15%，或其他不可逆的严重痛苦。符合任何这些标准的肉鸡将被人道处死并不再进行进一步实验。所有肉鸡均不符合这些标准。被选为最终采样的肉鸡或达到人道终点的肉鸡由受过培训的人员通过颈椎脱位进行安乐死。死亡通过呼吸和心跳的停止以及瞳孔固定和扩大来确认。本研究中未进行需要麻醉的生存手术或其他侵入性操作。

**实验对象**
共从中国北方山西省的一个鸡群中获得了144只80日龄的健康黄羽肉鸡。选择80日龄的肉鸡是因为这个阶段接近该品种的生产关键生长时期，其器官损伤可能与市场年龄管理直接相关。该群体为混合性别，包括70只雄性和74只雌性，体重差异小于10%。

**饲养条件**
到达后，肉鸡在24±1°C的恒温条件下适应7天，自由进食和饮水。在整个实验期间，所有肉鸡都接受相同的基础日粮；日粮成分和计算出的营养水平见附加文件1（补充表S1和S2）。日粮中添加了5%的Three-yellow鸡专用预混料（产品标准编号：Q/320481ZCK004-2023；江苏溧阳正昌饲料科技有限公司）。批次可追溯性详情见附加文件2。

**实验单元**
笼子是衡量生长性能、饲料摄入量和平均体重的主要单位。分为8组：恒温对照组（CON）、热应激组（HS）、HS加钙羧酸酯（HS+CCA，每天100毫克/千克体重[钙羧酸酯可溶性粉末，50%配方；产品编号：KaBPLG；中国渭倩坊品牌；兽药批准编号：120642313]，以及HS加柴胡地上部分提取物（HS+BAPF，每天20、30、46、68或102毫克/千克体重）。CON组在恒温条件下饲养，仅接受纯净水灌胃。除CON组外，所有组都经历了急性热暴露后进行程序性冷却。口服处理从第0天恢复期开始，连续3天每天重复一次。组代码在实验结束和统计分析前保持匿名。

**急性热暴露和恢复方案**
急性热暴露在具有可编程温度和湿度控制的环境室中进行（空调设备加湿度控制加湿器HR-30-K；上海伊利洁工业有限公司）。除CON组外，所有笼子同时放入环境室。在4小时的恒温基线期后，环境温度从24°C升高到35°C，保持6小时，然后在接下来的6小时内逐渐降至24°C。这种急性处理旨在产生明显的但可存活的热负荷，并保留热暴露后最初几小时的明确干预窗口。

**数据监测**
环境室内的温度和相对湿度使用蓝牙温度湿度数据记录仪（TempU，型号K3；深圳友康电气有限公司）在3个固定位置（空调出口、加湿器附近和门附近）每1分钟监测一次。环境室记录见附加文件1。时间从实验开始时计算。基线指的是4小时的恒温预热期；T10至T12小时指的是热暴露期结束和早期冷却期；T14至T16小时指的是恢复到恒温条件后的后期恢复期。通过计数15秒内的呼吸次数并乘以4来记录张口喘息的行为，作为严重散热的指标。由于每个时间点只观察了一部分笼子（每组n=2），因此这些数据是描述性的。

**给药方式**
恢复开始后1小时内，肉鸡接受指定的口服处理。CON组和HS组接受纯净水；BAPF组接受20、30、46、68或102毫克/千克·天的BAPF溶解在纯净水中的溶液；HS+CCA组接受100毫克/千克·天的钙羧酸酯（50%配方）。处理在恒温条件下（24±1°C）持续3天。

**数据分析**
采用探索性综合评分对剂量进行排序。

**补充实验**
为了补充体内实验，我们使用鸡胚胎成纤维细胞系DF-1作为简化的鸟类热应激和复温模型，以研究核因子红细胞2相关因子2（NRF2）的反应。鸟类细胞研究表明，DF-1成纤维细胞和鸡肝细胞中的NRF2与氧化应激有关（Gao等人，2023年；Yang等人，2024年）。定量标记物含量见表1和补充表S29（附加文件3）。缩写：BAPF，来自柴胡地上部分的黄酮类提取物；HPLC，高效液相色谱法；QC，质量控制。

表1. BAPF标记化合物的批次放行标准
指标 接受标准 6个批次的范围
绿原酸 ≥1.0%（重量/重量） 1.1%至1.7%
芸香苷+槲皮素（总和） ≥4.5%（重量/重量） 4.6%至5.2%

数值为6个独立生产批次（C1至C6）的范围。接受标准表示放行阈值（重量/重量）。芸香苷和槲皮素以总和形式报告。

**腿部标记编码和样本收集**
肉鸡通过颜色编码的腿部标记进行个体识别，并在实验前预先分配到每个笼子的特定采样点。这种编码方式保持了固定的采样时间表，并使实验室分析保持盲法。在第0天，即灌胃后约5至6小时，从翼静脉采集血液。样本静置凝固后，在4°C下以3,500×g离心15分钟，血清储存在-80°C直至检测。

**组织病理学检查**
固定24至48小时后，肝脏和肺部样本通过分级乙醇脱水，用二甲苯清洗，嵌入石蜡中，切片（约4 μm），脱蜡，重新水化，并用苏木精和伊红（H&E）染色。在光学显微镜（Olympus BX53，Olympus，东京，日本）下检查肝脏切片，观察肝索排列、肝细胞变性和坏死、炎症细胞浸润、窦状充血和胆管病变（Tang等人，2022年）。对于肺部，评估支气管和肺泡结构、间质水肿、毛细血管充血和炎症细胞浸润（Wu等人，2023年）。病变进行半定量评分。肝脏损伤采用改进的Suzuki评分系统进行分级（窦状充血、肝细胞胞质空泡化和实质坏死各0至4分；总分为0至12分）；完整评分标准见补充表S23A（附加文件4）。

