利用产电底物进行凝血酶活性的电化学检测：迈向快速凝血监测

《ChemElectroChem》：Electrochemical Detection of Thrombin Activity Using an Electrogenic Substrate: Toward Rapid Coagulation Monitoring

　　摘要

监测血液凝固对于评估出血和心脏疾病至关重要。多种用于凝血分析的生物分析技术都是基于测量关键酶——凝血酶的活性。电化学分析仪的最新进展使得小型化系统能够快速分析凝血酶活性，但一个主要挑战是缺乏普遍可用的产电底物。本研究提出了一种概念验证的电化学生物传感器，使用广泛可用的肽基底物实现连续凝血酶监测。该测量系统由一个丝网印刷的金电极和底物Phe-Pip-Arg-para-nitroanilide组成，凝血酶会切割该底物释放出para-nitroaniline（pNA）。我们开发了一种方波伏安法技术，在仅100微升的样品体积下，能在几秒钟内测量释放的pNA的氧化电流，检测限为0.24纳摩尔。所开发的检测方法与自组装单层（SAM）功能化电极兼容，这类电极在生物传感器研究中需求很高，例如基于适配体的传感器。我们发现凝血酶在金电极上仍能保持其活性，甚至在用巯基己醇处理过的抗生物污染电极上也是如此。我们的酶放大方法可以集成到凝血分析仪和凝血酶生成检测中，同时有助于更好地理解蛋白质活性和SAM上的生物污染现象。

测量凝血酶活性提供了关于凝血健康状况的关键信息。我们开发了一种伏安法技术，可以在丝网印刷的金电极上快速监测凝血酶活性。凝血酶选择性地切割para-nitroaniline（pNA）与三肽底物之间的键。通过测量pNA的氧化电流来电化学监测其切割过程。

1 引言

血液凝固是一个极其复杂且动态的生理过程。凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，在凝血级联反应中起着核心作用。凝血酶是一系列凝血因子中的最后一个，这些因子通过其酶原（失活形式）的蛋白水解依次被激活。丝氨酸蛋白酶在结合口袋附近含有一个Ser–His–Asp催化三联体，这影响了酶的底物特异性。凝血酶的催化三联体是S195、H57和Asp102，它们能够酶促切割肽键并将可溶性纤维蛋白原转化为不可溶性纤维蛋白[1]。尽管这些氨基酸在蛋白质序列上相距较远，但由于蛋白质折叠，它们在酶的内部会非常接近。丝氨酸蛋白酶的催化机制涉及多种分子事件，如酸碱催化、共价催化、邻近性和取向效应、静电催化以及氧阴离子孔中的优先过渡态结合[2]。凝血酶活性失调与多种病理情况相关，从出血性疾病到血栓形成，以及心脏、肺、肝脏等器官中的疾病相关蛋白水解[3]。因此，具有高特异性和灵敏度的酶活性检测方法对于准确诊断和治疗凝血障碍至关重要[4]。凝血酶在临床实验室、手术室、即时检测（POC）平台和生物制药生产设施中经常被检测和使用[5]。通常不使用独立的“凝血酶传感器”来测量凝血酶，而是使用诸如凝血酶原时间/国际标准化比率（PT/INR）、活化 clotting 时间（ACT）和凝血酶生成检测（TGA）等测试来诊断各种凝血障碍[5]。这些检测方法的应用范围广泛，包括抗凝治疗监测、心血管疾病诊断、药品质量控制以及凝血障碍筛查[6]。目前，分析凝血酶的标准方法主要基于两种方法：纤维蛋白原添加凝固时间检测和显色底物切割的光谱分析[7]。在显色底物中，H-D-Phe-Pip-Arg-pNA（S2238）是一种特征明确且被广泛接受的药物标准[8]。然而，复杂的光学仪器和劳动密集型的分析限制了上述方法在POC诊断设置中的可用性和可扩展性。同时，光度方法通常需要清澈的样品基质，因为浑浊会干扰色素的检测[9]。生物分析设备发展的最新趋势强调向用户友好、快速、简单和经济的POC平台转变[10]。特别是，电化学检测技术已被集成到POC生物传感器中，以提供快速的诊断结果和治疗药物监测[10]。事实上，主要的生物制药公司已经开发了用于抗凝治疗监测的生物分析设备。例如，罗氏公司的CoaguChek设备使用了一种安培检测方法，该方法使用底物Tos-Gly-Pro-Arg-4-氨基-2-氯酚醋酸盐（Pentapharm；美国专利6,495,336）[6, 9]。这种底物包含一个中心三肽（Gly-Pro-Arg）、N端的甲苯磺酰保护基团和C端的电活性离去基团（2-氯酚或ACP），在0.3伏特下相对于Ag/AgCl被氧化以产生可测量的电流[9]。在科学文献中，提出了许多电化学检测策略来监测凝血酶活性，如铁烯标记的肽[7]、敏感的产电底物[11]和优化的电化学检测方法[12]。例如，早期的一项电化学TGA研究使用了钯传感器条上的Tos-Gly-Pro-Arg-ACP产电底物[9]。一旦血浆样品湿润了修饰过的电极，凝血酶就会切割预干燥的底物，从而产生具有约0.3伏特氧化还原活性的ACP[9]。最近，一种使用ITO电极和嵌入了Val-Pro-Arg-AN、葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的冻干滤纸的计时电流生物传感器通过4-氨基-1-萘酚的氧化还原循环实现了凝血酶的检测[11]。在0伏特下的测量显示了100皮克/毫升到10微克/毫升的线性范围。尽管没有评估酶动力学和交叉反应性。Mruthunjaya等人设计了一种一次性传感器，使用共面的金电极通过凝血酶切割Tos-Gly-Pro-Arg-ACP来监测达比加群[13]。在稀释的血浆中，当凝血酶浓度为0.22微摩尔和底物浓度为0.3毫摩尔时，检测到了ACP，传感器的检测限为9.6纳克/毫升，定量范围为11.5-140纳克/毫升，并且在生理pH值下提供了快速的结果（<20秒）。将氧化还原标记的凝血酶底物附着在电极上是另一种有效的测量凝血酶切割活性的方法[7]。例如，通过将底物的一端用硫醇键化学吸附在金电极上，另一端用铁烯氧化还原标签修饰，从而将凝血酶底物附着在金电极上。在凝血酶存在下，铁烯标签从底物上释放出来，并被洗掉，从而显示出氧化还原电流的减少，检测限（LOD）为81.1微摩尔/毫升。然而，现有的电化学凝血酶生物传感器依赖于底物，这些底物存在主要限制。它们没有商业可用性，水溶性差，受到知识产权保护的约束，或者缺乏可扩展的合成路线和全面的动力学表征。虽然解决所有与凝血酶生物传感相关的挑战超出了本研究的范围，但我们的目标是提供一种概念验证的电化学凝血酶生物传感器，以解决上述限制。在这项工作中，我们提出了一种使用标准底物S2238的替代电化学检测策略。据我们所知，S2238底物被凝血酶切割的机制仅通过光谱方法进行了研究，其电化学行为尚未被探索。我们证明了凝血酶能快速切割Arg残基上的para-nitroaniline（pNA），释放的pNA会发生可逆的氧化还原反应。我们在丝网印刷的金电极（金SPE）上使用方波伏安法（SWV）监测了切割pNA的氧化电流，总样品体积仅为100微升。酶促反应在室温下迅速发生，15秒内就能检测到信号。这种电化学方法消除了凝血时间检测中对视觉终点的需求，同时简化了检测过程，无需笨重的光学设备，减少了样品处理时间，并提供了高灵敏度（0.027微摩尔/毫升的LOD）。我们设想这种开发的生物传感器在快速评估生物制药产品中的凝血酶活性以及集成到TGA、PT/INR和ACT检测中用于抗凝治疗监测方面有重要应用。

