世卫组织推荐的重要抗生素的拉曼光谱和红外光谱分析

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Raman and infrared spectroscopy of WHO essential antibiotics

　　亚伦·麦克莱恩|索菲·A·克劳奇|玛格达莱娜·吉耶吉尔|卡勒姆·加斯纳|艾娃·罗塞蒂|叶卡捷琳娜·I·伊兹戈罗迪娜|卡米拉·科昌

摘要
抗菌素耐药性（AMR）是一个严峻的全球健康挑战，这促使人们需要更深入地了解抗生素在分子层面的作用机制。世界卫生组织的基本药物清单（EML）将六类抗生素列为临床优先考虑的对象——β-内酰胺类、氨基糖苷类、糖肽类、脂肽类、喹诺酮类和蒽霉素类。尽管振动光谱技术，包括红外（IR）和拉曼技术，在AMR研究和诊断中已成为强有力的工具，但这些抗生素的详细光谱特征仍不完整。本研究利用红外和拉曼光谱（激发波长为1064、633、532和488纳米）以及基于密度泛函理论（DFT）的计算（ωB97X-D3/6-31+G*）对EML中的代表性抗生素进行了比较分析。实验和计算光谱的结果被用来识别和分配每种抗生素的关键振动模式和官能团。不同抗生素的特征包括：β-内酰胺类的ν(CO)伸缩振动（1779–1750厘米^-1）、氨基糖苷类的碳水化合物ν(CO)/ν(CC)振动（1200–900厘米^-1）、糖肽和脂肽类的酰胺I–III及芳香δ(CH)振动、喹诺酮类的强酮基/羧基振动（1710–1650厘米^-1），以及利福平特有的强烈ν(COC)/ν(CO)振动（1240–1160厘米^-1）。实验光谱与理论光谱之间高度一致，为这些化合物提供了可靠的光谱指纹。这些结果为抗生素的鉴定和分类提供了参考框架，并为解释细菌在抗生素作用下的光谱变化提供了理论基础，有助于未来在AMR研究中应用振动光谱技术进行药物监测、耐药性分析和高通量筛选。

引言
抗菌素耐药性（AMR）是一个迫在眉睫的全球性威胁，将在未来几十年内影响所有人的健康。随着微生物（如细菌、真菌、寄生虫和病毒）的进化并适应抗生素，AMR逐渐发展。抗菌剂的不当和过度使用是导致AMR加剧的主要原因，这主要归因于医疗、动物、环境和农业领域的做法。[1] 如果不对AMR危机采取有效应对措施，据估计到2035年，每年治疗耐药性细菌感染将耗费4120亿美元，生产力损失将达到4430亿美元。[1],[2] 到2050年，每年将有191万人死于AMR相关疾病，另有822万人死于与之相关的疾病。[1] 为应对AMR这一全球健康问题，世界卫生组织（WHO）制定了基本药物清单（EML），列出了满足公众优先医疗需求的药物。[3] 该清单为各国和地区当局提供了医疗系统最低药物需求的指导，其选择标准包括疾病流行率、公共卫生重要性、疗效、安全性和成本等因素。[3] EML不仅涵盖抗菌剂，还包括其他医疗领域所需的药物，如止痛药、抗过敏药和麻醉药。[3] 它确保了关键抗生素在医疗体系中的可用性，并根据其作用机制、耐药潜力和治疗重要性对其进行分类，其中包括作为多重耐药感染“最后手段”治疗的药物。[3] 这些抗菌药物属于不同的家族，具有不同的作用机制和特性，包括但不限于β-内酰胺类、氨基糖苷类、糖肽类、脂肽类、喹诺酮类和蒽霉素类。

