Teucrium scordium subsp. scordioides提取物的化学成分及其生物活性：体外实验与计算机模拟研究视角

《ChemistryOpen》：Chemical Constituents and Biological Potentials of Teucrium scordium subsp. scordioides Extracts: In Vitro Experimental and In Silico Perspectives

　　**摘要**

本研究首次探讨了从Teucrium scordium subsp. scordioides（Schreb.）（唇形科）的地上部分提取物中抗氧化和酶抑制特性。在这些提取物中，乙醇提取物含有最高的总酚类（89.96 mg GAE/g）和黄酮类（45.74 mg RE/g）含量。苯乙烷oid糖苷是主要成分，尤其在乙醇和水提取物中含量较高，初步鉴定出teucroside/forsythoside B和verbascoside/forsythoside A为主要化合物。乙醇提取物和70%乙醇提取物的抗DPPH活性（分别为201.89 mg TE/g和188.52 mg TE/g）、Cu++还原能力（分别为562.81 mg TE/g和547.88 mg TE/g）以及Fe+++还原能力（分别为329.13 mg TE/g和320.08 mg TE/g）相当。乙醇提取物的抗酪氨酸酶活性最强（72.00 mg KAE/g）。乙酸乙酯提取物能够抑制人碳酸酐酶（CA）的I和II同工酶（IC50分别为26.86 μg/mL和65.37 μg/mL）。对主要苯乙烷oid糖苷和黄酮类糖苷的计算机模拟分析支持了它们可能的多靶点作用模式，并确定了Forsythoside A–BChE复合物作为未来实验验证的理想模型。总体而言，这些发现表明T. scordium subsp. scordioides可能是用于不同健康促进配方的天然抗氧化剂和酶抑制剂来源。

**1 引言**

Teucrium L.（唇形科）是一个包含约300个分类单元的丰富属，分为八个亚组，分布于欧洲、北非和温带亚洲地区。地中海盆地被认为是Teucrium物种多样性的主要中心[1]。大多数Teucrium物种为多年生灌木，具有匍匐根茎，通常生长在岩石或多石的生境中。传统上，它们被用于治疗感冒、发热、消化问题、心脏病、糖尿病、伤口愈合、泌尿系统和神经系统疾病[2]。从药理学角度来看，许多Teucrium物种具有抗癌、抗氧化、抗糖尿病、抗菌、抗炎和杀虫作用。对该属的植物化学研究表明，萜类、甾体、黄酮类、环烯醚萜类和苯乙烷oid糖苷是常见的代谢产物。然而，对于许多分类单元而言，将提取物化学性质与多酶抑制和抗氧化效果联系起来的综合分析仍然有限，需要系统性的评估[3-5]。在土耳其，Teucrium属约有34个物种（46个分类单元），其中约35%为特有物种[6, 7]。T. scordium subsp. scordioides（Schreb.）俗称水香薄荷，是一种多年生草本植物，开管状淡紫色至紫色花朵，成簇生长。传统上，它被用于治疗伤口、发热、呼吸系统问题和肠道寄生虫[2]。从地上部分已分离出多种黄酮类（如cirsiliol、cirsimaritin、cirsilineol和luteolin）和二萜类（如6-hydroxyteuscordin、2,6-dihydroxyteuscordin、2-keto-19-hydroxyteuscordin和teuscordin）[8-11]。其地上部分的精油富含germacrene D、d-cadinene、alloaromadendrene、caryophyllene oxide、α-pinene和β-pinene，具有抗真菌、抗炎和抗炎作用[5, 12-17]。地上部分的环己烷、二氯甲烷和甲醇提取物显示出显著的抗癌和抗菌活性[18]。最近，从地上部分分离出了neo-clerodane二萜类（如scordidesin A、teucrin A和6-ketoteuscordin），并显示出中等的抗菌活性[19]。在本研究中，我们评估了从T. scordium subsp. scordioides地上部分提取的不同提取物的抗氧化能力和酶抑制潜力。此外，还应用了计算机模拟方法，结合分子对接、100 ns分子动力学（MD）模拟和对主要苯乙烷oid糖苷及黄酮类糖苷的MM/GBSA分析，以探索这些化合物在分子水平上的多靶点作用模式。抗氧化活性通过自由基清除、金属螯合和金属离子还原实验进行评估；酶抑制作用则针对乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BChE）、酪氨酸酶、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶以及人碳酸酐酶（CA）I和II同工酶进行评估。同时，还使用HPLC–ESI–Q–TOF-MS对不同提取物的化学成分进行了全面分析。

**2 材料与方法**

2.1 植物采集

2022年，在土耳其科尼亚（Konya）的Ulumuhsine地区（GPS坐标：37°55′25.78″N和32°14′58.76″E，海拔1150米）采集了植物样本。Evren Yildiztugay博士对样本进行了正式的植物分类。一个编号为EY-3187的凭证样本被保存在塞尔丘克大学（Sel?uk University）的科学学院（KNYA标本馆）中。采集后，立即将地上部分分离并在阴凉通风处风干。完全干燥后，将植物材料研磨成细粉。为确保化学完整性并防止变质，将粉末样品密封在不透明的容器中并储存在稳定条件下。