2 结果与讨论

2.1 电化学凝血酶检测机制原理

在图1中，我们展示了我们开发的凝血酶检测生物传感器的原理。这项工作旨在使用商业上可获得、价格合理且标准的生物试剂，以及POC电化学装置，来展示可扩展性和标准操作。因此，我们使用了金SPE（每条电极约7加元）作为传感器平台，因为它具有成熟的表面化学性质，并且可以通过USB或蓝牙与便携式电位计兼容，适合POC部署。我们使用了标准化的凝血酶显色底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA（S2238），它在Arg–nitroanilide键处被切割以释放pNA（图1A）。pNA在?0.8伏特下通过电化学还原，在0.1伏特下通过电化学氧化在nitro基团处发生可逆的氧化还原反应（图1B）。在药品协议中通常使用分光光度计测量pNA的吸光度，但其电化学行为受到的关注有限。为了解决这个问题，我们开发了一种SWV协议来连续监测S2238中pNA的切割（见图1C中的示意图）。在我们开发的SWV协议中，释放的pNA首先在?0.8伏特下被还原为羟胺，然后在约0.12伏特下相对于Ag/AgCl被氧化为para-nitrosoaniline。在反应的前15秒内就能检测到氧化信号，60秒内观察到最大反应速率（图1D）。通过增加凝血酶浓度，酶促切割速度加快，这从反应速率的陡峭斜率和更大的总电流峰值中可以看出（图1E）。

2.2 pNA和凝血酶底物的氧化还原反应

本研究的生物传感机制基于从凝血酶底物中释放的pNA的氧化还原性质。图2A显示了在脱气电解质中使用三电极配置的玻璃碳电极上0.2毫摩尔pNA的CV，以了解其基本的氧化还原行为。先前的研究表明，?0.8伏特处的还原峰对应于pNA向para-(hydroxyamino)aniline的四电子还原[14]。0.1伏特处的氧化对应于para-(hydroxyamino)aniline向para-nitrosoaniline的两电子氧化，而?0.2伏特处的还原峰是其对应反应[14]。首先，我们通过在不脱气溶液中对金SPE进行测量来研究溶解氧的影响。电极首先经过电化学抛光处理以获得电化学表面性质（见支持信息中的方法部分，第1.2节。金SPE的扫描电子显微镜分析显示，微米级的金颗粒嵌入在粘合剂中。同时，通过在0.5 M H2SO4中电抛光电极，计算出表面粗糙度为2.97，基于先前建立的协议计算出电活性表面积为0.21平方厘米[15]。我们在不含pNA的空白溶液中观察到非脱气溶液的ORR约为?0.7伏特，这接近pNA的还原（Red I），如图2B所示。这可能会干扰pNA的电化学分析。因此，尽管可以使用nitro基团向羟胺的还原电流来分析pNA，但在非脱气溶液中的这种副反应会带来限制。我们还观察到，长时间施加这种负电位（≥10秒）会导致信号不可重复和金SPE表面明显变暗。这一限制在电化学生物传感的更广泛目标背景下非常重要。例如，为了评估直接吸附在金电极上的凝血酶活性或评估开发的酶传感器与自组装单层（SAM）修饰金表面的兼容性，需要一个更可重复的机制。