肺部损伤根据水肿、充血、结构破坏和炎症细胞浸润进行评分。评分标准见附加文件4中的补充表S28。每组选取3只肉鸡进行评分。每只鸟随机选取6个不重叠的视野，计算视野平均值作为每只鸟的最终得分。

**肺湿重与干重比**
为了评估肺水肿，在安乐死后立即切除右肺作为标准化样本。修剪附着的血管和支气管，并用滤纸去除表面水分，然后记录湿重。组织在强制空气烤箱（DHG-9053A；上海仪恒科学仪器有限公司，上海，中国）中以60°C干燥72小时以获得干重。肺湿重与干重比通过湿重除以干重计算。湿重和干重在经过校准的分析天平（LE204E；METTLER TOLEDO公司，美国；读数精度0.1 mg）上测量，干燥过程持续到质量稳定（连续两次测量的Δ < 1 mg）。个体湿重和干重以及相应的比率见附加文件4（补充表S3）。

**氧化应激和血清生化检测**
血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）活性使用商业酶促/比色试剂盒（AKAM006M、AKAM019M和AKCO003M；北京博生科技有限公司，北京，中国）在Spark 10M多模式微孔板读数器（Tecan，M?nnedorf，瑞士；SparkControl v2.3）上测量，并以单位/升报告。肝组织中的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）在第4天使用同一制造商的试剂盒（AKFA013M、AKAO001M和AKPR014M）进行测量。数值按蛋白质含量标准化，以纳摩尔/毫克蛋白质报告MDA，以单位/毫克蛋白质报告SOD和GPx。标准曲线根据试剂盒提供的标准品生成，酶活性按照制造商的说明进行报告。对于血清ALT和AST，每个样本在当天在同一板的两个孔中重复检测，最终每只鸟的值为两个孔的平均值。血清LDH在单个分析板的两个孔中重复检测，每只鸟使用两个孔的平均值。对于肝组织中的MDA、SOD和GPx，每个生物样本在单个分析板的两个孔中重复检测，每个板同时运行质量控制样本；技术重复值在每个样本内平均，不作为独立观察值。原始OD值和吸光度值、重复孔数据、每只鸟的处理值以及这些检测的简要质量控制信息见附加文件5（补充表S8至S17）。

**血清细胞因子（ELISA检测）**
使用商业ELISA试剂盒（包括Chicken IL-1β定量检测试剂盒（ELISA；商品编号YPJV1888；上海宇平生物科技有限公司，杭州，浙江）和Chicken IL-18检测试剂盒（商品编号YPY31629；上海宇平生物科技有限公司，杭州，浙江）根据制造商的协议定量血清中的鸡白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）。试剂盒详细信息和原始OD450值及质量控制数据见附加文件5（补充表S13至S15）。标准曲线根据系列稀释的标准品生成，适当稀释的样本与相应的检测试剂在抗体包被的板上孵育。在450 nm处读取吸光度，并根据标准曲线计算浓度。对于竞争性IL-1β检测，光密度与分析物浓度成反比。所有样本均重复检测，每只鸟的平均值用于分析。

**Western Blot分析**
储存在-80°C的冷冻肝脏样本在RIPA裂解缓冲液（商品编号G2002；Servicebio，武汉，中国）中加入蛋白酶抑制剂混合物（商品编号G2006）和磷酸酶抑制剂（商品编号G2007；Servicebio，武汉，中国）后进行裂解，冰上孵育30分钟，然后在4°C下以12,000×g离心15分钟。收集上清液，并使用BCA蛋白测定试剂盒（商品编号PK10026；Proteintech，Rosemont，IL，美国）测定蛋白质浓度。等量的蛋白质（每条泳道30至40 μg；每个印迹内匹配）与加载缓冲液混合，煮沸5分钟，通过SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜上。膜在室温下用5%非脂肪牛奶和TBST封闭1小时。

对于代表性的免疫印迹，1条泳道对应1个生物重复样本（每组n=3只肉鸡；CON、HS、HS+BAPF30和HS+BAPF68）。膜在4°C下与针对NRF2（商品编号16396-1-AP）、HO-1（商品编号10701-1-AP）、NLRP3（商品编号68102-1-Ig）、切割的caspase-3（商品编号25128-1-AP）、GSDME和切割的GSDME（商品编号31363-1-AP）以及β-actin（商品编号66009-1-Ig）（Proteintech，Rosemont，IL，美国）的一抗孵育过夜。抗体的选择基于制造商信息和针对鸡样本的初步优化。一抗稀释比例为1:1,000，HRP结合的二抗稀释比例为1:5,000。TBST洗涤后，膜在室温下与HRP结合的山羊抗兔IgG（H+L）（商品编号SA00001-2）或HRP结合的山羊抗鼠IgG（H+L）（商品编号SA00001-1）（Proteintech，Rosemont，IL，美国）孵育1小时。使用增强型化学发光底物（SignalBright Plus；商品编号PK10012；Proteintech，Rosemont，IL，美国）可视化条带，在Tanon 5200化学发光成像系统（Tanon Science & Technology Co., Ltd., 上海，中国）上成像，在ImageJ中量化，并相对于CON组进行归一化。