2.2 植物提取

使用四种溶剂系统来提取生物活性成分：乙酸乙酯、乙醇、70%（v/v）乙醇-水和蒸馏水。每次提取时，将10克植物材料与200毫升相应的溶剂混合。提取方法根据溶剂性质进行调整。有机溶剂提取在室温下进行24小时浸渍；而水基提取则使用加热的水进行15分钟浸泡。提取后，通过不同技术浓缩产物。水提取物通过冻干稳定，而有机溶剂组分则通过旋转蒸发器在减压条件下蒸发回收。

2.3 总酚类和黄酮类含量

使用已建立的比色法测定提取物的总酚类和黄酮类含量，参考了相应的程序。使用没食子酸（mg gallic acid equivalents (GAE)/g）和芸香苷（mg rutin equivalents (RE)/g作为标准品构建校准曲线[20]。

2.4 HPLC–ESI–Q–TOF–MS植物化学分析

将大约5毫克干燥提取物溶解在1毫升甲醇中；水提取物重新溶解在1毫升10% MeOH中。所有溶液均通过0.45 μm膜过滤器过滤。分析在Agilent 1200系统（Agilent Technologies，美国加州圣克拉拉）上进行，并与Agilent 6530B Q–TOF–MS联用进行化合物鉴定[21, 22]。完整的分析参数见支持信息。

2.5 抗氧化活性测定

根据先前描述的方案，使用一系列体外实验评估抗氧化能力[23]。还原能力通过FRAP（铁还原抗氧化能力）和CUPRAC（铜还原抗氧化能力）进行评估；自由基清除能力通过DPPH（2,2-二苯基-1-吡啶基肼）和ABTS（2,2′-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）实验测定。这四种实验的结果均以每克干燥提取物的Trolox当量（mg TE/g）表示。总抗氧化能力还通过磷钼法（PBD法）测定，并以mmol Trolox当量/克表示。此外，还通过螯合实验评估了金属螯合活性，结果以每克提取物的EDTA当量（mg EDTAE/g）表示。

2.6 酶抑制活性测定

使用已建立的比色程序，评估提取物对五种关键目标的酶抑制潜力：乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BChE）、酪氨酸酶、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶[23]。为了标准化结果，使用参考化合物进行抑制作用定量。胆碱酯酶抑制活性以每克提取物的galanthamine当量（mg GALAE/g）表示；α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性以每克提取物的acarbose当量（mg ACAE/g）表示；酪氨酸酶抑制作用以每克提取物的Kojic酸当量（mg KAE/g）表示。此外，还评估了提取物对人碳酸酐酶I和II同工酶（hCA I和hCA II）的抑制作用。

2.7 分子对接

进行分子对接以评估在T. scordium subsp. scordioides中鉴定出的苯乙烷oid糖苷和黄酮类糖苷的结合倾向。对接计算针对七个目标：AChE、BChE、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、hCA I、hCA II和酪氨酸酶。酶的三维晶体结构来自蛋白质数据库（PDB）。配体结构在ChemDraw中绘制，并使用MMFF94力场在Avogadro v1.2.0中优化能量。蛋白质制备使用BIOVIA Discovery Studio和AutoDockTools v4.2.6完成。在对接前，使用Avogadro v1.2.0优化配体几何结构，并分配Gasteiger部分电荷。对接在AutoDock Vina v1.1.2中进行， exhaustiveness参数设置为32。对接的网格参数如下：BChE（PDB ID: 6EQP；中心：32.16, ?16.33, 40.73；网格大小：25 × 25 × 25）、淀粉酶（PDB ID: 2QV4；中心：14.188, 48.964, 22.886；网格大小：28 × 28 × 24）、葡萄糖苷酶（PDB ID: 7KBJ；中心：?18.79, 2.18, 15.75；网格大小：25 × 25 × 25）、hCA I（PDB ID: 3LXE；中心：?19.049, 36.885, 44.812；网格大小：40 × 25 × 25）、酪氨酸酶（PDB ID: 6QXD；中心：21.81, 12.22, 91.40；网格大小：25 × 25 × 25）、AChE（PDB ID: 7E3H；中心：?54.44, 32.90, ?28.65；网格大小：25 × 25 × 25）和hCA II（PDB ID: 4IWZ；中心：14.059, 4.757, 14.338；网格大小：40 × 40 × 40）。结合口袋使用POCASA v1.1的腔体预测确定。为了验证协议，将共结晶配体重新对接到它们的天然结合位点，并计算均方根偏差（RMSD）值以评估构象的可重复性[24, 25]。使用蛋白质-配体相互作用分析器（protein–ligand interaction profiler）分析了蛋白质-配体接触模式，包括氢键、疏水接触和π-堆叠相互作用[26, 27]。