2.2 pNA和凝血酶底物的氧化还原反应

本研究的生物传感机制基于从凝血酶底物中释放的pNA的氧化还原性质。图2A显示了在脱气电解质中使用三电极配置的玻璃碳电极上0.2毫摩尔pNA的CV，以了解其基本的氧化还原行为。先前的研究表明，?0.8伏特处的还原峰对应于pNA向para-(hydroxyamino)aniline的四电子还原[14]。0.1伏特处的氧化对应于para-(hydroxyamino)aniline向para-nitrosoaniline的两电子氧化，而?0.2伏特处的还原峰是其对应反应[14]。首先，我们通过在金SPE上进行未脱气溶液的测量来研究溶解氧的影响。电极首先经过电化学抛光处理以获得电化学表面性质（见支持信息中的方法部分，第1.2节。金SPE的扫描电子显微镜分析显示，微米级的金颗粒嵌入在粘合剂中。同时，通过在0.5 M H2SO4中电抛光电极，计算出表面粗糙度为2.97，电活性表面积为0.21平方厘米[15]。我们在不含pNA的空白溶液中观察到ORR约为?0.7伏特，这接近pNA的还原（Red I），如图2B所示。这可能会干扰pNA的电化学分析。因此，即使可以使用nitro基团向羟胺的还原电流来分析pNA，但在非脱气溶液中的这种副反应也会带来限制。我们还观察到，长时间施加这种负电位（≥10秒）会导致信号不可重复和金SPE表面明显变暗。这一限制在电化学生物传感的更广泛目标背景下非常重要。例如，为了评估直接吸附在金电极上的凝血酶活性或评估开发的酶传感器与自组装单层（SAM）修饰金表面的兼容性，需要一个更可重复的机制。综上所述，虽然pNA的四电子还原可以产生相对较高的电流，但在这些条件下电极表面的不稳定性以及氧化还原反应（ORR）的干扰使得我们选择评估pNA的氧化峰而不是其还原峰。在确定了传感机制后，我们接下来分析了凝血酶对S2238底物的酶促切割作用。凝血酶切割S2238底物释放出具有上述氧化还原特性的pNA（反应示意图见图2C）。图2D展示了100 μM基于肽的底物与112 U/mL凝血酶混合后的循环伏安（CV）曲线，以及50 μM人血清白蛋白（HSA）作为对照组的曲线。在室温下与凝血酶孵育5分钟后，观察到还原峰和氧化峰都比对照组更高。这种增加表明凝血酶从Arg氨基酸处切割了pNA。在确认凝血酶对pNA的切割作用后，我们开发了一种扫描伏安（SWV）方法来研究还原型pNA与其氧化形式（亚硝基苯胺）之间的氧化还原转化。SWV方法首先在-0.8 V的还原电位下进行1秒的处理，以选择性地将硝基转化为羟氨基形式。然后通过从-0.2 V扫描到0.4 V的电位，使羟氨基形式氧化为亚硝基（见图2D）。我们观察到，在-0.8 V的预处理电位下进行的连续扫描具有可重复性，重复五次实验的相对标准偏差（RSD）为10%（使用112 U/mL凝血酶和100 μM S2238）（见图2E）。总之，所开发的SWV方法通过首先将pNA的硝基电化学还原为羟氨基形式，然后监测0.12 V处的氧化峰电流，实现了对凝血酶切割pNA的连续监测。这种方法能够提供一致且准确的信号，且不受ORR的干扰，同时避免了金纳米颗粒萃取（SPE）的损伤。