**定量逆转录PCR**
使用RNAprep Pure Tissue Kit（商品编号GDP431；TIANGEN Biotech，北京，中国）从RNAlater保存的肝脏组织中提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和OD260:OD280比率检查RNA的纯度和完整性。1微克总RNA使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（商品编号4992227；TIANGEN Biotech，北京，中国）逆转录为cDNA。使用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green；商品编号4992214；TIANGEN Biotech，北京，中国）在ViiA 7实时PCR系统（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国；商品编号4453534）上定量NFE2L2（NRF2）、HMOX1（HO-1）、TLR4、NLRP3、CASP3、CASP7、GSDME和IL18。RELA和IL1B也在探索性分析中进行评估。qPCR报告遵循MIQE 2.0建议（Bustin等人，2025）。GAPDH用作参考基因。循环条件为95°C 30秒，随后是40个循环：95°C 5秒和60°C 30秒，通过熔解曲线分析确认产物特异性。相对基因表达使用2?ΔΔCt方法计算，CON组的平均值设为1进行归一化（Livak和Schmittgen，2001）。引物序列见附加文件7。定量PCR比较集中在CON、HS、HS+BAPF30和HS+BAPF68（每组n=6只肉鸡；每个笼子1只鸟）。

**DF-1细胞热应激模型和体外处理**
为了研究NRF2在简化的鸟类热应激和复温模型中的反应，将鸡胚胎成纤维细胞系DF-1（UMNSAH/DF-1，ATCC CRL-3586；上海富恒生物技术，上海，中国）培养在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中，其中添加了10%胎牛血清（商品编号10099141C）和1%青霉素和链霉素（商品编号15140122）。细胞在39°C的湿润5% CO2培养箱中维持，以模拟鸟类生理温度，并每2至3天传代一次。实验中，细胞接种在6孔或96孔板中，生长至70%至80%的汇合度后进行处理。

细胞被分配到CON、HS、HS+BAPF62.5、HS+BAPF125和HS+BAPF125+ML385（2 μM）组。对照细胞保持在39°C。热应激组的细胞暴露于42°C 2小时，然后在39°C下复温2小时。在BAPF组中，提取物在恢复开始时加入，并在整个39°C复温阶段持续存在，各组之间使用匹配的溶剂。在抑制剂组中，ML385在热暴露前1小时加入，最终DMSO浓度保持在0.1%以下，并在各组之间匹配。工作浓度是根据使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）和MTT检测在48小时暴露于0至2,000 μg/mL BAPF后的初步筛选研究选定的。每个浓度在四个重复孔中测试，使用无细胞的空白孔进行校正（Corrected OD = ODtest ? ODblank）。活力以溶剂为基准进行归一化；浓度≤62.5 μ/mL在两种检测中均无细胞毒性，而125 μ/mL仅在48小时后引起轻微下降。因此，62.5 μg/mL和125 μg/mL被选为热应激和复温实验及后续机制分析的较低和较高工作浓度（附加文件7，补充表S25）。

**复温后制备核和胞质组分**
复温后制备核和胞质组分以评估NRF2的定位。ML385组包含在图8E和8G所示的免疫印迹和分离实验中。分离使用Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit（商品编号P0027；Beyotime Biotechnology，上海，中国），Lamin B1（商品编号66095-1-Ig）和β-actin（商品编号66009-1-Ig）分别作为核和胞质标记物。

为了提高鸡GSDME处理的检测灵敏度，HEK293T细胞（ATCC CRL-3216）和DF-1细胞（UMNSAH/DF-1，ATCC CRL-3586）在热应激前24小时用双标签FLAG-chGSDME-HA构建体短暂转染。转染条件和未裁剪的免疫印迹源图像的总结表见附加文件10。过表达通过抗FLAG免疫印迹验证（图8F和附加文件10），切割通过FLAG阳性的N末端片段和减少的全长HA标记chGSDME推断，这与先前的研究一致（Chen等人，2025）。

细胞内ROS通过流式细胞术检测，使用含有DCFH-DA的活性氧试剂盒（商品编号S0033；Beyotime Biotechnology，上海，中国）染色后进行。细胞在39°C下与探针孵育20分钟，洗涤后立即在NovoCyte 2060R流式细胞仪（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美国；部件编号2010004AA）上分析。流式细胞术数据在NovoExpress中使用附加文件7中提供的门控策略进行分析。从在相同条件下未加探针的样本中减去背景后，ROS水平表示为平均荧光强度。使用Hoechst 33342活细胞染色溶液（商品编号C1027）和Annexin V-PE凋亡检测试剂盒（商品编号）在复温后可视化磷脂酰丝氨酸的外化。C1065)（上海贝奥泰生物科技有限公司），相关研究领域如图8D所示。对于NRF2、HO-1、NLRP3、切割的caspase-3和切割的GSDME的分析，处理后用冰冷的PBS清洗细胞，在冰上加入抑制剂补充的RIPA缓冲液中裂解30分钟，然后在4°C下以12,000×g离心15分钟。上清液用于蛋白质定量和Western blot分析，具体方法如上所述。目标蛋白包括NRF2、HO-1、NLRP3、切割的caspase-1（p20）、切割的caspase-3和GSDME（全长和切割形式），以β-actin作为加载对照。免疫印迹信号通过ImageJ中的密度计进行量化，相对于β-actin或Lamin B1和β-actin对核和细胞质部分进行归一化，并相对于指定的参考组进行表达。这些归一化的免疫印迹信号，结合ROS平均荧光强度和Annexin V成像，用于评估抗氧化反应和焦亡相关信号。展示了代表性的DF-1印迹结果。所有体外实验独立重复3次，每次实验每个处理组有3个平行孔。