2.8 分子动力学模拟

进行MD模拟以探究选定蛋白质-配体复合物的动态稳定性和结合行为。初始系统设置使用CHARMM-GUI（https://charmm-gui.org）生成[28, 29]。蛋白质和配体使用CHARMM36m力场参数化[30]，在显式的TIP3P（三站点可转移分子势）水箱中溶剂化，并通过添加反离子中和。离子强度保持在0.15 M NaCl。非键合相互作用使用Verlet截断方案处理，涉及氢原子的键使用线性约束求解器约束。长程静电作用使用Ewald方法计算。能量最小化使用最陡下降算法进行，直到最大力降至1000 kJ/mol/nm以下。平衡分两个阶段进行：首先在NVT（粒子数、体积和温度恒定）条件下，然后在NPT（粒子数、压力和温度恒定）条件下进行，温度为310 K。使用GROMACS v2024.3进行100 ns的生产运行。模拟后，使用gmx_MMPBSA估算结合自由能，以提供配体亲和力和复合物稳定性的比较估计[31, 32]。

2.9 统计分析

所有实验重复三次（n = 3），结果以平均值±标准差（SD）表示。使用GraphPad Prism版本9.2进行单因素方差分析（ANOVA）评估提取物之间的统计差异，随后使用Tukey的post hoc检验进行多重比较。提供适用的精确p值，使用不同的上标字母表示组间统计学显著差异。p值< 0.05被视为统计学显著。

**3 结果与讨论**

3.1 总酚类和总黄酮类含量

确定了T. scordium subsp. scordioides不同提取物的总酚类含量（TPC）和总黄酮类含量（TFC），结果见表1。TPC值范围为32.94至89.96 mg GAE/g，顺序为EtOH > 70% EtOH > H2O > EtOAc。TFC值范围为10.50至45.74 mg RE/g，排序为EtOH > 70% EtOH ≈ EtOAc > H2O。因此，乙醇是最有效的溶剂，可以获得最高的TPC和TFC水平。之前有研究报道，在塞尔维亚生长的T. scordium subsp. scordioides的TPC和TFC最高，分别为157.89 mg GAE/g和111.93 mg rutin E/g[33]。这些值与当前结果之间的差异可能归因于遗传和环境因素以及提取所用溶剂[33]。

表1. T. scordium subsp. scordioides地上部分的提取物中的总酚类和黄酮类含量
| 提取物 | TPC, mg GAE/g | TFC, mg RE/g |
|-------------|-----------------|-----------------|
| EtOAc | 32.94 ± 0.24d | 24.31 ± 0.53b |
| EtOH | 89.96 ± 1.39a | 45.74 ± 0.42a |
| 70% EtOH | 83.46 ± 0.45b | 23.41 ± 0.42b |
| 水 | 60.42 ± 0.46c | 10.50 ± 0.30c |

注：数值为三次平行测量的平均值±标准差。不同字母表示测试提取物之间的显著差异（“a”表示最高含量，p < 0.05）。缩写：GAE，没食子酸当量；RE，芸香苷当量。

3.2 HPLC–ESI–Q–TOF–MS植物化学分析

通过整合商业参考标准品、高分辨率质谱和综合代谢物数据库的数据，鉴定出酚类化合物。参考标准品包括柠檬酸、绿原酸、新绿原酸、香豆酸和丁香酸，以及luteolin、quercetin和isorhamnetin。利用它们的色谱保留时间、精确质量和多碰撞能量（10, 20, 40 V）下的串联质谱（MS/MS）碎片模式来鉴定植物提取物中的相应化合物。对于缺乏直接标准的化合物，如糖基化黄酮类化合物，其鉴定依赖于高分辨率的准确质量和MS/MS碎片分析。通过分析已知非糖苷核的特征性碎片来确认身份，而观察到的中性丢失则指示了连接糖基的类型和连接方式。所有匹配结果都经过光谱数据库和相关科学文献的验证。关键注释（保留时间、观察到的去质子化分子离子([M–H]?)、提出的分子式、质量精度（ppm误差）和诊断性碎片离子）显示在表2中。下面提供了关于鉴定出的化合物的简要说明。化合物1显示了一个m/z为341的去质子化分子离子，表明它是一个二糖苷（可能是二葡萄糖苷），其碎片模式支持了存在糖苷基团。由于在所有提取物中都观察到了HCl加合物，因此将它们纳入了相对定量分析。在分析的提取物中还鉴定出几种有机酸，包括酚酸。化合物2和4显示出相同的[M–H]?离子和非常相似的碎片模式，与（异）柠檬酸一致。使用柠檬酸分析标准品根据保留时间区分了这些异构体。化合物3根据其分子式和m/z为115的基峰被鉴定为苹果酸。化合物7显示了一个162 Da的中性丢失（糖苷），产生了一个m/z为153的离子（基峰为m/z 109）；因此被鉴定为二羟基苯甲酸-O-糖苷。同样，化合物9显示了一个m/z为153的去质子化分子离子，这与二羟基苯甲酸相对应（其碎片与原儿茶酸的分析标准品进行了比较）。三种咖啡酰奎宁酸（化合物6、11和13）是根据[M–H]?为353和碎片离子为m/z 191进行鉴定的。新绿原酸和绿原酸通过与它们的分析标准品比较而被明确鉴定。化合物28显示了一个m/z为515的去质子化分子离子和一个m/z为353的基峰，支持其被鉴定为二咖啡酰奎宁酸。化合物8和10分别显示了m/z为359和325的去质子化分子离子，并且显示出162 Da的中性丢失，产生的碎片与丁香酸（m/z 197）和香豆酸（m/z 163）一致；这两种酚酸都是使用分析标准品鉴定的。