2.3 化学吸附在金表面的凝血酶的活性

凝血酶是一种α/β异二聚体，由36个氨基酸的A链和259个氨基酸的B链组成，两者通过Cys1和Cys122之间的二硫键连接，此外还有三个链内的二硫键[1]。硫醇化分子和二硫键通过Au–S键的形成化学吸附在金表面，形成稳定的单层[16]。使用裸露的金纳米颗粒萃取（SPE）和经过MCH改性的金纳米颗粒萃取，分别评估了凝血酶在金表面的酶活性（见图3A和图3B）。为了实验验证这种吸附行为，我们使用电化学阻抗谱（EIS）技术监测了铁氰化物溶液中的电荷转移电阻（Rct）的变化。图3C显示，裸露的金电极的初始Rct约为0.7 kΩ。在与112 U/mL（1 μM）凝血酶孵育30分钟后，Rct显著增加到3.9 kΩ，因为吸附的凝血酶阻碍了氧化还原探针与金电极之间的电子转移[17]。使用HSA作为非特异性蛋白质进行的对照实验显示Rct变化较小，为2.1 kΩ。通过相对吸附方程计算，吸附的凝血酶使Rct增加了约630%，表明凝血酶与金电极有强烈的结合。为了减少非特异性吸附和生物污染，我们接下来用MCH改性了金纳米颗粒萃取表面以减少蛋白质污染。MCH是一种有效的烷硫醇，已被证明可以显著减少生物污染[18]。为了验证MCH减少生物污染的能力，我们在20°C的湿度室内将金纳米颗粒萃取在1 mM MCH的水中改性1小时。尽管凝血酶和其他蛋白质含有硫醇和二硫键，但MCH使金表面饱和，显著超过了其他硫醇化生物分子。如图3D中的重叠奈奎斯特图所示，MCH改性的电极使凝血酶和白蛋白的相对吸附降低到2%以下。接下来，我们使用底物S2238和我们开发的SWV协议检查了吸附的凝血酶是否保留了酶活性。有趣的是，固定在裸露金纳米颗粒萃取上的凝血酶在30分钟孵育后仍保持了其切割活性，并产生了约0.25 μA的氧化电流（见图3E）。尽管由于非特异性吸附导致的Rct变化很小，我们仍然检测了MCH饱和表面上是否还有残留的凝血酶。因此，将1 mM MCH改性的金电极与112 U/mL（1 μM）凝血酶孵育30分钟。如前所述，无论是凝血酶还是HSA，Rct都没有显著变化。然而，酶测定显示MCH改性的电极的氧化电流为0.11 μA，而裸露金纳米颗粒萃取的氧化电流为0.25 μA。因此，少量的酶活性凝血酶仍然在MCH改性的表面上保持活性。从微量表面结合的蛋白质中观察到酶活性，扩展了我们协议的应用范围，以评估防污策略的有效性。

2.4 凝血酶适配体的酶促放大

一种广泛研究的检测和测量凝血酶浓度的方法是基于测量凝血酶与高选择性寡聚体或凝血酶结合适配体的结合。在电化学凝血酶适配体传感器中，固定化的适配体与凝血酶之间的结合事件导致界面电荷转移的变化，通过EIS技术进行测量[19]。我们试图确定我们开发的酶促SWV协议是否可以作为一种强大的放大方法，用于无标记的适配体传感。传统的无标记阻抗适配体传感器往往缺乏检测低浓度蛋白质目标（如凝血酶）的灵敏度，这是由于密集排列的适配体单层造成的空间阻碍和静电屏障[20]。接下来实验的目的是评估所开发的SWV协议是否可以增强凝血酶检测的灵敏度，与传统的法拉第和非法拉第EIS技术相比。简而言之，从EIS分析获得的奈奎斯特图通过Randles电路进行建模，以计算铁氰化物氧化还原对的电荷转移电阻（Rct）。由于适配体单层会阻碍电荷氧化还原对从电极的电子转移，因此在适配体固定后Rct增加[19]。这与适配体的负电荷磷酸骨架与氧化还原对之间的静电排斥以及密集排列的SAMs造成的氧化还原对从体相溶液向电极表面的扩散障碍有关[21]。此外，凝血酶孵育后Rct显著增加，因为疏水且体积较大的蛋白质层干扰了电极与氧化还原对之间的电子转移[22]。凝血酶浓度与Rct之间的线性关系可以用作量化凝血酶浓度的信号，我们采用了这个模型作为概念验证的适配体传感平台。通过图4A中的示意图进一步说明了固定在金纳米颗粒萃取上的适配体的传感机制。如图4A所示，系统在没有凝血酶的情况下从基线氧化还原活性开始，随着凝血酶的结合电子转移受阻，最终在凝血酶和底物存在下发生S2238底物的酶促切割并释放pNA（见图4B）。

2.4 凝血酶适配体的酶促放大

一种广泛研究的检测和测量凝血酶浓度的方法是基于测量凝血酶与高选择性寡聚体或凝血酶结合适配体的结合。在电化学凝血酶适配体传感器中，固定化的适配体与凝血酶之间的结合事件导致界面电荷转移的变化，通过EIS技术进行测量[19]。我们试图确定我们开发的酶促SWV协议是否可以作为一种强大的放大方法，用于无标记的适配体传感。传统的无标记阻抗适配体传感器通常缺乏检测低浓度蛋白质目标（如凝血酶）的灵敏度，这是由于密集排列的适配体单层造成的空间阻碍和静电屏障[20]。接下来实验的目的是评估所开发的SWV协议是否可以增强凝血酶检测的灵敏度，与传统的法拉第和非法拉第EIS技术相比。简而言之，从EIS分析获得的奈奎斯特图通过Randles电路进行建模，以计算铁氰化物氧化还原对的电荷转移电阻（Rct）。由于适配体单层会阻碍电荷氧化还原对从电极的电子转移，因此在适配体固定后Rct增加[19]。这与适配体的负电荷磷酸骨架与氧化还原对之间的静电排斥以及密集排列的SAMs造成的氧化还原对从体相溶液向电极表面的扩散障碍有关[21]。此外，凝血酶孵育后Rct显著增加，因为疏水且体积较大的蛋白质层干扰了电极与氧化还原对之间的电子转移[22]。凝血酶浓度与Rct之间的线性关系可以用作量化凝血酶浓度的信号，我们采用了这个模型作为概念验证的适配体传感平台。基于适配体的传感机制通过固定在金纳米颗粒萃取上的适配体的示意图进一步说明。如图4A所示，系统在没有凝血酶的情况下从基线氧化还原活性开始，随着凝血酶的结合电子转移受阻，最终在凝血酶和底物存在下发生S2238底物的酶促切割并释放pNA（见图4B）。