为了对本研究中的剂量进行排序，我们计算了5个BAPF剂量组（20、30、46、68和102 mg/kg·d）的探索性综合疗效评分（ICOMP）。ICOMP整合了12个终点，包括恢复期间的残余高热、肺湿干比、血清损伤标志物、肝脏氧化还原指数、循环细胞因子以及肝脏和肺部的组织病理学评分。较高的数值表示更好的整体恢复情况。ICOMP被指定为探索性指数用于剂量排序，并未作为确认性的主要终点。单个终点的分析仍然是生物学解释的基础，而ICOMP仅用于总结本研究中不同恢复相关结果的一致性。

对于那些较高数值表示较差结果的终点（除了SOD和GPx之外的所有终点；包括泄殖腔温度、肺湿干比、ALT、AST、LDH、MDA、IL-1β、IL-18和组织病理学评分），剂量d时的归一化抑制率定义为：
(Eq. 1) Ii(d) = [(Xi,HS ? Xi(d)) / (Xi,HS ? Xi,CON)] * 100%。

对于那些较高数值表示更好抗氧化能力的终点（SOD和GPx），剂量d时的归一化改善率定义为：
(Eq. 2) Ii(d) = [(Xi(d) ? Xi,HS) / (Xi,CON ? Xi,HS)] * 100%。

在上述公式中，Xi,HS和Xi,CON分别表示HS组和CON组的平均值，而Xi(d)表示给定剂量d时的个体值。每个Ii(d)值的范围在0到100%之间，综合疗效评分是通过对所有可用归一化终点的未加权平均值计算得出的。
(Eq. 3) ICOMP(d) = [I1(d) + I2(d) + ... + Im(d)] / m。

剂量与反应之间的关系使用具有可变斜率的4参数逻辑（4PL）函数进行建模，其中X = log10(剂量, mg/kg·d)，Y = ICOMP(d)：
(Eq. 4) [Math Processing Error] Y = Bottom + (Top ? Bottom) / (1 + 10^((LogED50 ? X) * HillSlope))。

一个具有可变斜率的4参数逻辑模型被拟合到ICOMP与log10剂量的关系上。ED50、ED90和ED95是从这个探索性模型中得出的，仅用于本研究中的剂量优先级排序。为了评估优先级范围是否由任何单一终点领域驱动，通过排除选定的终点类别并重新拟合剂量反应模型来进行敏感性分析。

统计分析使用SPSS 26.0（IBM，美国纽约州阿蒙克）和GraphPad Prism（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行。正态性和方差齐性分别使用Shapiro-Wilk检验和Levene检验进行评估。对于满足假设的情况，使用单因素ANOVA进行比较，随后使用Tukey多重比较或以HS为预设参考的Dunnett检验。否则，应用Kruskal-Wallis检验，随后使用Dunnett多重比较。对于在多个时间点测量的变量，使用重复测量ANOVA，时间作为组内因素。泄殖腔温度以个体鸟为研究对象，而在笼子水平测量的变量以笼子为实验单位。

在笼子水平记录的喘息数据被描述性地总结并绘制出来，以说明总体趋势（每个时间点每组2个笼子；子集），而不是用于每个时间点的正式推断。剂量与反应之间的关系以及相应的ED值通过上述4参数逻辑模型进行非线性回归估计。分配按体重分层。除非另有说明，数据以平均值±标准误差（SEM）的形式呈现。笼子（每组6个）是生长表现和每笼子饲料摄入量的实验单位。对于大多数其他体内测定，每个笼子使用1只采样鸟（每组6只），而组织病理学在每组3只肉鸡中进行评估。对于图9，使用可用终点计算探索性指数；图9B中的每个点代表每只鸟的1个ICOMP值（每组6只肉鸡）。对于体外测定，技术重复在每个独立实验中平均，独立实验作为实验单位。在每个终点内使用家族错误率调整的事后程序控制多重性。环境监测数据用于质量控制，因为每分钟收集的测量数据是自相关的。P < 0.05被用作决策阈值，并报告名义P值。对于qPCR，推断统计基于ΔCt值（Cttarget ? CtGAPDH）进行，而2?ΔΔCt值用于可视化。在DF-1细胞毒性筛选中，通过单因素ANOVA和Dunnett检验评估处理组与对照组之间的差异。图表在GraphPad Prism 9.5.1中生成。

结果
PLC指纹图谱显示BAPF制备的批次一致性
在疗效测试之前，我们确认了制备的批次一致性。混合参考标准确定了绿原酸、芸香苷和槲皮素作为特征峰（图2B）。在6个生产批次（C1至C6）中，整体指纹图谱高度相似（图2C）。定量标记分析与指纹图谱结果一致。绿原酸的含量范围为1.1%至1.7%，芸香苷加槲皮素的含量范围为4.6%至5.2%，均在预定义的接受标准范围内（表1；补充表S29，附加文件3）。总体而言，所有6个批次均符合预设的释放标准。

加热暴露和恢复期间的环境条件及生理反应
编程的热暴露和恢复协议符合预定的温度和湿度曲线，并施加了明显的热负荷（图3A）。HS肉鸡的泄殖腔温度在整个加热暴露期间及恢复初期保持升高。在加热负荷期间，张开喙的喘息行为增加，在恢复期间减轻；然而，这些行为观察仅基于部分笼子的观察结果进行描述性分析。