**表2. 在Teucrium scordium subsp. scordioides地上部分分析提取物中发现的化合物的特征。**

| 编号 | tR（分钟） | 观察到的[M–H]? | 分子式 | 误差（ppm） | 碎片离子 | 鉴定结果 | EtOH | EtOH:H2O | H2O | EtAc |
|-------|---------|-----------|---------|---------|---------|---------|---------|---------|---------|
| 1 | 1.708 | 341.109 | C12H22O11 | ?0.19 | 179.0554, 161.0448, 143.0340, 119.0342, 113.0249, 101.0241, 89.0243 | 二糖苷 | ? | ? | ? |
| 2 | 1.9 | 191.0196 | C6H8O7 | 0.82 | 173.0093, 129.0203, 111.0083, 87.0090 | 异柠檬酸 | ? | ? | ? |
| 3 | 2.1 | 133.0142 | C4H6O5 | 0.13 | 115.0031 | 苹果酸 | ? | ? | — |
| 4 | 2.58 | 191.0198 | C6H8O7 | ?0.35 | 173.0095, 129.0185, 111.0084 | 柠檬酸 | ? | ? | ? |
| 5 | 3.5 | 315.0722 | C13H16O9 | ?0.45 | 153.0544, 109.0285 | 二羟基苯甲酸-葡萄糖苷 | ? | ? | — |
| 6 | 5.1 | 353.0877 | C16H18O9 | ?0.09 | 191.0560, 179.0343, 173.0457 | 新绿原酸 | ? | ? | — |
| 7 | 5.3 | 153.0193 | C7H6O4 | 0.11 | 109.0292 | 二羟基苯甲酸 | ? | ? | ? |
| 8 | 5.8 | 359.0985 | C15H20O10 | 0.39 | 197.0430 | 苦杏仁酸-O-葡萄糖苷 | ? | ? | ? |
| 9 | 7.1 | 137.0242 | C7H6O3 | 1.42 | 109.0246, 92.0273 | 羟基苯甲酸 | ? | ? | ? |
| 10 | 7.7 | 325.0924 | C15H18O8 | 1.2 | 163.0393, 119.0500 | 香豆酸-O-葡萄糖苷 | ? | ? | ? |
| 11 | 8.8 | 353.0877 | C16H18O9 | 0.3 | 191.0556, 179.0344 | 绿原酸 | ? | ? | ? |
| 12 | 9.0 | 405.1396 | C17H26O11 | 2.54 | 345.1196, 179.0579, 165.0553 | 未知 | ? | ? | ? |
| 13 | 9.3 | 353.0879 | C16H18O9 | 0.15 | 191.0556 | 咖啡酰奎宁酸 | ? | ? | ? |
| 14 | 10.7 | 389.1456 | C17H26O10 | 0.95 | 331.1488, 227.0927, 167.0702 | 未知 | ? | ? | ? |
| 15 | 16.7 | 755.2401 | C34H44O19 | 0.27 | 623.1969, 593.2072, 461.1656, 315.1071, 161.0240, 135.0442 | 特乌克罗苷/福赛索苷B | ? | ? | — |
| 16 | 19.4 | 755.2402 | C34H44O19 | 0.36 | 623.1952, 593.2078, 461.1654, 315.1073, 161.0240, 135.0448 | 特乌克罗苷/福赛索苷B | ? | ? | ? |
| 17 | 20.1 | 623.1979 | C29H36O15 | 0.48 | 461.1657, 315.1086, 179.0346, 161.0239, 135.0446 | 维尔巴斯科苷/福赛索苷A | ? | ? | ? |
| 18 | 20.6 | 785.214 | C34H42O21 | 0.69 | 623.1968, 461.1664, 315.1064 | 异鼠李素-O-葡萄糖苷-O-鼠李糖苷 | — | ? | ? |
| 19 | 20.7 | 593.1505 | C27H30O15 | 1.03 | 447.0881, 285.0404, 243.0304, 241.0517 | 卢丁素-O-鼠李糖苷 | ? | ? | ? |
| 20 | 21.3 | 755.2402 | C34H44O19 | 0.36 | 623.1958, 593.2068, 461.1650, 315.1076, 161.0239, 135.0447 | 特乌克罗苷/福赛索苷B | ? | ? | ? |
| 21 | 21.4 | 785.214 | C34H42O21 | 0.95 | 623.1933, 461.1639, 315.1156 | 异鼠李素-O-葡萄糖苷-O-鼠李糖苷 | — | ? | ? |
| 22 | 21.7 | 447.0923 | C21H20O11 | 0.74 | 285.0388 | 卢丁素-O-葡萄糖苷 | ? | ? | ? |
| 23 | 21.7 | 477.0683 | C27H18O13 | ?2.13 | 301.0337, 178.9999, 151.0030 | 栎皮素-O-葡萄糖醛酸苷 | — | ? | — |
| 24 | 22.3 | 623.1978 | C29H36O15 | 0.59 | 461.1670, 315.1080, 179.0350, 161.0247, 135.0448 | 维尔巴斯科苷/福赛索苷A | ? | ? | ? |
| 25 | 23.3 | 769.2551 | C35H46O19 | 0.96 | 593.2075, 461.1679, 175.0407, 161.0238, 135.0448 | 阿利索诺苷 | ? | ? | — |
| 26 | 23.3 | 735.2139 | C34H40O18 | 0.26 | 623.1971, 461.1657, 315.1063, 161.0266 | 苯丙素苷 | ? | ? | — |
| 27 | 24.0 | 769.2541 | C35H46O19 | 2.52 | 593.2076, 461.1646, 179.0364, 175.0393, 161.0243, 135.0440, 113.0237, 89.0242 | 波利乌莫苷 | ? | ? | ? |
| 28 | 24.1 | 515.1189 | C25H24O12 | 1.35 | 353.0872, 191.0543, 179.0342 | 二咖啡酰奎宁酸 | ? | ? | — |
| 29 | 24.2 | 577.1558 | C27H30O14 | 1.11 | 269.0448 | 阿皮苷-O-鼠李糖苷 | ? | ? | — |
| 30 | 24.3 | 637.2132 | C30H38O15 | 0.94 | 461.1652, 315.1068, 161.0243, 175.0395 | 白藜芦醇苷A | ? | ? | ? |
| 31 | 25.5 | 377.1603 | C20H26O7 | 0.51 | 329.1336, 285.1516, 267.1375 | 未知 | ? | ? | ? |
| 32 | 25.6 | 607.1661 | C28H32O15 | 1.06 | 299.0553, 284.0311 | 迪奥斯梅丁-O-鼠李糖苷 | ? | ? | ? |
| 33 | 25.9 | 359.0771 | C18H16O8 | 0.58 | 197.0448, 161.0238 | 迷迭香酸 | ? | ? | — |