2.4 凝血酶适配体的酶促放大

一种广泛研究的检测和测量凝血酶浓度的方法是基于测量凝血酶与特定序列的高选择性寡聚体或凝血酶结合适配体的结合。在电化学凝血酶适配体传感器中，固定化的适配体与凝血酶之间的结合事件导致界面电荷转移的变化，通过EIS技术进行测量[19]。我们试图确定我们开发的酶促SWV协议是否可以作为一种强大的放大方法，用于无标记的适配体传感。传统的无标记阻抗适配体传感器通常缺乏检测低浓度蛋白质目标（如凝血酶）的灵敏度，这是由于密集排列的适配体单层造成的空间阻碍和静电屏障[20]。接下来实验的目的是评估所开发的SWV协议是否可以增强凝血酶检测的灵敏度，与传统的法拉第和非法拉第EIS技术相比。简而言之，从EIS分析获得的奈奎斯特图通过Randles电路进行建模，以计算铁氰化物氧化还原对的电荷转移电阻（Rct）。由于适配体单层会阻碍电荷氧化还原对从电极的电子转移，因此在适配体固定后Rct增加[19]。这与适配体的负电荷磷酸骨架与氧化还原对之间的静电排斥以及密集排列的SAMs造成的氧化还原对从体相溶液向电极表面的扩散障碍有关[21]。此外，凝血酶孵育后Rct显著增加，因为疏水且体积较大的蛋白质层干扰了电极与氧化还原对之间的电子转移[22]。凝血酶浓度与Rct之间的线性关系可以用作量化凝血酶浓度的信号，我们采用了这个模型作为概念验证的适配体传感平台。基于适配体的传感机制通过固定在金纳米颗粒萃取上的适配体的示意图进一步说明。如图4A所示，系统在没有凝血酶的情况下从基线氧化还原活性开始，随着凝血酶的结合电子转移受阻，最终在凝血酶和底物存在下发生S2238底物的酶促切割并释放pNA（见图4B）。

2.4 凝血酶适配体的酶促放大

一种广泛研究的检测和测量凝血酶浓度的方法是基于测量凝血酶与高选择性寡聚体或凝血酶结合适配体的结合。在电化学凝血酶适配体传感器中，固定化的适配体与凝血酶之间的结合事件导致界面电荷转移的变化，通过EIS技术进行测量[19]。我们试图确定我们开发的酶促SWV协议是否可以作为一种强大的放大方法，用于无标记的适配体传感。传统的无标记阻抗适配体传感器往往缺乏检测低浓度蛋白质目标（如凝血酶）的灵敏度，这是由于密集排列的适配体单层造成的空间阻碍和静电屏障[20]。接下来实验的目的是评估所开发的SWV协议是否可以增强凝血酶检测的灵敏度，与传统的法拉第和非法拉第EIS技术相比。简而言之，从EIS分析获得的奈奎斯特图通过Randles电路进行建模，以计算铁氰化物氧化还原对的电荷转移电阻（Rct）。由于适配体单层会阻碍电荷氧化还原对从电极的电子转移，因此在适配体固定后Rct增加[19]。这与适配体的负电荷磷酸骨架与氧化还原对之间的静电排斥以及密集排列的SAMs造成的氧化还原对从体相溶液向电极表面的扩散障碍有关[21]。此外，凝血酶孵育后Rct显著增加，因为疏水且体积较大的蛋白质层干扰了电极与氧化还原对之间的电子转移[22]。凝血酶浓度与Rct之间的线性关系可以用作量化凝血酶浓度的信号，我们采用了这个模型作为概念验证的适配体传感平台。通过固定在金纳米颗粒萃取上的适配体的示意图进一步说明。如图4A所示，系统在没有凝血酶的情况下从基线氧化还原活性开始，随着凝血酶的结合电子转移受阻，最终在凝血酶和底物存在下发生S2238底物的酶促切割并释放pNA（见图4B）。