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图3. 加热暴露和恢复期间的热负荷验证及生理反应。(A) 在整个挑战和恢复协议期间，每分钟记录的腔室温度（°C）和相对湿度（%）。(B) 加热暴露和恢复期间，相对于每个笼子基线的饲料摄入量（%）。(C) 过夜禁食后第4天的肺湿干比。(D) 残余恢复高热，计算为相对于基线泄殖腔温度的平均差异（°C），并附有95%置信区间。(E) 分配时的初始体重。(F) 加热暴露和恢复期间张开喙的喘息行为，以热图形式描述性显示。B和C中的数据为平均值±SEM；C和E中的点表示个体肉鸡。在C中，符号表示相对于HS的调整后的P值：*P ≤ 0.05，**P ≤ 0.01，***P ≤ 0.001。喘息行为仅在部分笼子中记录（每组每个时间点2个笼子）。原始腔室日志、饲料摄入数据和确切的P值在附加文件1中提供。缩写：CON，热中性对照；HS，热应激模型；HS+CCA，HS加羧酸钙（50%配方，100 mg/kg·d）；BAPF，来自柴胡地上部分的黄酮提取物；SEM，平均值的标准误差；CI，置信区间。

每个笼子的饲料摄入量以基线的百分比表示，在加热暴露后下降，并在CCA和BAPF组中显示出数值上的恢复模式。由于饲料摄入量是在短时间内在笼子水平测量的，因此该终点用于支持性生理背景，而不是作为主要疗效结论。确切的P值和笼子水平的饲料摄入量数据在附加文件1中提供；没有基于这个短期恢复窗口的疗效结论。

BAPF改善恢复期间的肝脏和肺部组织病理学
来自CON肉鸡的肝脏和肺部切片显示出基本结构保持完好，只有偶尔的轻微背景变化。相比之下，急性热暴露后经过编程恢复的HS肉鸡出现了明显的肝脏和肺部病变（图4）。HS肉鸡的肝脏显示出肝索紊乱、细胞肿胀变性、核固缩和核裂解、炎症浸润以及窦状充血。HS肉鸡的肺部显示出肺泡隔增厚、水肿、毛细血管充血以及支气管周围和间质内的炎症细胞积聚；因此，HS组的肝脏和肺部损伤评分均高于CON组。

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图4. BAPF在加热暴露和恢复后缓解肝脏和肺部组织病理学损伤。(A) 在过夜禁食后第4天收集的CON、HS、HS+CCA和HS+BAPF（20、30、46、68和102 mg/kg·d）的代表性H&E染色肝脏切片。(B) 同一组和同一时间点的代表性H&E染色肺部切片。比例尺=100 μm。(C) 肝脏损伤评分（改编自Suzuki评分，0到12）。(D) 肺部损伤评分（0到20）。在每组3只肉鸡中进行了组织病理学评分。每个鸟的六个不重叠的视野在盲法条件下评分并平均得出每只鸟的1个值。点表示个体肉鸡；条形图显示平均值±SEM。统计：Kruskal-Wallis检验与HS进行多重比较。ns，P > 0.05；*P ≤ 0.05；**P ≤ 0.01；***P ≤ 0.001。原始评分数据和评分标准在附加文件4中提供。缩写：H&E，苏木精和伊红；CON，热中性对照；HS，热应激模型；CCA，羧酸钙；BAPF，来自柴胡地上部分的黄酮提取物；SEM，平均值的标准误差。

这些病变在不同剂量下有所减轻。在较低剂量范围内，30 mg/kg·d的改善效果比20 mg/kg·d更明显。在46和68 mg/kg·d时反应最为一致，而102 mg/kg·d也有所改善，但没有明显的额外益处。同样，接受46或68 mg/kg·d BAPF的肉鸡的肺部显示出更好的肺泡结构、较少的间质水肿和较少的炎症细胞。102 mg/kg·d组也有改善，但反应并不明显优于46或68 mg/kg·d组。HS+CCA组显示出类似的总体模式。

恢复期间的血清生化、肝脏氧化还原状态和细胞因子反应
在恢复期第0天（恢复结束时）测量血清生化标志物，并在过夜禁食后的第4天评估肝脏氧化还原状态。与CON相比，HS组血清ALT、AST和LDH（U/L）以及肝脏MDA（nmol/mg蛋白）增加，而肝脏SOD和GPx活性（U/mg蛋白）降低（图5A-D、G和H）。

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图5. 加热暴露和恢复后的血清生化、肝脏氧化还原指数和循环细胞因子。测量了CON、HS、HS+CCA组的血清ALT（A）、AST（B）、LDH（C）、MDA（D）、循环IL-18（E）和IL-1β（F）以及肝脏SOD（G）和GPx（H）（20、30、46、68和102 mg/kg·d）。血清终点在恢复结束时的第0天进行评估，肝脏氧化还原终点在过夜禁食后的第4天进行评估。点图显示个体肉鸡，平均值±SEM。确切的P值和来源数据在附加文件5中提供。缩写：ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天冬氨酸氨基转移酶；LDH，乳酸脱氢酶；MDA，丙二醛；SOD，超氧化物歧化酶；GPx，谷胱甘肽过氧化物酶；IL-18，白细胞介素-18；IL-1β，白细胞介素-1β；CON，热中性对照；HS，热应激模型；CCA，羧酸钙；BAPF，来自柴胡地上部分的黄酮提取物；SEM，平均值的标准误差。