**图1. 通过HPLC–ESI–Q–TOF获得的Teucrium scordium subsp. scordioides地上部分分析提取物的热图。**所有苯乙素苷的总含量在水提取物中占45.5%，在乙醇提取物中占64%，因此是所有提取物中的主要化学成分家族。在苯乙素化合物中，特乌克罗苷/福赛索苷B和维尔巴斯科苷/福赛索苷A最为丰富，分别占总化合物的22%–40%和15%–29%。黄酮苷类化合物约占所有化合物的11%–15%，除了在乙酸乙酯提取物中，其中化合物32的含量较高。然而，这种化合物在乙酸乙酯提取物中的高比例是由于其他化合物的提取量较低。总之，提取物的生物活性主要归因于丰富的苯乙素苷类化合物，部分也归因于黄酮苷类化合物。

**3.3 抗氧化活性**

在本研究中，通过DPPH、ABTS、CUPRAC、FRAP、MCA和PBD测定法评估了T. scordium subsp. scordioides地上部分不同提取物的抗氧化活性。结果显示，EtOH和70% EtOH提取物表现出相当的抗DPPH（201.89和188.52 mg TE/g）、Cu++（562.81和547.88 mg TE/g）和Fe+++（329.13和320.08 mg TE/g）离子还原能力以及总抗氧化活性（2.31和2.24 mmol TE/g）。前者提取物还显示出最高的ABTS清除活性，其次是后者提取物（分别为364.61和287.67 mg TE/g，p < 0.05）。还注意到EtOH和70%不同的字母表示测试提取物之间存在显著差异（“a”表示最强的活性，p < 0.05）。缩写说明：ACAE为阿卡波糖当量；GALAE为加兰他敏当量；KAE为柯枝酸当量；na表示无活性。表5显示了对人类碳酸酐酶同工酶（CA I和CA II）的抑制作用。

抑制效果

CA I
IC50，μg/mL
R
2

CA II
IC50，μg/mL
R
2

EtOAc：26.86 ± 0.56b
0.9790
65.37 ± 4.92b
0.9248

EtOH：34.47 ± 0.74c
0.9785
81.52 ± 2.35d
0.9716

70% EtOH：77.00 ± 1.13d
0.9853
70.00 ± 4.47c
0.9361

水：94.93 ± 8.24e
0.9132
135.88 ± 9.65e
0.9290

阿卡唑胺（标准抑制剂）（ng/mL）：4.23 ± 0.06a
0.9836
4.81 ± 0.03a
0.9940

注：数值为三次平行测量的平均值±标准差。不同的字母表示测试提取物之间存在显著差异（“a”表示最强的活性，p < 0.05）。不同提取物所表现出的胆碱酯酶抑制活性可能部分归因于苯乙酰胺类糖苷。先前的研究表明，一种富含苯乙酰胺类糖苷的提取物在浓度为100 μg/mL时，显示出显著的抗AChE（48.87%）和抗BChE（58.81%）活性[42]。此外，纯化合物福赛索苷B和韦尔巴索苷也被证明是有效的胆碱酯酶抑制剂[42, 46]。本研究中鉴定出的其他化合物，如羟基苯甲酸[47]和迷迭香酸[48]，也被认为可以抑制胆碱酯酶。二咖啡酰奎尼酸显示出显著的抗Tyr活性[49]，而氯ogenic酸则能有效抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶[50]。因此，这种植物可能是天然酶抑制剂的有希望的来源。