2.4 凝血酶适配体的酶促放大

一种广泛研究的检测和测量凝血酶浓度的方法是基于测量凝血酶与高选择性寡聚体或凝血酶结合适配体的结合。在电化学凝血酶适配体传感器中，固定化的适配体与凝血酶之间的结合事件导致界面电荷转移的变化，通过EIS技术进行测量[19]。我们试图确定我们开发的酶促SWV协议是否可以作为一种强大的放大方法，用于无标记的适配体传感。传统的无标记阻抗适配体传感器往往缺乏检测低浓度蛋白质目标（如凝血酶）的灵敏度，这是由于密集排列的适配体单层造成的空间阻碍和静电屏障[20]。接下来实验的目的是评估所开发的SWV协议是否可以增强凝血酶检测的灵敏度，与传统的法拉第和非法拉第EIS技术相比。简而言之，从EIS分析获得的奈奎斯特图通过Randles电路进行建模，以计算铁氰化物氧化还原对的电荷转移电阻（Rct）。由于适配体单层会阻碍电荷氧化还原对从电极的电子转移，因此在适配体固定后Rct增加[19]。这与适配体的负电荷磷酸骨架与氧化还原对之间的静电排斥以及密集排列的SAMs造成的氧化还原对从体相溶液向电极表面的扩散障碍有关[21]。此外，凝血酶孵育后Rct显著增加，因为疏水且体积较大的蛋白质层干扰了电极与氧化还原对之间的电子转移[22]。凝血酶浓度与Rct之间的线性关系可以用作量化凝血酶浓度的信号，我们采用了这个模型作为概念验证的适配体传感平台。通过固定在金纳米颗粒萃取上的适配体的示意图进一步说明。如图4A所示，系统在没有凝血酶的情况下从基线氧化还原活性开始，随着凝血酶的结合电子转移受阻，最终在凝血酶和底物存在下发生S2238底物的酶促切割并释放pNA（见图4B）。

2.4 凝血酶适配体的酶促放大

一种广泛研究的检测和测量凝血酶浓度的方法是基于测量凝血酶与高选择性寡聚体或凝血酶结合适配体的结合。在电化学凝血酶适配体传感器中，固定化的适配体与凝血酶之间的结合事件导致界面电荷转移的变化，通过EIS技术进行测量[19]。我们试图确定我们开发的酶促SWV协议是否可以作为一种强大的放大方法，用于无标记的适配体传感。传统的无标记阻抗适配体传感器往往缺乏检测低浓度蛋白质目标（如凝血酶）的灵敏度，这是由于密集排列的适配体单层造成的空间阻碍和静电屏障[20]。接下来实验的目的是评估所开发的SWV协议是否可以增强凝血酶检测的灵敏度，与传统的法拉第和非法拉第EIS技术相比。简而言之，从EIS分析获得的奈奎斯特图通过Randles电路进行建模，以计算铁氰化物氧化还原对的电荷转移电阻（Rct）。由于适配体单层会阻碍电荷氧化还原对从电极的电子转移，因此在适配体固定后Rct增加[19]。这与适配体的负电荷磷酸骨架与氧化还原对之间的静电排斥以及密集排列的SAMs造成的氧化还原对从体相溶液向电极表面的扩散障碍有关[21]。此外，凝血酶孵育后Rct显著增加，因为疏水且体积较大的蛋白质层干扰了电极与氧化还原对之间的电子转移[22]。凝血酶浓度与Rct之间的线性关系可以用作量化凝血酶浓度的信号，我们采用了这个模型作为概念验证的适配体传感平台。通过固定在金纳米颗粒萃取上的适配体的示意图进一步说明。如图4A所示，系统在没有凝血酶的情况下从基线氧化还原活性开始，随着凝血酶的结合电子转移受阻，最终在凝血酶和底物存在下发生S2238底物的酶促切割并释放pNA（见图4B）。

2.4 凝血酶适配体的酶促放大

一种广泛研究的检测和测量凝血酶浓度的方法是基于测量凝血酶与高选择性寡聚体或凝血酶结合适配体的结合。在电化学凝血酶适配体传感器中，固定化的适配体与凝血酶之间的结合事件导致界面电荷转移的变化，通过EIS技术进行测量[19]。我们试图确定我们开发的酶促SWV协议是否可以作为一种强大的放大方法，用于无标记的适配体传感。传统的无标记阻抗适配体传感器往往缺乏检测低浓度蛋白质目标（如凝血酶）的灵敏度，这是由于密集排列的适配体单层造成的空间阻碍和静电屏障[20]。接下来实验的目的是评估所开发的SWV协议是否可以增强凝血酶检测的灵敏度，与传统的法拉第和非法拉第EIS技术相比。简而言之，从EIS分析获得的奈奎斯特图通过Randles电路进行建模，以计算铁氰化物氧化还原对的电荷转移电阻（Rct）。由于适配体单层会阻碍电荷氧化还原对从电极的电子转移，因此在适配体固定后Rct增加[19]。这与适配体的负电荷磷酸骨架与氧化还原对之间的静电排斥以及密集排列的SAMs造成的氧化还原对从体相溶液向电极表面的扩散障碍有关[21]。此外，凝血酶孵育后Rct显著增加，因为疏水且体积较大的蛋白质层干扰了电极与氧化还原对之间的电子转移[22]。凝血酶浓度与Rct之间的线性关系可以用作量化凝血酶浓度的信号，我们采用了这个模型作为概念验证的适配体传感平台。通过固定在金纳米颗粒萃取上的适配体的示意图进一步说明。如图4A所示，系统在没有凝血酶的情况下从基线氧化还原活性开始，随着凝血酶的结合电子转移受阻，最终在凝血酶和底物存在下发生S2238底物的酶促切割并释放pNA（见图4B）。