β-内酰胺类含有β-内酰胺环，主要通过干扰肽链交联过程中的转肽酶来阻断细菌细胞壁的合成。[4],[5] β-内酰胺类通过酰基化转肽酶，最终导致细胞裂解。[4],[5] β-内酰胺类的结合位点称为青霉素结合蛋白（PBPs）。它们对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有效，包括青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类、单环内酰胺类和β-内酰胺酶抑制剂（图1）。[4],[5] 图1展示了常见青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类和β-内酰胺酶抑制剂的分子结构。青霉素的β-内酰胺环与五元噻唑烷环融合，而头孢菌素的β-内酰胺环与六元二氢噻嗪环融合。[4] 碳青霉烯类具有一个五元不饱和环（C2-C3双键），其C1位置的碳原子替代了硫原子与β-内酰胺环相连。[4],[5] 单环内酰胺类则没有与β-内酰胺环融合的环。[4],[5] β-内酰胺酶抑制剂与其他β-内酰胺类药物联合使用，以防止β-内酰胺酶分解抗生素，从而保持其效力。[4],[5] β-内酰胺类仍然是最常用的抗生素类别，其中青霉素占重症监护病房使用抗生素的36%。[6]

氨基糖苷类由氨基糖通过糖苷键与双碱性氨基环糖相连，例如阿米卡星和链霉素（图1），通常通过促进遗传密码的错误翻译来抑制蛋白质合成。[7],[8] 根据氨基环糖的变化，氨基糖苷类分为四个亚类：无脱氧链霉素、单取代脱氧链霉素环、4,5-双取代脱氧链霉素环和4,6-双取代脱氧链霉素环。[7],[8] 它们对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有效，尤其对肠杆菌科细菌、金黄色葡萄球菌（S. aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和许多分枝杆菌属菌株有效。[8]

糖肽类由糖基化的三环或四环七肽核心组成，可能带有脂肪酸侧链。[9] 它们通过抑制肽聚糖生物合成过程中的转糖基化和/或转肽反应来发挥作用。[9],[10],[11] 万古霉素（图1）是20世纪50年代发现的第一种糖肽类抗生素，用于治疗革兰氏阳性细菌，常用于治疗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）。[9],[12] 根据七肽第1位和第3位取代基和残基类型，糖肽类分为五个结构亚类。[9],[13],[14] I型糖肽包含缬氨酸-1和天冬酰胺-3/谷氨酰胺-3残基（如万古霉素），II型在第1位和第3位有芳香残基但未连接，III型则通过芳基醚连接。[9],[13],[14] IV型与III型类似，但在氨基糖上附加了脂肪酸成分。[9],[14] V型在七肽核心中用色氨酸替代了苯基。[9],[14] 脂肽类是由脂肪酸与短链线性或环状肽链相连的化合物。[15] 它们通过快速使细胞膜去极化来破坏细胞膜，形成离子通道，从而抑制DNA、RNA和蛋白质合成，导致细胞死亡。[15],[16] 达普霉素（图1）是最常见的脂肽类抗生素之一，常用于治疗MRSA和耐万古霉素的菌株。[15],[16] 尽管已有大量研究，但达普霉素的作用机制仍不完全清楚。[15],[16],[17],[18],[19],[20],[21],[22],[23],[24],[25],[26],[27],[28],[29] 目前的证据表明，其抗菌活性依赖于与细菌膜中的磷脂酰甘油相互作用，这解释了其对含高磷脂酰甘油比例的革兰氏阳性菌的更强效力。[15],[16],[17],[18],[19],[20],[21],[22],[23],[24],[25],[26],[27],[28],[29]

喹诺酮类是一类广谱抗生素，通过将旋转酶和拓扑异构酶IV转化为有毒酶来抑制DNA合成，从而破坏细菌染色体。[30],[31] 核心结构分为两类：喹诺酮类和萘啶酮类，区别在于萘啶环第8位是碳原子还是氮原子。[30],[32],[33] 存在几代喹诺酮类，但最早发现的喹诺酮类（虽未被归类为喹诺酮类）是萘啶酸（图1）。第二代喹诺酮类是氟化物，如环丙沙星（图1），其抗菌活性显著增强。[30] 随后的几代通过修改萘啶环第1、5、6、7和8位的取代基进一步增强了抗菌活性。[30] 蒽霉素类通常由平面萘、萘醌或苯醌核心组成，通过非相邻位置的脂肪链连接。[34] 蒽霉素类中的一个重要亚类是利福霉素（萘醌核心），它是1959年首次发现的蒽霉素类药物，以利福平为代表。[34],[35] 利福霉素抑制依赖DNA的RNA合成，最终导致细胞死亡。[34],[35],[36] 尽管利福霉素已问世数十年，但它仍然是治疗结核病（TB）、麻风病、MRSA和分枝杆菌感染的一线药物。[34],[35],[36] 利福霉素的分子结构如图1所示。

