USP45通过调节GPX4泛素化及稳定性抑制肺腺癌铁死亡

《Cancer Medicine》：Ubiquitin-Specific Protease 45 Inhibits Lung Adenocarcinoma Ferroptosis by Regulating Ubiquitination and Stability of Glutathione Peroxidase 4

　　

肺腺癌（Lung adenocarcinoma）是肺癌最常见的亚型，也是全球癌症相关死亡的主要原因。铁死亡（Ferroptosis）是一种以铁依赖性脂质过氧化（Iron-dependent lipid peroxidation）为特征的程序性细胞死亡形式，已成为肺腺癌治疗的一个极具前景的靶点。然而，调控铁死亡敏感性的分子机制仍不清楚。本研究通过系统筛选泛素特异性蛋白酶（Ubiquitin-Specific Proteases, USPs），鉴定出泛素特异性蛋白酶45（USP45）是肺腺癌细胞中铁死亡的关键抑制因子。生物信息学分析显示，USP45在GEO和TCGA数据库的肺腺癌患者数据集中显著上调，HPA数据库免疫组化结果进一步证实了这一发现。功能实验表明，敲低USP45使肺腺癌细胞对Erastin诱导的铁死亡敏感，导致细胞活力、集落形成、存活、迁移和侵袭能力受损；反之，过表达USP45则赋予细胞抵抗铁死亡应激的能力。机制上，USP45与谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4, GPX4）相互作用并去除其泛素链，从而稳定GPX4蛋白。在USP45缺陷细胞中，过表达GPX4可挽救铁死亡敏感性，而在USP45过表达细胞中敲低GPX4则消除了USP45的保护作用，确立了GPX4是USP45功能介导因子。总之，这些发现揭示了先前未知的USP45–GPX4信号轴，该轴促进了肺腺癌的铁死亡抵抗和肿瘤进展。

该研究题为《Ubiquitin-Specific Protease 45 Inhibits Lung Adenocarcinoma Ferroptosis by Regulating Ubiquitination and Stability of Glutathione Peroxidase 4》，发表于《Cancer Medicine》。研究旨在阐明肺腺癌（Lung adenocarcinoma）中铁死亡（Ferroptosis）调控的新机制。肺腺癌作为非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）的主要亚型，预后不佳，而铁死亡作为一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，其分子机制在肺腺癌中尚不完全清楚。尽管已知泛素特异性蛋白酶（Ubiquitin-Specific Proteases, USPs）参与多种生物学过程，且谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4, GPX4）是铁死亡的核心抑制因子，但USP家族成员是否通过调控GPX4的稳定性来影响肺腺癌铁死亡，此前尚未明确。

为探究这一问题，研究人员首先通过双荧光素酶报告基因实验（Dual-Luciferase Reporter Assay）筛选了40种USP家族成员对GPX4表达的影响。结合生物信息学分析，利用GEO和TCGA数据库及HPA数据库评估了USP45在临床样本中的表达及预后相关性。随后，研究人员构建了稳转细胞系，利用CCK-8、集落形成、Transwell及流式细胞术（Flow Cytometry）检测细胞活力、增殖、迁移及凋亡表型。通过丙二醛（Malondialdehyde, MDA）、谷胱甘肽（Glutathione, GSH）、Fe²⁺水平测定及活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）染色评估铁死亡生化指标。最后，采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）、泛素化（Ubiquitination）检测及放线菌酮（Cycloheximide, CHX）追踪实验阐明分子机制，并通过回复实验验证上下游关系。

研究结果显示：

在“USP家族成员调控GPX4表达的筛选”中，研究人员在293T细胞中进行筛选，发现USP45、USP20和USP33能显著提高GPX4-NanoLuc活性，其中USP45对GPX4蛋白表达的提升作用最强。

在“USP45在肺腺癌中高表达且与不良预后相关”部分，通过分析GEO、TCGA数据集及HPA数据库免疫组化数据，证实USP45在肺腺癌组织中显著高表达，且高表达与患者总生存期缩短显著相关。

在“USP45促进Erastin处理的肺腺癌细胞恶性表型”实验中，研究人员选取A549（高表达）和HCC827（低表达）细胞系，发现敲低USP45增强了Erastin诱导的A549细胞活力下降、G0/G1期阻滞、凋亡增加及迁移侵袭能力减弱；反之，过表达USP45则逆转了Erastin对HCC827细胞的上述抑制作用。

在“USP45抑制Erastin处理的肺腺癌细胞铁死亡”分析中，生化检测表明USP45缺失导致MDA、Fe²⁺、氧化型谷胱甘肽（GSSG）水平升高及GSH耗竭，ROS水平上升，同时Western blot显示铁死亡标志物ACSL4和COX2上调，FTH1下调；而USP45过表达则呈现相反趋势。

在“USP45去泛素化GPX4并增强其稳定性”机制研究中，Co-IP证实USP45与GPX4存在物理相互作用。泛素化实验显示USP45敲低增加了GPX4的泛素化水平，而过表达则减少了泛素化。CHX追踪实验进一步证明USP45通过抑制GPX4的泛素化降解来延长其蛋白半衰期。

在“GPX4介导USP45在肺腺癌细胞中的抗铁死亡作用”回复实验中，在USP45缺陷的A549细胞中过表达GPX4，或在USP45过表达的HCC827细胞中敲低GPX4，均能逆转由USP45引起的细胞表型及铁死亡标志物的变化，确证GPX4是USP45下游的功能执行者。

讨论部分总结指出，本研究首次鉴定了USP45是肺腺癌中铁死亡的关键抑制因子。研究表明，USP45通过与GPX4相互作用并去除其泛素链，显著增强了GPX4蛋白的稳定性，从而抑制脂质过氧化和铁死亡，促进肿瘤恶性进展。尽管USP45在其他癌症类型中功能各异，但在肺腺癌中表现为促癌作用。研究也存在一定局限性，如USP45与GPX4相互作用的具体结构域尚未解析，且仅限于体外细胞模型验证。未来的研究需在类器官或异种移植瘤模型中进一步验证该轴线的生理相关性。

结论部分强调，研究人员发现了USP45–GPX4信号轴在肺腺癌铁死亡抵抗中的关键作用，这为克服肺癌治疗中的铁死亡抵抗提供了新的潜在治疗靶点。