在TMV生物模板上组装AuNPs以开发SERS基底

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Assembly of AuNPs on TMV biotemplates toward SERS substrate development

　　

作者：郑科图（Zhengke Tu）、莫滕·贝尔茨（Morten Bertz）、国本雅弘（Masahiro Kunimoto）、法蒂玛·贾汉（Fatema Jahan）、梅兰妮·韦尔登（Melanie Welden）、克里斯蒂娜·韦格（Christina Wege）、迈克尔·J·舍宁（Michael J. Sch?ning）、本间隆之（Takayuki Homma）

机构：早稻田大学先进科学与工程系，日本东京新宿区大久保3-4-1，西早稻田校区，邮编169-8555

摘要

烟草花叶病毒（TMV）由于其精确的蛋白质结构和化学稳定性，是一种有效的纳米棒状生物模板，可用于组装金属纳米颗粒。在本研究中，我们利用一种每300纳米长杆上含有超过2100个巯基团的TMV变体，探索了金纳米颗粒与TMV（TMV–AuNP）复合物的形成过程，并分析了溶液环境对纳米颗粒附着的影响。通过系统调节pH值和柠檬酸缓冲液浓度，我们找到了能够在单个TMV颗粒上实现均匀金纳米颗粒附着的同时最小化不必要聚集的条件。这些TMV–AuNP复合物被固定在玻璃表面上，并用作表面增强拉曼光谱（SERS）的探针，探针为Janus Green B（JGB）。在最佳条件下（8.5 mM柠檬酸缓冲液，pH 4），TMV-AuNP基底产生的SERS强度比非模板化的金纳米颗粒沉积物高约1.6倍，相对标准偏差降低了12%。这些发现强调了缓冲液化学性质在基于TMV的纳米颗粒组装中的重要性，并初步证明了生物模板如何能够提高SERS信号的均匀性。

引言

表面增强拉曼光谱（SERS）在化学、材料科学和生命科学领域是一种强大的工具，因为它具有高灵敏度和表面选择性[1]。然而，开发出能够提供强增强效果、重复性、信号均匀性以及在低成本下实现大面积定量分析的基底仍然是SERS应用面临的主要挑战[1][2]。自上而下的光刻方法和自下而上的自组装技术都已被研究过。虽然基于光刻的基底可以提供精确的纳米结构控制，但其耗时且昂贵的制备过程限制了其实际应用[3]。因此，使用丰富且环保的材料的自下而上的生物模板策略成为制备SERS基底的有前景的替代方案[4]。

生物结构可能提供本质有序的表面，可以作为SERS的模板。先前的研究已经探索了使用昆虫翅膀[5][6]、贻贝壳[7]、DNA（脱氧核糖核酸）[8]、基于病毒的蛋白质组装体以及病毒或类病毒颗粒[9][10][11][12][13][14][15][16][17]来组织用于SERS应用的Au纳米结构。这些研究表明，使用生物模板可以简单制备出具有增强灵敏度和重复性的SERS基底。在病毒模板中，烟草花叶病毒（TMV）因其跨学科应用而被广泛研究。它形成长度为300纳米、直径为18纳米的棒状病毒颗粒，中心有一个4纳米宽的通道，由2130个相同的衣壳蛋白（CP）亚单位组成，这些亚单位围绕单链RNA基因组螺旋排列[18][19][20]。由于其高热稳定性和化学稳定性，再加上其已被充分研究的结构，TMV成为生成多种混合材料的有吸引力的生物构建块。

通过用纳米颗粒、聚合物或功能分子修饰衣壳，TMV已被用作催化、医学诊断和电化学传感等多功能纳米载体[21]。其组成部分还可以转化为各种明确的基于TMV的形状，包括大面积的平面2D阵列、3D弯曲和分支的纳米结构及其超结构[9][22]。TMV纳米载体已被用于场效应生物传感，以实现特定酶反应的电化学检测，显示出增强的灵敏度和稳定的设备性能[23][24][25][26]。通过对衣壳蛋白（CP）进行基因工程改造，例如引入通过半胱氨酸或赖氨酸基团暴露的化学反应基团（这里称为CP_Cys或CP_Lys），扩大了易于结合的可能性，并能够与特定目标配体或纳米结构发生强相互作用。

