《Signal Transduction and Targeted Therapy》：BMAL1 regulates circadian rhythms via phase separation–mediated transcriptional hub formation
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核心时钟组件如何在空间上组织以确保哺乳动物稳健振荡的机制尚不清楚。在此，研究人员确定正链因子BMAL1是一种相分离（phase-separating）蛋白，其形成的动态生物分子凝聚体（biomolecular condensates）对于昼夜节律转录和行为至关
核心时钟组件如何在空间上组织以确保哺乳动物稳健振荡的机制尚不清楚。在此，研究人员确定正链因子BMAL1是一种相分离（phase-separating）蛋白，其形成的动态生物分子凝聚体（biomolecular condensates）对于昼夜节律转录和行为至关重要。内源性BMAL1形成与昼夜周期同步振荡的核斑点（nuclear puncta）。缺失分析和光遗传学聚类（optogenetic clustering）确定了一个N端90个氨基酸的内在无序区（intrinsically disordered region, IDR），其磷酸化状态调节BMAL1的相分离。此外，BMAL1凝聚体表现为多分子组装体，可选择性招募CLOCK、p300、MED1，并特异性地被E-box DNA促进。在功能上，IDR缺失的BMAL1突变体无法挽救Bmal1?KO细胞中的节律性转录，也无法在重新引入SCN特异性Bmal1?KO小鼠时恢复运动节律。这些发现确立了BMAL1凝聚体作为动态转录枢纽的作用，将相分离与细胞和体内昼夜节律耦合起来。
论文解读：BMAL1相分离介导的转录枢纽调控昼夜节律机制
研究背景与立项依据
哺乳动物的昼夜节律由转录-翻译反馈环（transcription-translation feedback loops, TTFLs）驱动，其核心是正链因子BMAL1?CLOCK异二聚体与负链因子PER?CRY之间的相互作用。然而，现有研究揭示了一个关键的时间滞后现象：BMAL1?CLOCK异二聚体的基因组占据峰值（约ZT6）与其下游靶标的转录活性峰值（ZT12?ZT2）之间存在显著延迟，且BMAL1的DNA结合与其功能并不完全耦合。同时，尽管REV?ERBα等时钟蛋白已被证实可通过内在无序区（IDR）发生液?液相分离（LLPS），但关于时钟蛋白是否在生理条件下形成相分离凝聚体及其功能必要性仍存在争议。为了解析这一时空解耦机制，研究人员开展了此项研究，相关成果发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
关键技术方法
本研究综合运用了多种前沿技术。在细胞与动物模型方面，使用了U2OS细胞系及Bmal1?KO细胞，以及SCN特异性Bmal1?KO小鼠和AAV9病毒介导的立体定位注射技术。在生化与成像层面，采用了体外相分离实验、荧光漂白恢复（FRAP）、光遗传学聚类（optoDroplet）及超分辨率显微镜（SIM）观察。在组学分析方面，结合了染色质免疫共沉淀测序（ChIP?seq）与RNA测序（RNA?seq），并利用Click?iT EU系统监测新生RNA合成，辅以wheel?running行为学分析与开放场实验评估生理表型。
研究结果
BMAL1形成动态生理昼夜凝聚体
研究人员首先观察到内源性BMAL1在肝脏和视交叉上核（SCN）中形成斑点状结构，其丰度随昼夜周期振荡，且与整体蛋白水平波动无关。在U2OS细胞中，过表达的eGFP?BMAL1仅在ZT22至ZT6期间组装成液滴，表现出典型的LLPS特征，包括荧光漂白恢复（FRAP）、分裂融合动力学以及对1,6?己二醇（1,6?HD）的敏感性。PONDR分析预测BMAL1含有三个主要的IDR区域。
磷酸化和IDR扰动调节BMAL1凝聚体形成
体外实验表明，全长BMAL1蛋白在特定盐浓度下可发生LLPS。通过构建截短突变体发现，删除N端90个氨基酸（ΔN90）完全破坏了液滴的形成，而其他IDR区域的缺失仅改变了液滴形态。光遗传学实验进一步证实N90片段是蓝光诱导聚类的关键。此外，λ?蛋白磷酸酶（λ?PPase）处理可将BMAL1液滴转化为不溶性聚集体，而S78位点的磷酸化模拟突变（S78D）抑制了凝聚，表明N90 IDR的磷酸化状态精细调节着BMAL1的相行为。
振荡的BMAL1选择性招募转录机器和E?box元件
热力学分析显示，随着BMAL1表达量的增加，稀释相浓度显著上升，表明其为多组分凝聚体而非二元系统。免疫荧光与共定位分析显示，BMAL1凝聚体能选择性地招募其异二聚体伴侣CLOCK、组蛋白乙酰转移酶p300及中介体复合物MED1，而RNA聚合酶II（RNAPII）及其磷酸化形式则环绕在凝聚体周围。体外实验证实CLOCK和MED1蛋白能有效分相进入BMAL1凝聚体，且Cy3标记的E?box DNA寡核苷酸能以剂量依赖性方式促进BMAL1的相分离。
IDR介导的BMAL1凝聚体控制昼夜基因转录
在Bmal1?KO U2OS细胞中，野生型BMAL1的回补恢复了核心时钟基因（如NR1D1、PER2）的mRNA振荡及组蛋白H3K27ac的节律性富集。相比之下，ΔN90突变体未能挽救这些振荡，其表观遗传图谱与KO细胞相似，表现为核体相关GO条目的丧失及DNA修复等基本细胞维持过程的富集，揭示了凝聚体在维持转录节律性中的必要性。
BMAL1凝聚体调控细胞的昼夜节律
通过EU标记监测新生RNA合成发现，对照组表现出强烈的昼夜振荡，而Bmal1?KO细胞则显著减弱。野生型BMAL1能恢复这种振荡，但ΔN90突变体则表现出持续低下的非节律性转录活性，证实了BMAL1凝聚体是细胞内转录节律的驱动力。
BMAL1凝聚体调控小鼠的昼夜节律
在SCN特异性Bmal1?KO小鼠模型中，野生型BMAL1的回补几乎完全恢复了正常的运动节律，其周期长度约为23.6小时，频谱模式与对照组高度一致。相反，ΔN90突变体未能挽救行为缺陷，表现为周期延长（>24小时）、振幅减弱及FFT分析中多个小峰的出现，表明中枢起搏器的功能严重受损。
讨论与结论
该研究确立了BMAL1作为先驱转录因子，通过N端IDR的相分离形成多组分转录枢纽，从而协调昼夜节律的分子机制。研究表明，BMAL1凝聚体的形成能力直接影响机体的代谢稳态，SCN中BMAL1凝聚体的破坏导致小鼠体重增加。这一发现将相分离原理延伸至哺乳动物昼夜时钟的正负反馈回路，提示通过调控环境因子或设计“LLPS?philic”药物干预病理凝聚体，可能为治疗节律相关疾病提供新的策略。
