一种新型荧光适配体传感器，基于催化发夹组装辅助的CRISPR/Cas9和G-三链结构，可实现Di(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯的灵敏且无标记检测

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A novel fluorescent aptasensor for sensitive and label-free detection of Di(2-ethylhexyl) phthalate based on catalytic hairpin assembly-assisted CRISPR/Cas9 and G-triplex

　　

易天|陈家轩|陈凤正|宋久华|史凯|易志刚|王松

摘要

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）是一种广泛使用的增塑剂，对人类健康和生态系统构成重大风险，因此对其进行灵敏、快速且可靠的检测对于环境监测和食品安全评估至关重要。CRISPR-Cas9除了其传统的位点特异性内切酶功能外，最近被报道在目标识别时还具有转切割活性，这使得它能够应用于核酸触发的信号放大和生物传感。然而，针对DEHP等小分子目标的基于Cas9的转切割策略的探索仍然具有挑战性。通过将催化发夹组装（CHA）与Cas9介导的转切割有效结合，构建了一个用于DEHP检测的传感平台，称为Cas9/CHA。在该平台上，适配体特异性识别DEHP会触发CHA反应，产生大量的双链DNA产物，激活Cas9的DNase活性。激活的Cas9系统随后会切割基于G3的发夹探针的环区，释放出G3序列。G3与硫黄素T（ThT）结合后，会通过形成G3/ThT复合物产生荧光信号。通过在10 pM到1 μM的范围内建立荧光强度与DEHP浓度之间的线性关系，实现了定量分析。重要的是，Cas9/CHA平台能够选择性地检测低至3 pM的DEHP，并在牛奶、瓶装水和自来水样品中显示出可靠的性能。Cas9/CHA系统将CRISPR/Cas9的应用范围扩展到了核酸分析之外，为开发下一代食品安全监测和环境监测分析工具提供了多功能且稳健的框架。

引言

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）是最广泛使用的邻苯二甲酸酯增塑剂之一，被广泛添加到聚氯乙烯和其他聚合物材料中以提高柔韧性和机械性能[1]，[2]。由于DEHP与聚合物基质的共价键较弱[3]，它在制造、使用和处置过程中容易进入环境。DEHP被公认为一种内分泌干扰化学物质，与多种不良健康后果有关，如生殖和发育毒性、肝功能障碍以及代谢紊乱[4]，[5]，[6]。长期暴露于DEHP会对健康和环境造成显著危害，尤其是对弱势群体而言。目前，DEHP的检测主要依赖于气相色谱-质谱法、表面增强拉曼散射（SERS）和高性能液相色谱法[7]，[8]，[9]。尽管这些方法具有高灵敏度和准确性，但它们受到复杂样品预处理、高昂的操作成本以及分析适用性限制等挑战。因此，开发简单、灵敏且准确的DEHP检测方法的重要性不言而喻，因为它在环境监测、风险评估和公共卫生保护中起着至关重要的作用。

CRISPR-Cas9系统由于其可编程的核酸识别能力和高特异性[10]，[11]，[12]，[13]，已经彻底改变了分子诊断领域。除了其传统的位点特异性（顺式）切割活性外，据报道在某些工程化或辅助设计下，Cas9还表现出目标激活的转切割行为，能够非特异性地切割报告分子[14]。这种转切割活性可以被利用作为内在的信号放大机制，将分子识别事件转化为可放大的、可检测的输出。通过将Cas9介导的转切割与酶辅助的信号放大策略相结合，已经开发出了高灵敏度的核酸检测平台，实现了显著的检测限，并极大地推动了分子诊断的发展[14]，[15]，[16]。然而，这些系统通常依赖于多个酶的协同作用，这增加了系统的复杂性，并可能引入酶干扰和交叉反应性，降低了系统的稳健性，从而限制了它们在复杂基质中的适用性。无酶信号放大方法，如催化发夹组装（CHA），因其卓越的放大效率、结构可编程性和对酶不稳定性的降低而越来越受到青睐。CHA能够在不涉及酶的情况下通过DNA链置换反应实现自主信号放大[17]，[18]，[19]。尽管有这些优势，但将CHA与基于Cas9的传感平台结合用于小分子检测（特别是DEHP）的研究仍大多处于探索阶段，需要系统的研究。尽管如此，将CHA与基于Cas9的传感平台结合用于DEHP检测仍然是一个重大挑战。