与HS相比，BAPF减轻了这些变化。在46和68 mg/kg·d时，肝脏MDA降低（P = 0.003和P < 0.001），而相同剂量下的肝脏SOD和GPx活性升高（SOD：P = 0.004和P < 0.001；GPx：P = 0.039和P < 0.001；图5D、G、H）。血清ALT和AST在46和68 mg/kg·d时也低于HS组，并趋向于对照值（两种ALT比较，P < 0.001；两种AST比较，P < 0.001；图5A、B）。血清乳酸脱氢酶活性相对于HS也有所下降，尽管反应并非严格单调。在中等至高剂量范围内观察到改善，但在最高剂量时出现轻微的平台期或反弹。HS+CCA组显示出类似的总体益处模式（图5）。BAPF在恢复期间降低了循环中的白细胞介素-18和白细胞介素-1β的水平。通过在恢复结束时的第0天使用ELISA测量循环中的IL-18和IL-1β浓度，发现这两种细胞因子在HS组中均高于CON组（图5E, F）。与HS组相比，在46 mg/kg·d和68 mg/kg·d剂量下，循环中的IL-18水平较低（P = 0.003和P < 0.001），IL-1β在相同剂量下也较低（P = 0.001和P < 0.001），其中68 mg/kg·d剂量下的水平最低（图5E, F）。对于IL-1β，102 mg/kg·d剂量组显示出轻微的反弹，但仍低于HS组。HS+CCA组的循环IL-1β水平也低于HS组，而IL-18虽然数值上也较低，但在多重比较校正后未达到统计学显著性。原始ELISA数据（包括OD450读数、计算浓度和质量控制指标）见附加文件5（补充表S13至S15）。BAPF在第四天将肝脏分子指标恢复到对照水平。为了确定这些表型改善是否伴随着肝脏分子变化，第四天进行了RT-qPCR和免疫印迹分析，重点关注30 mg/kg·d和68 mg/kg·d剂量，分别代表较低反应剂量和较高剂量。由于46 mg/kg·d剂量未包含在该分子分析中，这些数据被解释为支持该途径的证据，而不是对整个46至68 mg/kg·d剂量范围的完整机制剂量反应分析。与CON组相比，HS组使肝脏指标向较低水平转变，同时与损伤相关的标记物（包括TLR4、NLRP3、CASP3、CASP7、GSDME和IL18）的表达增加。基于ΔCt的分析显示，30 mg/kg·d和68 mg/kg·d组的肝脏NLRP3表达低于HS组（P = 0.001和P < 0.001），68 mg/kg·d组的指标整体上最接近对照水平（图6）。免疫印迹显示NRF2、HO-1、NLRP3、切割的caspase-3和切割的GSDME的方向变化一致，68 mg/kg·d组的CASP3转录本丰度低于HS组（P < 0.001），这与肝脏中观察到的切割相关蛋白减少模式一致（图6, 图7）。由于RELA mRNA在各组间没有差异，且HMOX1 mRNA和HO-1蛋白并不完全一致，我们对上游激活和HO-1的参与持谨慎态度。

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**图6.** 与抗氧化防御和炎症小体相关的肝脏转录反应。在禁食一夜后第四天收集的肝脏样本中，对NFE2L2和HMOX1 mRNA以及TLR4、NLRP3、CASP3、CASP7、GSDME和IL18 mRNA进行了逆转录定量PCR分析。显示表达值仅用于可视化；统计分析基于ΔCt值。显示的组别：CON、HS、HS+BAPF30和HS+BAPF68（每组6只鸡；每个笼子1只鸡）。点图显示个体值及其平均值±标准误差（SEM）。统计方法：单因素ANOVA后进行Dunnett多重比较与HS组比较。符号表示相对于HS组的调整后P值：ns，P > 0.05；*P ≤ 0.05；**P ≤ 0.01；***P ≤ 0.001。确切的P值和支持性qPCR表格见附加文件7。缩写：NFE2L2，核因子红细胞2相关因子2；HMOX1，血红素加氧酶1；TLR4，Toll样受体4；NLRP3，NLR家族含吡啶结构域3；CASP3，caspase-3；CASP7，caspase-7；GSDME，gasdermin E；IL18，白细胞介素-18；ΔCt，循环阈值；CON，热中性对照；HS，热应激模型；BAPF，来自柴胡地上部分的黄酮提取物；SEM，平均值的标准误差。

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**图7.** 禁食一夜后第四天收集的肝脏样本中的NRF2、HO-1及相关蛋白的免疫印迹和密度分析。未裁剪的印迹见附加文件6。
(A) NLRP3、HO-1和NRF2的免疫印迹，以β-actin作为加载对照。
(B) 切割的caspase-3和切割的GSDME（GSDME-NT）的免疫印迹，以β-actin作为对照。
(C-G) 根据β-actin标准化的密度量化：NLRP3（C）、HO-1（D）、NRF2（E）、切割的GSDME（F）和切割的caspase-3（G）。从不同笼子中随机选取每组3只鸡（每个笼子1只），每条泳道代表1个生物学重复样本（每组3只鸡）。点图显示个体值及其平均值±标准误差（SEM）。密度值和确切的P值见附加文件8（补充表S27）。显示的组别：CON、HS、HS+BAPF30和HS+BAPF68。统计方法：单因素ANOVA后进行Dunnett多重比较与HS组比较。符号表示相对于HS组的调整后P值：ns，P > 0.05；*P ≤ 0.05；**P ≤ 0.01；***P ≤ 0.001。缩写：NRF2，核因子红细胞2相关因子2；HO-1，血红素加氧酶1；NLRP3，NLR家族含吡啶结构域3；GSDME-NT，N端切割的gasdermin E；CON，热中性对照；HS，热应激模型；BAPF，来自柴胡地上部分的黄酮提取物；SEM，平均值的标准误差。