3.5 分子对接

从T. scordium subsp. scordioides中选出的苯乙酰胺类和黄酮类糖苷库，包括福赛索苷A、福赛索苷B、莱科索普索苷A、韦尔巴索苷、特乌克罗苷、阿利索诺苷、迷迭香酸、木犀草素-7-芸香糖苷和二氧甲基素-7-芸香糖苷，使用AutoDock Vina系统地对七个关键治疗靶点进行了筛选：BChE、AChE、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、酪氨酸酶以及hCA I和hCA II。在检查的70个配体-酶复合物中，有41个的结合亲和力≤?7.0 kcal/mol，符合强结合的预定义阈值。BChE-福赛索苷A复合物的结合得分最低，为?10.7 kcal/mol，而选定集合中较弱的相互作用大多集中在?7.0 kcal/mol附近。RMSD值范围从0.0834到11.1594 ?（表6，图2A）。

图2：Teucrium来源的苯乙酰胺类和黄酮类糖苷的对接轮廓。（A）所有配体-酶复合物的结合能量（kcal/mol）热图。（B）BChE-福赛索苷A。（C）BChE-莱科索普索苷A。（D）BChE-韦尔巴索苷。

表6：对接得分（kcal/mol）和蛋白质的相互作用残基。

化合物 目标 PDB ID 结合能量 RMSD 类型和结合位点

福赛索苷A BChE 6EQP ?10.7 0.6 Hbond: TRP:82; GLY:115; GLY:117; THR:120; THR:120; TYR:128; TYR:128; GLU:197; SER:198; TRP:430
疏水作用：TRP:82; TRP:82; TRP:231; LEU:286; LEU:286; ALA:328; TYR:332; TRP:430
π-堆叠：PHE:329

莱科索普索苷A BChE 6EQP ?10.5 0.1 Hbond: TRP:82; GLY:115; GLY:115; GLY:117; THR:120; SER:198; SER:198; TRP:430
疏水作用：TRP:82; TRP:82; LEU:286; ALA:328; PHE:329; TYR:332; PHE:398
π-堆叠：TRP:231; TRP:231; PHE:329

韦尔巴索苷 BChE 6EQP ?10.2 0.8 Hbond: ASP:70; GLY:78; TRP:82; GLY:117; THR:120; GLU:197; SER:198; TRP:430
疏水作用：TRP:82; TRP:82; TRP:231; LEU:286; ALA:328; PHE:329; TYR:332; PHE:398
π-堆叠：TRP:231; TRP:231; PHE:329

木犀草素-7-芸香糖苷 淀粉酶 2QV4 ?10.0 5.9 Hbond: HIS:101; ALA:198; HIS:201; HIS:305
疏水作用：TRP:59; THR:163; LEU:165

二氧甲基素-7-芸香糖苷 淀粉酶 2QV4 ?9.9 0.5 Hbond: ALA:106; GLY:164; ARG:195; HIS:299; ASP:300
疏水作用：TRP:59; THR:163; LEU:165

阿利索诺苷 hCA II 4IWZ ?9.7 0.5 Hbond: HIS:4; TRP:5; ARG:58; ASN:62; ASN:67; GLU:69; GLN:92; HIS:94; HIS:96; HIS:119; THR:199; THR:200; THR:200
疏水作用：TRP:5; ASN:62; HIS:64; VAL:121; VAL:121; LEU:141; VAL:143; LEU:198
π-堆叠：HIS:64

迷迭香酸 AChE 7E3H ?9.6 0.3 Hbond: GLY:121; GLY:122; TYR:124; TYR:133; GLU:202; TYR:337
疏水作用：TRP:86; TRP:86; TYR:124; PHE:297; PHE:297; PHE:338

特乌克罗苷 淀粉酶 2QV4 ?9.6 0.5 Hbond: TRP:59; GLN:63; ASP:70; GLY:78; TRP:82; GLY:117; THR:120; GLU:197; SER:198; TRP:430
疏水作用：TRP:82; TRP:82; TRP:231; LEU:286; ALA:328; TYR:332; PHE:398
π-堆叠：TRP:231; TRP:231; PHE:329

木犀草素-7-芸香糖苷 α-淀粉酶 2QV4 ?10.0 5.9 Hbond: HIS:101; ALA:198; HIS:201
疏水作用：TRP:59; THR:163; LEU:165

二氧甲基素-7-芸香糖苷 α-淀粉酶 2QV4 ?9.9 0.5 Hbond: ALA:106; GLY:164; ARG:195; HIS:299; ASP:300
疏水作用：TRP:59; LEU:165; ILE:235