在医疗环境中，正确选择抗生素对患者预后至关重要，尤其是在败血症的情况下。通常首先使用广谱抗生素，直到获得更多关于细菌感染的信息。[37] 也会考虑患者的抗生素使用史，特别是多重耐药感染的历史，以调整治疗方案。[37] 血培养常用于确定感染的根源，但这可能需要数小时甚至数天才能提供有助于识别合适抗生素的结果。[38] 然而，治疗效果很大程度上取决于是否及时开始适当的治疗。[38],[39] 为了克服当前诊断方法的时限问题，人们使用红外（IR）和拉曼光谱技术研究了这些杀菌化合物对各种细菌的作用机制，以确定药物的敏感性和耐药性。[40],[41],[42],[43],[44],[45] 这些研究包括对一些ESKAPE病原体（如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌）的评估，发现它们对抗生素的反应存在显著化学变化，并证明基于光谱的方法可以在较短时间内确定药物敏感性，而传统方法则无法做到这一点。[40],[42],[44] 传统的细菌生长评估方法（如细胞计数和光密度测量）无法提供关于细菌生长阶段的化学信息，而振动光谱可以探测所有生长阶段的化学特征。[41] 此外，振动光谱还可以根据光谱细胞标记物的差异区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，适用于纳米尺度体内监测和大规模医院疫情监测。[43],[46],[47] 类似的光谱方法也在临床相关真菌的研究中得到应用。[48] 振动光谱在细菌研究中的应用越来越受欢迎。然而，对于抗生素本身的振动光谱分析仍有限，其光谱特征尚未广泛用于药物敏感性和作用机制的研究。因此，本研究使用红外和多波长拉曼光谱对WHO EML中的几种抗生素进行了表征，并与计算光谱进行了比较。识别了振动带，并将其明确分配给每种抗生素的关键振动模式和官能团。多波长激发拉曼光谱方法提供了必要的信息，如信噪比优化、光谱分辨率和范围、荧光特性以及样品灵敏度，为未来的抗生素研究提供了推荐的激发波长。本研究比较了不同抗生素类别和亚类，以识别关键振动特征及其分子结构。所选抗生素基于其临床相关性，涵盖了市场上可获得的各种抗生素类别和亚类，包括受到AMR威胁的“最后手段”抗生素。本研究旨在为未来的振动光谱研究提供框架，以探讨红外和拉曼光谱在抗生素敏感性和作用机制研究中的应用。

部分摘录
从WHO EML中选取了具有代表性的抗生素，涵盖了多种抗生素家族及其亚类，包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、糖肽类、脂肽类、喹诺酮类和蒽霉素类。实验和计算红外光谱的比较显示，ATR-FTIR光谱用于一系列抗生素标准品，图2展示了相关光谱；图3展示了每种抗生素的计算红外光谱，有助于理解光谱带的分配。表1比较了实验ATR-FTIR光谱与单分子计算红外光谱之间的光谱带分配差异。需要注意的是，单分子系统不包含实验固体样品中的分子间相互作用。在β-内酰胺类、氨基糖苷类、糖肽类、脂肽类、喹诺酮类和放线菌素类化合物中，各类的特征光谱都得到了清晰的分离，并通过理论计算得到了验证。这些光谱不仅展现了各类药物共有的结构特征，还揭示了它们之间的差异。作者A.M.负责数据的收集、分析和解释，完成了所有光谱带的归属鉴定，并撰写了论文；S.A.C.负责计算工作，生成了理论光谱并参与了数据解读；E.I.I.参与了项目设计及数据解读；M.G.、C.G.和A.R.负责数据收集及分析工作；K.K.负责实验的设计与实施，并参与了数据采集。

作者声明：他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢：我们感谢Xenia Kostoulias博士在抗生素选择方面提供的帮助，感谢Peleg实验室为本研究提供的抗生素标准品，以及Kai Robinson先生在技术支持方面的贡献。