2.4 凝血酶适配体的酶促放大

一种广泛研究的检测和测量凝血酶浓度的方法是基于测量凝血酶与高选择性寡聚体或凝血酶结合适配体的结合。在电化学凝血酶适配体传感器中，固定化的适配体与凝血酶之间的结合事件导致界面电荷转移的变化，通过EIS技术进行测量[图5 在图形查看器或PowerPoint中打开

使用S2238底物对凝血酶的酶活性和电化学传感进行检测。(A) 在400纳米处对100微摩尔S2238进行时间分辨吸光度测量，同时改变凝血酶浓度（凝血酶在t=60秒时注入，监测至400秒）。(B) 通过SWV监测100微摩尔S2238与11.2 U/mL凝血酶在60秒内的氧化峰。(C) 对100微摩尔S2238在不同凝血酶浓度下的时间分辨SWV测量，每15秒记录一个数据点，持续300秒。(D) 使用Lineweaver–Burk图进行动力学分析并确定Michaelis–Menten常数(Km)。(E) 使用200微摩尔S2238对凝血酶进行校准曲线；反应速率(v, nA·s?1)根据最初的60秒SWV斜率得出。(F) 在存在0.7微摩尔凝血酶原和4.5微摩尔纤维蛋白原的条件下，使用11.2 U/mL凝血酶进行选择性测试（孵育5分钟）。误差条基于三个单独测试的金SPEs得出。根据Lineweaver–Burk图，Michaelis–Menten常数(Km)和最大反应速率(Vmax)由方程(1)得出[8]。

(1)其中Km/Vmax是斜率，1/Vmax是截距。从Lineweaver–Burk图（图5D）中得出Km为174 ± 10微摩尔。尽管文献中报道在优化条件下（pH 8.3，50毫摩尔Tris，0.15摩尔NaCl，37°C）S2238的动力学Km较低，为10微摩尔[8]，但我们的测量是在pH 7.4和室温（21°C）的TBS 1X溶液中进行的，这可能会降低酶与底物的亲和力。尽管如此，观察到的动力学结果仍然稳健且可重复。使用200微摩尔的固定底物浓度与不同浓度的凝血酶混合以绘制校准曲线。反应速率(v，以nA·s?1为单位)是从凝血酶引入的最初60秒内得出的（图5E）。观察到从0.112到19.7 U/mL（1到175 nM）凝血酶的线性相关性，检测限为0.0270 U/mL（0.24 nM）。对于每个浓度水平，三个单独测试的电极，校准斜率的RSD为5.5%。这个线性范围与TGA和凝血酶原时间测试中使用的临床相关浓度非常吻合[5]。为了更好地突出这项工作的优势，表格中提供了与先前报道的电化学凝血酶生物传感器的分析性能比较。值得注意的是，整个传感协议提供了一个快速、灵敏且实用的平台，可以在室温下通过快速反应动力学进行凝血监测。我们提供了表1，将先前发表的电化学凝血酶生物传感器与我们的工作进行比较，作为未来研究的基准。表1. 最新电化学凝血酶生物传感器的设计和分析性能比较。

传感底物
传感技术
样品体积
分析时间
检测限
线性范围
参考文献

ITO电极/羧基化CuInS2纳米粒子
DPV
10微升
9小时
5.86 fM
10 fM–10 nM
[12]

PEG-Au电极/Hemin-TBA
CC
25毫升
30分钟
1 fM
1 fM–1 pM
[28]

GCE/Fe–Ni/N–C/CNT/AuNPs/TBA/MCH
功率密度
6微升
40分钟
66.7 fM
0.2 pM–0.02 nM
[29]

Au/抗体/MCH/TBA/酪蛋白/arPES催化的NADH氧化
CC
70微升
60分钟
1.5 pM
—
[30]

Cu纳米粒子/激光诱导的石墨烯
DPV
40微升
40分钟
0.03 U/mL
0.01–25 U/mL
[31]

GCE/Mxene-AuNP-MB/抗污染和检测肽/FC
DPV
—
40分钟
16.1 fM
0.1 pM–10 nM
[32]

Au/TBA/MCH/PBA-CPA RAFT/Fc聚合物-ts BMRP
SWV
10微升
135分钟
35.3 fM
0.05 pM–100 pM
[33]

巯基肽/Au电极
SWV
10微升
—
4.0 fg/mL
1.0 ng/mL–10 fg/mL
[34]