阿利索诺苷 hCA II 4IWZ ?9.7 0.5 Hbond: HIS:4; TRP:5; ARG:58; ASN:62; ASN:67; GLU:69; GLN:92; HIS:94; HIS:96; HIS:119; THR:199; THR:200; THR:200
疏水作用：TRP:5; ASN:62; HIS:64; VAL:121; VAL:121; LEU:141; VAL:143; LEU:198
π-堆叠：HIS:64

迷迭香酸 AChE 7E3H ?9.6 0.3 Hbond: GLY:121; GLY:122; TYR:124; TYR:133; GLU:202; TYR:337
疏水作用：TRP:86; TRP:86; TYR:124; PHE:297; PHE:338

特乌克罗苷 淀粉酶 2QV4 ?9.6 0.5 Hbond: TRP:59; GLN:63; ASP:70; GLY:78; TRP:82; GLY:117; THR:120; GLU:197; SER:198; TRP:430
疏水作用：TRP:82; TRP:82; TRP:231; LEU:286; ALA:328; TYR:332; PHE:398
π-堆叠：TRP:231; TRP:231; PHE:329

木犀草素-7-芸香糖苷 α-淀粉酶 2QV4 ?9.0 5.9 Hbond: HIS:4; TRP:5; ARG:58; ASN:62; ASN:67; GLU:69; GLN:92; HIS:94; HIS:96; HIS:119; THR:199; THR:200; THR:200
疏水作用：TRP:5; ASN:62; HIS:64; VAL:121; VAL:121; LEU:141; LEU:198
π-堆叠：HIS:64

迷迭香酸 hCA II 4IWZ ?9.7 0.5 Hbond: HIS:4; TRP:5; ARG:58; ASN:62; ASN:67; GLU:69; GLN:92; HIS:94; HIS:96; HIS:119; THR:199; THR:200; THR:200
疏水作用：TRP:5; ASN:62; HIS:64; VAL:121; LEU:143; LEU:198; TRP:430
π-堆叠：HIS:94

木犀草素-7-芸香糖苷 hCA II 4IWZ ?9.5 0.9 Hbond: ASN:62; ASN:67; GLN:92; THR:199; THR:199; THR:200; THR:200
疏水作用：HIS:64; ALA:65; VAL:121; VAL:121; VAL:143; LEU:198
π-堆叠：HIS:94

福赛索苷B hCA II 4IWZ ?9.5 0.5 Hbond: HIS:4; TRP:5; ASN:62; ASN:67; GLU:69; GLN:92; HIS:94; HIS:96; HIS:119; THR:199; THR:200; THR:200; THR:200
疏水作用：TRP:5; TRP:5; HIS:64; VAL:121; PHE:131; VAL:143; LEU:198
π-堆叠：HIS:94

福赛索苷A 淀粉酶 2QV4 ?9.4 1.1 Hbond: TYR:62; GLN:63; ASP:70; GLU:63; ALA:198; SER:199; LYS:200; GLU:233; ASP:300
疏水作用：TRP:59; TYR:62; LYS:200; LYS:200; ILE:235

福赛索苷A hCA II 4IWZ ?9.5 0.5 Hbond: HIS:4; TRP:5; ASN:62; ASN:67; ASN:67; GLU:69; GLN:92; HIS:94; HIS:96; HIS:119; THR:199; THR:200; THR:200; THR:200
疏水作用：TRP:5; TRP:5; HIS:64; VAL:121; PHE:131; VAL:143; LEU:198
π-堆叠：HIS:94

福赛索苷A 淀粉酶 2QV4 ?9.4 1.1 Hbond: TYR:62; GLN:63; ASP:70; GLU:63; GLY:115; GLY:117; THR:120; GLU:202; TYR:337
疏水作用：TRP:86; TRP:86; TRP:86; TYR:124; PHE:297; PHE:338

特乌克罗苷 淀粉酶 2QV4 ?9.6 0.5 Hbond: TRP:59; GLN:63; ASP:70; GLY:78; TRP:82; GLY:117; THR:120; GLU:233; GLU:233; ILE:235; HIS:305
疏水作用：TRP:59; TYR:151; LEU:162; THR:163; LYS:200; ILE:235; ILE:235
π-堆叠：HIS:201

莱科索普索苷 hCA II 4IWZ ?9.7 0.5 Hbond: HIS:4; TRP:5; ASN:62; HIS:64; ASN:67; GLU:69; GLN:92; HIS:94; HIS:96; HIS:119; THR:199; THR:200; THR:200; THR:200
疏水作用：TRP:5; ASN:62; HIS:64; VAL:121; VAL:121; LEU:143; LEU:198
π-堆叠：HIS:94

研究发现，H键的强度适中但稳定，预测参与这些键形成的残基包括His64、Phe91、Gln92、His94、Ala121、Leu131、Ala135、Leu141、Leu198和Thr199。C4表现出中等稳定性，其RMSD约为0.60 ?，RMSF较低至中等，SASA从约219–229 nm2增加。最小距离约为1.43 ?，并且保持了持续的接触，H键的数量也处于中等水平。预测的接触残基包括Trp86、Tyr119、Tyr124、Tyr133、Glu202、Ser203、Phe295、Phe297、Tyr337、Tyr341、Gly121和Gly122。C2的动态特性较弱，末端RMSD接近0.95 ?，RMSF在残基152–156附近达到峰值2.58 ?，SASA从约194–205 nm2增加到约220 nm2，H键的数量随时间减少，而最小距离保持较短（约1.09 ?）。由于这些动态特性的不成熟，因此没有对C2进行MM/GBSA分析（见图5）。