针对DEHP的适配体通常是通过指数富集（SELEX）系统进化 ligands 而生成的，它们对DEHP表现出高亲和力和特异性，与传统抗体相比具有化学稳定性、易于修饰和可重复性等显著优势[20]。基于这些适配体已经开发了多种DEHP检测分析策略，包括电化学发光、电化学和荧光方法[21]，[22]，[23]。其中，荧光方法因其高灵敏度、出色的准确性和有效的信号转导能力而特别吸引人，能够在复杂的环境基质中快速检测到微量的DEHP。G3与硫黄素T（ThT）之间的相互作用会产生稳定的复合物，产生强烈的荧光信号，可作为可靠的信号转导指示剂[24]。G3/ThT荧光策略具有多个优势，包括无标记信号生成、高信噪比和结构可编程性，使其非常适合用于生物传感应用[25]，[26]，[27]。先前的研究表明，Cas12a的DNase活性可以调节G3的完整性，从而通过目标识别和内在信号放大相结合，开发出高灵敏度的荧光生物传感器[28]，[29]。然而，Cas9的转切割活性是否也能类似地调节G3结构并用于开发无标记的DEHP检测生物传感器，目前仍需进一步研究。

在这项工作中，我们证明了G3可以在具有转切割活性的Cas9系统中与ThT相互作用，从而产生荧光信号。受这一有趣现象的启发，我们首次报道了将CHA与Cas9的转切割活性有效耦合，使用发夹结构的G3探针作为荧光报告分子。在此基础上，构建了一个用于DEHP检测的传感平台，称为Cas9/CHA（图1）。在Cas9/CHA系统中，Cas9和CHA的有效结合依赖于Cas9对CHA生成的双链DNA的识别。因此，CHA产生的双链DNA必须包含一个原间隔序列（PAM）和一个与Cas9 gRNA间隔区域互补的原间隔序列。根据之前报道的CHA设计原则，构建了一个由两个DNA发夹探针（H1和H2）组成的CHA放大器，以实现与Cas9的有效耦合。在没有DEHP的情况下，H1和H2保持其稳定的发夹构象，防止Cas9的转切割活性被激活，从而使HG3探针保持完整。当DEHP引入Cas9/CHA平台后，DEHP会选择性地结合到DNA-1/DNA-2探针对中的DNA-1上，导致DNA-2的释放。通过合理的序列工程，释放的DNA-1与H1的toehold区域杂交，诱导发夹打开并生成DNA-1/H1复合物。暴露的H1随后通过其toehold结构域与H2发生链置换反应，形成H1/H2双链，并回收DNA-2用于后续的放大循环。重复循环后，会积累大量的H1/H2复合物。加入Cas9/gRNA复合物后，这些双链产物激活Cas9的DNase活性，后者会切割HG3探针的环区，释放出G3序列。释放的G3随后与ThT结合形成G3/ThT复合物，产生荧光信号。通过建立荧光强度与DEHP浓度之间的线性关系，实现了DEHP的定量检测。

部分摘录

材料、核酸序列及DNA-1/DNA-2复合物的制备

支持信息中包含了材料、核酸序列以及DNA-1/DNA-2复合物的制备方法。

DEHP检测

目标DEHP的浓度范围为10 pM到1 μM，与500 nM的DNA-1/DNA-2复合物在20 mM Tris-HCl缓冲液（100 mM NaCl，pH 7.4）中于37°C下孵育30分钟。将10 μL的反应溶液与1 μM的HP1和HP2探针混合，在含有12.5 mM MgCl?（pH 8.0）的10 mM Tris-HCl缓冲液中于37°C下孵育60分钟，以生成

Cas9/CHA平台原理

首先，我们研究了G3序列是否能在含有具有转切割活性的Cas9的样品中产生荧光响应。图1A显示，与活性Cas9结合的G3样品在与ThT结合时产生了明显的荧光信号（曲线c），该信号与未添加活性Cas9的G3样品（曲线b）产生的信号相当。这些结果表明G3能够在含有Cas9的系统中产生荧光响应

结论

总之，我们最初观察到G3能够在具有转切割活性的Cas9系统中与ThT结合，从而产生可测量的荧光信号。在此基础上，通过整合Cas9、CHA和G3荧光探针，开发了一种高灵敏度的DEHP检测适配体传感器（称为Cas9/CHA）。Cas9/CHA平台在以下几个方面具有显著优势：（1）高选择性——使用与DEHP相关的适配体

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号22204066和22407043）、乐山科技局项目（编号24YYJC0030）、湖北省自然科学基金（编号2025AFB965）以及湖北省青年科技人才培养项目（编号2025DJA103）的资助。