不同的研究将等离子体金属与TMV结合，创造出等离子体混合结构。植物病毒与金纳米颗粒结合，开发出能够收集、共振和增强拉曼信号的纳米级光学天线[28]。在各种研究中，还详细研究了AuNPs在TMV上的成核和生长过程，使用了野生型病毒及其突变体，包括带有金属结合肽的病毒[12][14][17][29]。直接将AuNPs接枝或生物矿化到TMV上，已被评估用于溶液中的SERS传感，并显示出改善了SERS性能[30]。

对于带有不同表面涂层的AuNPs与野生型TMV[13][15]的结合，以及带有巯基的环状半胱氨酸突变TMV CP_Cys[11]的组装，已经系统地研究了溶液参数（如pH值和缓冲液浓度）对AuNPs附着的影响。然而，据我们所知，关于完整的、源自植物的TMV_Cys纳米棒与其所有显示巯基的CP_Cys亚单位之间的相互作用，以及植物病毒生物模板对基于基底的SERS性能的影响，尚未进行类似的研究。

在这项工作中，我们通过研究在不同pH值和柠檬酸缓冲液条件下TMV–AuNPs复合物的形成来填补这些空白。我们将所得到的TMV–AuNPs SERS基底与使用Janus Green B（JGB）作为目标分子的非模板化AuNPs进行了比较。TMV_Cys上暴露的巯基预计可以通过选择性形成巯基-金键来促进金纳米颗粒的附着。通过系统筛选不同的环境条件，我们确定了在保持TMV–AuNPs复合物结构完整性的同时，实现AuNPs在TMV核心上紧密附着的最佳pH值和柠檬酸浓度。这为进一步开发和应用TMV作为生物模板以制造生物辅助SERS基底奠定了基础。

节选

pH值和缓冲液组成对TMV–AuNPs组装的影响

首先，测试了不同的pH值和缓冲液条件来制备TMV-AuNPs复合物。这里使用的自制球形金纳米颗粒（AuNPs）是根据Turkevich/Frens协议[31]制备的，平均直径约为13纳米（如图S1所示）。它们以未经处理的形态使用，即由柠檬酸壳稳定。TMV_Cys和这些AuNPs都以不同组成的水悬浮液形式混合。

当AuNP颗粒分散在HCl溶液中时

结论

本研究表明，所有CP亚单位上都暴露有巯基的TMV_Cys纳米棒是创建SERS活性AuNP组装体的有用生物模板。这表明精心调节的缓冲液化学性质在管理TMV–AuNPs复合物形成中起着关键作用。一系列不同的pH值和柠檬酸缓冲液浓度实验表明，在pH 4的8.5 mM柠檬酸缓冲液中，能够最有效地形成定义明确的TMV–AuNPs结构。

CRediT作者贡献声明

郑科图（Zhengke Tu）：概念构思、研究设计、方法论、数据管理、初稿撰写、审稿与编辑。莫滕·贝尔茨（Morten Bertz）：概念构思、研究设计、方法论、撰写、审稿与编辑。国本雅弘（Masahiro Kunimoto）：概念构思、监督、撰写、审稿与编辑。法蒂玛·贾汉（Fatema Jahan）：研究设计。梅兰妮·韦尔登（Melanie Welden）：方法论、撰写、审稿与编辑。克里斯蒂娜·韦格（Christina Wege）：资源获取、研究设计、撰写、审稿与编辑。迈克尔·J·舍宁（Michael J. Sch?ning）：方法论、资源获取

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了日本科学技术机构（JST）的“通过目标驱动的研发实现适应性和无缝技术转移计划（A-STEP, JPMJTR202K）”的财政支持。该合作是文部科学省（MEXT）的Top Global University Project的直接结果。Y. O. 感谢日本学术振兴会（JSPS）研究员资助（JP20J23239）和文部科学省的支持。