电致凝血酶底物/Au SPE
SWV
10微升
5秒至5分钟
0.0270 U/mL
0.112–19.7 U/mL

本研究

为了支持所开发协议在复杂基质中检测凝血酶的临床相关性，我们在人血清存在下进行了检测测试。我们观察到，在人血清存在下，由于电极堵塞、粘度增加以及血清中固有的抑制剂，反应速率下降。例如，对于固定量的凝血酶（100 nM，11.2 U/mL），在缓冲系统中观察到的反应速率为37.0 nA·s?1。通过对血清样本进行标准添加测试，我们观察到血清浓度为1%、5%和10%时，反应速率分别降至25.6、16.8和7.2 nA·s?1。因此，为了在如血清这样的复杂基质中使用我们开发的协议，我们建议在未来的临床实验中通过标准添加在基质中进行校准实验。接下来，在三种干扰蛋白（包括HSA、凝血酶原和纤维蛋白原）存在下评估了所开发的酶传感器和适配体传感器的选择性。选择HSA作为非特异性蛋白，因为它是血浆中最丰富的循环蛋白[35]。纤维蛋白原和凝血酶原也被包括作为干扰蛋白，因为它们直接参与凝血酶的活性。凝血酶是通过因子Xa的酶促分解凝血酶原生成的，使它们在结构上相似，而凝血酶选择性地切割纤维蛋白原形成纤维蛋白凝块[4]。酶促凝血酶传感的选择性测试结果在图5F中展示。涉及分离的干扰蛋白HSA、凝血酶原和纤维蛋白原的酶促反应速率的结果没有显示，因为它们对酶促反应速率的影响很小（小于0.05 nA·s?1）。凝血酶原的存在显著降低了反应速率（p值>0.05）。在纤维蛋白原和凝血酶同时存在的情况下，形成了可见的白色粘性凝块，牢固地附着在金电极上。凝块导致酶促反应速率显著降低（约16 nA·s?1，相比之下为28 nA·s?1，p值<0.05）。因此，在未来的传感器设计中考虑生理共因子（如纤维蛋白原）是至关重要的，因为凝块的形成会改变酶的活性。为了减轻这种干扰，未来的研究可以加入纤维蛋白聚合抑制剂，如Gly-Pro-Arg-Pro，以在促进凝块形成的条件下保持检测性能[36]。关于S2238底物在其他丝氨酸蛋白酶存在下的选择性，该底物的水解速率要低得多。例如，在胰蛋白酶和纤溶酶存在下，底物的切割速率分别比凝血酶低10倍和100倍[37]。我们使用我们开发的电化学协议对胰蛋白酶进行了选择性测试。在反应开始的180秒内，未在胰蛋白酶的正常浓度血清值（100 ng/mL，0.1 BAEE U/mL）[38]中发现任何切割活性。由于我们的协议基于样品引入前60秒的斜率（反应速率），胰蛋白酶的正常范围对其影响很小。然而，我们观察到当胰蛋白酶水平升高到1微克/毫升（10 U/mL）时，在反应开始后200秒，切割活性延迟，反应速率为2.9 nA·s?1，但在前60秒内没有观察到切割活性。我们观察到异常高的胰蛋白酶水平（10微克/毫升约10 U/mL）在前60秒内以9.9 nA·s?1的速率切割底物。在未来的研究中，如果预计会有大量胰蛋白酶或类似胰蛋白酶的凝血因子（如因子Xa）存在，建议在生物测定配方中使用大豆胰蛋白酶抑制剂。接下来，评估了温度和储存条件对检测性能的影响。简而言之，凝血酶活性在45°C时达到最大[39]，但据我们所知，温度和储存对这种检测的电化学性能的影响尚未得到充分研究。因此，我们进行了短期稳定性测试。观察到三组之间没有显著差异：(1)新鲜凝血酶/新鲜底物，(2)在4°C储存1周的凝血酶/新鲜底物，以及(3)在4°C储存1周的底物和新鲜凝血酶（数据见表S2，单因素ANOVA，p值=0.16）。此外，我们没有观察到在室温或45°C储存长达4小时的凝血酶溶液的反应速率有任何显著差异。然而，在55°C储存的凝血酶溶液在2小时后观察到反应速率显著下降（见表S3）。总之，只有当温度高于45°C时，凝血酶的酶活性才会降低。底物和凝血酶在4°C储存1周时是稳定的。对于长期储存，建议分装溶液并冷冻保存，同时避免冷冻/解冻循环。

结论
凝血酶是一种关键的丝氨酸蛋白酶，在适当的条件和时间下决定了血液凝固的成功。了解凝血酶的切割机制及其反应动力学有助于有效设计和实施抗凝疗法。监测凝血酶的酶促切割活性对于开发各种凝血障碍的即时诊断方法（通常通过PT/INR、ACT和TGA测试进行）是必要的。本研究提出了一种新的电化学协议，通过直接分析凝血酶底物切割产物的电化学氧化来快速监测凝血酶活性。研究表明，化学吸附在金电极上的凝血酶仍保持其切割活性。通过在金电极上使用巯基己醇SAMs进行抗污染策略可以减少这种切割活性，但不能完全消除它。因此，酶促放大协议可以扩展到分析凝血酶的生物污染和在各种底物上的酶促活性，这可能对与凝血和心血管健康相关的生物医学设备制造具有重大价值。同时，所开发的协议将捕获的凝血酶的生物传感信号放大到生物识别探针（如适配体），从而为结合测定提供更高的灵敏度。我们使用的电化学酶促放大技术对于简化即时抗凝疗法监测具有巨大潜力，提供了一个快速、低成本和灵敏的凝血测定和生物医学设备制造平台。

附加支持信息可以在支持信息部分在线找到。

致谢
作者感谢加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）和新不伦瑞克省研究机构（ResearchNB）的财政支持。这项工作得到了NSERC Discovery Grant RGPIN-2022-03239和ResearchNB项目编号RAI_2025_003的财政支持。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究发现的数据可根据合理要求从相应作者处获得。