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**图8.** 鸡胚成纤维细胞的热应激和复温实验支持NRF2的反应。
(A) DF-1细胞的热应激和复温方案。细胞在42°C下暴露2小时，然后在39°C下复温2小时。在复温开始时加入BAPF（62.5或125 μg/mL），并在整个复温过程中持续存在。在指定位置，在热暴露前1小时加入ML385（2 μM）（DMSO < 0.1%）。
(B) 体外实验分组。CON组、HS组和两个BAPF剂量组用于ROS定量和成像，而ML385组则用于免疫印迹和分级分析。
(C) 通过DCFH-DA流式细胞术测量细胞内ROS，以平均荧光强度（MFI）表示。数据为3次独立实验的平均值±标准误差（SEM）。C组的统计方法：单因素ANOVA后进行Dunnett检验与HS组比较。
(D) 使用Hoechst 33342和Annexin V-PE染色检测磷脂酰丝氨酸外化（代表性视野；比例尺=50 μm）。
(E) NLRP3、GSDME、切割的GSDME、切割的caspase-3、切割的caspase-3和HO-1的免疫印迹，以β-actin作为加载对照（CON组、HS组和HS+BAPF 125 μg/mL，含或不含ML385（2 μM）；代表性印迹；n = 3）。
(F) 使用抗FLAG验证HEK293T和DF-1细胞中的FLAG-chGSDME-HA短暂过表达；GAPDH作为加载对照。NC表示未转染，OE表示短暂过表达，62.5或125表示BAPF（μg/mL）在OE细胞中的浓度。
(G) 在存在ML385（2 μM）的条件下，细胞质和核 fraction中的NRF2丰度；β-actin和Lamin B1作为分数标记（代表性印迹；n = 3）。两种BAPF浓度是根据初步的CCK-8和MTT筛选选定的，其中125 μg/mL仅导致轻微的生存率下降（附加文件7：补充表S25）。C组的符号表示相对于HS组的调整后P值：ns，P > 0.05；*P ≤ 0.05；**P ≤ 0.01；***P ≤ 0.001。C组的原始数据（生物学重复样本的MFI值）见附加文件7（补充表S26）。未裁剪的印迹见附加文件10。缩写：DF-1，鸡胚成纤维细胞系；ML385，核因子红细胞2相关因子2抑制剂；DMSO，二甲基亚砜；ROS，活性氧；DCFH-DA，2′,7′-二氯二氟荧光素二乙酸酯；MFI，平均荧光强度；HO-1，血红素加氧酶1；NRF2，核因子红细胞2相关因子2；HEK293T，人胚肾293T细胞；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；NC，未转染对照；OE，短暂过表达；CCK-8，细胞计数试剂盒；CON，对照；HS，热应激；BAPF，来自柴胡地上部分的黄酮提取物；SEM，平均值的标准误差。

**体外热应激和复温实验支持NRF2的反应**
当在复温开始时加入BAPF时，DF-1细胞在复温后的细胞内ROS水平降低，特别是在125 μg/mL剂量下降低更为明显，Annexin V成像显示磷脂酰丝氨酸外化也相应减少。在125 μg/mL剂量组中，代表性免疫印迹显示NLRP3、切割的caspase-1、切割的caspase-3和切割的GSDME的信号低于HS组，而分级分析显示复温后核NRF2的丰度增加。ML385减弱了BAPF引起的核NRF2增加，并减轻了与损伤相关的印迹变化，支持NRF2通路在此简化复温模型中的作用。由于分级分析中的核NRF2估计是半定量的且依赖于模型，因此将其与ROS荧光、总损伤相关免疫印迹信号以及ML385的反应一起解释，而不是作为NRF2依赖性的独立证据。

**复合剂量反应分析**
为了在本研究中确定剂量优先级，对单个鸡的复合疗效得分（ICOMP）进行了4参数逻辑模型拟合（图9B）。探索性4PL拟合得出ED50约为36 mg/kg·d，并表明在最高剂量下的增量效益有限。复合疗效得分整合了第0天的体温调节、血清损伤和细胞因子终点以及第4天的器官水平结果。拟合曲线确定46至68 mg/kg·d为后续研究的优先剂量范围，在102 mg/kg·d剂量下的额外收益有限。HS+CCA组仅作为基准对照，未纳入曲线拟合。使用替代复合定义的敏感性分析得出的ED50估计值相似，约为35.4至36.4 mg/kg·d，表明优先剂量范围并非由单一终点决定。由于ICOMP是探索性的且未加权，因此应将优先剂量范围解释为后续测试的剂量范围，而不是确定的治疗剂量。

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**图9.** BAPF的探索性复合疗效评分和剂量反应分析。
(A) 最多12个终点的标准化抑制或改善的热图，以CON和HS作为基准（0% = HS；100% = CON）。SOD和GPx被视为效益类型终点；其他所有终点被视为损伤类型终点。
(B) 每只鸡的ICOMP与log10 BAPF剂量的4参数逻辑回归（20、30、46、68和102 mg/kg·d）。每个点代表每只鸡的ICOMP值（每组6只鸡；每个笼子1只鸡）。ED50、ED90和ED95来自拟合曲线，仅在此研究中作为探索性剂量指标解释。HS+CCA组作为基准对照，但未纳入曲线拟合。
(C) 每个BAPF剂量下ICOMP的相对终点贡献。源数据和敏感性分析见附加文件9。缩写：ICOMP，复合疗效得分；BAPF，来自柴胡地上部分的黄酮提取物；SOD，超氧化物歧化酶；GPx，谷胱甘肽过氧化物酶；CON，热中性对照；HS，热应激模型；CCA，羧基巴尔酸钙；4PL，4参数逻辑回归；ED50、ED90和ED95，分别对应于拟合最大反应的50%、90%和95%。

