ReDisulphID：一种用于硫醇氧化还原传感器发现的平台鉴定出调节p53激活的可成药位点

《Redox Biology》：ReDisulphID: A discovery platform for thiol redox sensors identifies a druggable site regulating p53 activation

　　

蛋白质中的硫醇氧化还原传感器正在成为关键的治疗靶点，因为它们调控基本的信号通路，并为共价药物开发提供关键位点。它们功能的一个关键介质是氧化还原活性二硫键（redox-active disulphides）的存在，由于其诱导可逆蛋白质构象变化的能力，这些二硫键充当分子开关。然而，尽管它们在细胞调控和治疗相关性方面具有重要意义，迄今为止仅鉴定出有限数量的氧化还原活性二硫键。为了解决这个问题，研究人员开发了ReDisulphID，这是一个系统鉴定可成药氧化还原活性二硫键的结构生物信息学平台。利用该平台，研究人员在丙氨酰（或甘氨酰）-脯氨酸二肽酶（MLYCD）、转录因子IIB（TFIIB）和脯氨酰内肽酶（PEPD）中发现了新型可成药氧化还原传感器。对PEPD的功能分析表明，其氧化还原传感器可激活肿瘤抑制因子p53。此外，研究人员鉴定出一种通过直接修饰PEPD传感器中的硫醇来激活p53的化合物，证明了ReDisulphID在推进蛋白质氧化还原传感器发现和支助靶向硫醇药物开发方面的能力。

论文解读：ReDisulphID平台揭示调节p53激活的新型氧化还原传感器

研究背景与立项依据

硫醇氧化还原传感器是氧化还原信号传导的关键介质，能够使细胞检测氧化剂并将这些信号转化为特定的生物学反应。许多此类传感器依赖于氧化还原活性二硫键的形成，这些二硫键作为功能性开关，通过促进特定的结构构象来发挥作用，进而改变蛋白质活性、相互作用或亚细胞定位以调控下游信号通路。这类受氧化还原驱动的二硫键机制在血压调节、血管生成、自噬和DNA损伤反应等多种生理和病理过程中被日益认为是核心环节。反应性半胱氨酸硫醇作为氧化还原信号传导的中心，通过其与小分子亲电体的选择性反应能力，代表了极具潜力的治疗靶点。尽管共价药物相比非共价药物通常具有增强的效力、选择性和作用持续时间，且能够解决传统药物开发无法触及的约10-15%人类蛋白质组这一“不可成药”难题，但目前已知的具有可逆氧化还原调控功能的二硫键数量仍然相对较少，这限制了相关疗法的开发。因此，开发一种能够高通量预测并识别此类靶点的计算平台显得尤为迫切。本研究由伦敦国王学院的研究团队完成，成果发表于《Redox Biology》。

关键技术方法概述

研究人员首先通过分析RCSB蛋白质数据库（PDB）中的所有结构，筛选出距离小于10 ?的半胱氨酸对，并结合UniProt数据库信息进行去重和标准残基编号。利用PROPKA3引擎计算pKa值，并收集半球体暴露值（HSE）和配体性数据。基于此，开发了一个结合结构特征（如硫醇距离、溶剂可及性、pKa和晶体学B因子）的预测算法，生成“氧化还原评分”（Redox Score），构建了ReDisulphID平台前端。实验验证方面，采用非还原免疫印迹法检测过氧化氢（H₂O₂）处理后细胞内高分子量复合物的形成；通过定点诱变（C58A/C158A）验证关键半胱氨酸的功能；利用质谱分析重组蛋白的药物修饰情况；并在HT1080细胞中建立稳定细胞系，通过代谢组学和酶活性测定评估生理功能。

研究结果

1. 预测氧化还原调控二硫键形成的结构特征

研究人员筛选PDB发现近150万个半胱氨酸对，经UniProt序列比对去重后保留42,127对非冗余哺乳动物半胱氨酸对。通过比较已知氧化还原依赖性二硫键与阴性对照的结构参数，发现硫醇距离、最小pKa以及溶剂可及性指标（% buried和总HSE）在两组间存在显著差异。已知氧化还原调控二硫键的晶体结构B因子更高，表明其在晶体中存在结合与非结合形式的混合群体。结合这些结构特征生成的氧化还原评分，比单独使用任一参数更能有效指示半胱氨酸对形成氧化还原依赖性二硫键的可能性。

2. ReDisulphID能够发现药物可靶向的氧化还原调控二硫键

ReDisulphID数据库整合了所有候选半胱氨酸对及其氧化还原评分，并映射了化学蛋白质组学鉴定的配体性数据。分析显示，许多已鉴定的配体能够修饰具有高氧化还原评分的硫醇。尽管配体修饰的半胱氨酸对往往比不可修饰的对具有更低的氧化还原评分，但这可能是因为二硫键的形成限制了配体的结合。当排除结构中已形成二硫键的半胱氨酸后，距离与配体性之间的关系消失，证实了氧化还原状态对配体结合的影响。

3. ReDisulphID鉴定的新型氧化还原调控二硫键

研究人员选择了六个最高评分且具有配体注释的候选分子间半胱氨酸对进行验证，包括PEPD、MLYCD和TFIIB等。通过非还原免疫印迹分析发现，PEPD和MLYCD在H₂O₂处理后形成了可逆的、依赖氧化剂的更高分子量复合物，而TFIIB则表现为单体信号的氧化依赖性降低。Crk-L、BICD2和E-FABP则未显示出此类二硫键形成迹象。

4. PEPD包含一个调节p53激活的氧化还原调控分子间二硫键

进一步表征表明，PEPD中的二硫键依赖于ReDisulphID预测的C58和C158位点，任一突变均阻止了H₂O₂诱导的高分子量复合物形成。代谢组学和酶活性测定显示，二硫键形成并不影响PEPD的经典酶活性（即水解C端为脯氨酸的二肽）。然而，在HT1080细胞中，PEPD的氧化促进了p53 Ser15位点的磷酸化激活，而这种效应在C58A突变体中显著减弱，表明PEPD中的氧化还原二硫键参与了p53的激活过程。

5. CL33通过共价修饰PEPD中的C58激活p53

通过将化学蛋白质组学数据与ReDisulphID匹配，研究人员锁定了多个可能修饰C58的化合物。其中，CL33能够以一种依赖于PEPD C58的方式显著增加p53 pSer15的水平，而在C58A突变体细胞中这种激活作用显著降低。值得注意的是，CL33并未诱导PEPD分子间二硫键的形成，反而抑制了H₂O₂诱导的二硫键，质谱分析证实CL33直接加成了重组PEPD的C58位点。

结论与意义

本研究建立的ReDisulphID平台利用现有的结构和化学蛋白质组学数据，揭示了新型可成药氧化还原调控二硫键。该平台不仅丰富了氧化还原传感器的发现手段，还通过鉴定出PEPD中的一个新型氧化还原开关及其小分子调节剂CL33，展示了其在靶向药物发现中的应用潜力。这项工作为系统发现氧化还原信号传导的调节剂和推进相关疗法提供了重要资源。