图3：选定复合物的MD稳定性指标：(A) RMSD，(B) RMSF，(C) SASA，(D) 最小距离。RMSD = 均方根偏差；RMSF = 均方根波动；SASA = 溶剂可及表面积。

图4：蛋白质-配体氢键占据率的时间分辨图。

图5：MM/GBSA结合自由能及每个残基的能量贡献。根据计算指标，MD结果被分为三个性能等级。表现最好的组包括C1、C3和C5。C1表现出明显的稳定性，其特征是RMSD和RMSF值低，最小距离短且连续，氢键网络稳健且持久，同时SASA也有所增加。预测的结合残基Trp231、Phe329、Ser287、Asn397和His438似乎稳定了BChE活性位点腔内的配体。观察到C3和C5都保持了紧凑的构象，RMSD低且SASA稳定，同时最小距离轨迹未中断。氢键网络的强度较低至中等，但能够持续维持。在C3中，主要的预测相互作用是His94、Glu106和Thr199；而在C5中，关键接触涉及His64、His94和Thr199，表明在锌结合口袋附近有稳定的配位。中等性能的组是C4，RMSD处于中等范围内，尽管SASA略有增加，但最小距离仍然较短，氢键网络足以保持配体姿态。主要相互作用的残基是Trp86、Tyr119、Tyr124、Tyr133、Glu202、Ser203、Phe295、Phe297和Tyr341，表明结合稳定且暴露于溶剂中。表现最差的组是C2，研究发现其环区灵活性较高，氢键占据率下降，SASA趋势上升，表明结合状态部分不稳定。尽管最小距离仍然很小，但结构噪声的增加阻碍了充分平衡，从而影响了能量估计的准确性。计算机模拟结果表明，虽然C1、C3和C5显示出稳定且紧凑的结合行为，但C4的稳定性中等，C2需要进一步优化以提高构象一致性和溶剂适应性，然后进行能量验证（见图3、4和5）。MM/GBSA的排名与RMSD、RMSF、SASA、最小距离和氢键特性的观察趋势大体一致，其中C1在分析的系统中最具计算优势。然而，这些结果应谨慎解读，因为MD和MM/GBSA提供的只是支持性计算证据，而非抑制活性的决定性确认。总体而言，对接和模拟数据表明，一些分析的苷类在动态条件下仍能保持稳定的结合模式，可能需要使用分离的化合物进行未来的目标特异性实验测试。对于C3和C5，假设微调非糖部分/糖的比例而不破坏金属配位药效团可以提高相互作用效率。对于C4，引入能够增强π–π堆叠作用的小芳香族衍生物可能增强结合亲和力。相反，C2可以从设计更紧凑、与环结构兼容的类似物中受益，这些类似物的供体-受体排列能够增强水介导的稳定性。一旦RMSD和H键稳定性得到改善，MM/GBSA的重新评估将更有意义。本研究的结果表明，在动态条件下，对接阶段预测的结合结构在很大程度上得以保留，并进一步突出了C1作为合理设计多靶点酶抑制剂的最有前途的骨架。

4 结论

据我们所知，这是首次关于T. scordium subsp. scordioides的抗氧化和酶抑制特性的报道。全面的化学分析显示，该植物富含酚类化合物。主要在极性提取物中检测到的苯乙烷苷类是该物种的主要成分，其次是黄酮苷类和酚酸。该物种表现出强抗氧化活性，在大多数测定中，三种极性提取物的效果显著高于EtOAc提取物。酶抑制特性因测试的酶和提取物而异，表明溶剂的极性显著影响提取效果，因此在考虑其生物特性时必须加以考虑。这些发现表明，T. scordium subsp. scordioides可能是不同制药和化妆品应用中活性成分的有希望的来源。此外，综合对接、MD和MM/GBSA分析为理解主要苷类与多种酶靶点之间的潜在相互作用提供了初步的计算框架。这些计算机模拟结果应被视为支持性和假设生成的，需要通过使用分离化合物进行的生物测定和目标特异性验证研究来确认。建议进行体内研究并分离生物活性化合物，并确定其作用机制。

支持信息
更多支持信息可在在线的支持信息部分找到。

资助
本工作得到了哈恩大学（UJA）（PID2024-160229OB-I00和R1B_2025_024）的支持。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

在撰写过程中使用生成式AI和AI辅助技术
在准备本手稿时，作者使用了基于AI的语言工具（Grammarly和ChatGPT-4）进行初步的语言编辑和校对。作者随后审查并完善了所有内容，并对最终成果及其结论承担全部责任。

数据可用性声明
本研究生成或分析的大部分数据都包含在本文中。色谱分析的具体数据集可向E.J. Llorent-Martínez（电子邮件：[e-mail]）索取。