**图10**
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**图10.** 热暴露后恢复期间组织损伤的工作模型及BAPF的预期作用。实线表示支持的关联。虚线表示推断的关联。
(A) 假设急性热暴露后的恢复会持续氧化应激并促进与炎症小体和GSDME相关的肝脏损伤。在肺部，从表型数据推断出类似的分子参与，而非直接证明。支持的肝脏指标包括NLRP3的变化、IL-1β和IL-18轴上的标记物以及caspase-3介导的GSDME切割。TLR4和NF-κB的激活信号作为背景信息提供，而非直接证明。
(B) 假设BAPF通过增强NRF2的核富集来增强抗氧化防御，这可能降低ROS并减轻损伤信号。机制节点主要由肝脏和DF-1数据支持，而肺部益处主要由生理和组织学终点支持。缩写：BAPF，来自柴胡地上部分的黄酮提取物；NRF2，核因子红细胞2相关因子2；ROS，活性氧；NLRP3，NLR家族含吡啶结构域3；GSDME，gasdermin E；IL-1β，白细胞介素-1β；IL-18，白细胞介素-18；TLR4，Toll样受体4；NF-κB，核因子κB；DF-1，鸡胚成纤维细胞系。

**讨论**
本研究的主要发现是，热暴露后的早期恢复期仍然是持续损伤的时期，而不仅仅是简单地恢复到基线状态。尽管去除了外部热负荷，但残留的高热、肺水肿、组织病理损伤、血清酶升高和炎症细胞因子反应仍持续到恢复期。这种模式与先前的证据一致，即即使在急性热应激消除后，鸡的肝脏线粒体功能障碍、ROS产生和脂质过氧化仍可能持续存在（Yang等人，2010年）。然而，本研究通过测试在恢复期开始时实施的干预措施，而不仅仅是描述压力后的损伤情况，从而扩展了之前的研究。先前的肉鸡研究将热应激与肝脏氧化损伤、炎症信号传导、细胞凋亡以及肺血气屏障破坏联系起来，这些主要发生在慢性或循环模型中，或者在暴露期间进行治疗的模型中（Liu等人，2022年；Tang等人，2022年；Wu等人，2023年；Iliopoulou等人，2025年；Xu等人，2025年）。相比之下，当前模型将热暴露阶段与干预阶段分开，在热暴露结束后才开始使用BAPF。因此，这一设计支持了这样的观点：恢复期的最初几个小时是一个可测量的热处理后窗口期，在热暴露结束后6小时内可以检测到早期的血清和体温调节反应，而在第4天仍能检测到器官水平的残留损伤。在所有检测指标中，46至68毫克/千克·天的剂量范围内观察到了最一致的体内反应。这一剂量范围得到了包括组织病理学、血清损伤标志物、肝脏氧化还原指数和循环细胞因子在内的多个指标改善的支持，并且通过ICOMP的探索性4PL剂量反应分析进一步得到了验证。拟合模型得出的ED50约为36毫克/千克·天，而使用其他复合定义进行的敏感性分析也得出了类似的ED50估计值，这支持了剂量排序结果的可靠性。由于ICOMP是一项探索性研究且未进行加权处理，因此优先选择的剂量范围应被视为后续测试的参考范围，而不是确定的治疗剂量。

从机制上讲，当前的结果表明，在热暴露结束后，BAPF能够增强与NRF2相关的抗氧化防御机制。热暴露增加了与损伤相关的氧化应激和炎症信号，而BAPF则减少了ROS的积累，增加了DF-1细胞中NRF2的核内含量，并使肝脏和细胞的指标向更高的NRF2/HO-1和更低的NLRP3、切割的caspase-1、切割的caspase-3以及切割的GSDME信号方向变化。ML385减弱了BAPF引起的核内NRF2增加，并减轻了与损伤相关的蛋白质信号减少，这支持了NRF2在这种简化模型中的作用。尽管如此，由于ML385被用作预处理药物，且DF-1系统无法完全再现体内的吸收、代谢、组织微环境、程序性冷却和再加热动力学以及整个器官的恢复动态，这些发现应被视为支持该途径的证据，而不是证明NRF2激活单独导致了体内的器官保护。

本研究存在一些局限性。BAPF是一种多组分提取物，优先选择的剂量范围内的活性成分及其药代动力学基础仍有待明确。一些机制指标仅在选定的剂量或更小的剂量子集中进行了测量，而且分子数据中并未包括46毫克/千克·天的剂量；因此，这些分子数据应被视为支持该途径的证据，而不是完整的剂量反应机制。此外，DF-1模型无法完全再现体内的恢复药理学、组织相互作用或接近实际生产条件的重复热暴露情况。未来的研究应在重复的热应激或实际应用条件下测试优先选择的剂量范围，并使用正交实验方法进一步明确NRF2依赖性和焦亡相关的机制。

**资助**
本研究得到了中国国家自然科学基金[项目编号81872962]、山西省基础研究计划[项目编号202503021211078]以及山西省社会发展研究与发展项目[项目编号201903D321009]的支持。

**关于生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的使用声明**
在准备本稿件期间，作者使用了Gemini工具来提高手稿的语言表达和可读性。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对出版物的内容负全责。

**作者贡献声明**
王泽辉：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、方法学、研究、数据分析、数据管理。
李振宇：验证、方法学、研究、数据管理。
杜玉光：撰写——审阅与编辑、资源准备、方法学。
李凯：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目协调、方法学、资金获取、概念构思。