利用溶菌酶和胰蛋白酶作为基于蛋白质的荧光生物传感器，实现对食品中多西环素残留的高灵敏度检测

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Highly sensitive detection of doxycycline residues in food using lysozyme and trypsin as protein-based fluorescence biosensors

　　

Xinxin Liu|Tianjiao Li|Jihong Wang|Xian Wang|Liqian Niu|Xinyu Fan|Xin Guan|Shiyue Niu|Xin Liu|Shuyun Bi

摘要

溶菌酶和胰蛋白酶分别被用作荧光探针，用于灵敏地检测多西环素。这两种蛋白质具有稳定的内在荧光性、优异的生物相容性、低毒性和低成本。通过Stern-Volmer方程和时间分辨荧光测量证实，多西环素引起的溶菌酶和胰蛋白酶的荧光淬灭是静态的。蛋白质的同步荧光和三维（3D）荧光光谱在加入多西环素后没有明显的峰位移，表明酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）残基周围的微环境几乎没有受到干扰。圆二色性（CD）和傅里叶变换红外（FT-IR）光谱表明多西环素改变了蛋白质的二级结构。在不同温度下获得了结合常数（K_a）和结合位点（n）。分子对接和热力学分析显示，静电作用在分子间相互作用中起主导作用。静态淬灭过程伴随着非辐射能量转移。干扰实验表明，所提出的方法具有良好的选择性。对于溶菌酶和胰蛋白酶系统，线性校准方程分别为F₀/F?=?0.1005c?+?0.9911和F₀/F?=?0.0884c?+?0.9708，检测限（LOD）分别为0.58和0.89?ng?mL^?1

引言

多西环素是一种第二代半合成四环素类抗生素[1]。由于其良好的稳定性、口服吸收性、低成本和广谱抗菌活性，它被广泛用于畜牧业、水产养殖和家禽养殖中，用于预防[2]和治疗细菌感染[3]、[4]，有时也添加到饲料中以促进动物生长[5]、[6]。然而，由于使用不当、非法添加和停药期管理不善，多西环素残留物存在于各种动物源性食品样品中，如肉类、鸡蛋、牛奶、蜂蜜和水产品中，对食品安全构成潜在风险[7]。长期食用这些食品可能导致细菌耐药性、降低抗生素效果、扰乱肠道微生态和消化功能、不可逆地影响儿童和青少年的骨骼发育和牙齿矿化[8]，甚至损害肝肾功能或引起过敏反应[9]。为了保护公众健康，欧盟委员会法规（EU）第37/2010号将动物肌肉中的多西环素最大残留限量（MRL）定为100?μg?kg^{?1"[10]。中国GB 31650–2019标准将动物肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中的多西环素MRL分别定为100、300、300和600?μg?kg?1"，水产品的MRL定为100?μg?kg?1"[11]。在这种情况下，开发一种高灵敏度、易于操作且成本效益高的多西环素残留检测方法具有重要的理论意义和实际应用价值。}

迄今为止，已经开发了许多多西环素检测方法，包括比色法[11]、高效液相色谱（HPLC）[12]、高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）[13]、电化学方法[14]和表面增强拉曼（SERS）光谱[15]。然而，这些方法在灵敏度、仪器成本效益、检测速度等方面都存在不同程度的局限性。也有报道使用荧光探针检测多西环素[16]、[17]、[18]、[19]、[20]，尽管它们具有良好的荧光特性，但仍存在制备复杂、潜在的生物毒性和在复杂食品基质中兼容性差的问题，从而限制了其在实际食品样品分析中的应用。相比之下，天然蛋白质作为荧光探针具有独特的优势，包括良好的水溶性、环境友好性和生物相容性。溶菌酶（又称粘胺酶）是一种小的单体蛋白质，具有抗菌和免疫调节作用，广泛分布于人体器官、组织和分泌物中，如眼泪、唾液和血清。胰蛋白酶是一种胰腺蛋白酶，在消化过程中起关键作用，是胃肠道系统的主要靶标，并介导基本的蛋白质水解功能。这两种酶都丰富且成本效益高，能很好地适应食品样品的复杂基质环境。此外，它们富含色氨酸残基，能产生稳定的内在荧光，其空间构象对配体结合高度敏感[21]、[22]。在本研究中，溶菌酶和胰蛋白酶分别被用作荧光探针，构建了两种荧光传感系统，用于灵敏检测食品中的多西环素残留。使用蛋白质作为荧光探针具有高特异性、良好的生物相容性和温和的反应条件，是一种有前景的绿色、高效和便捷的检测方法。这项研究对于确保食品安全和保护公众健康具有重要意义。

章节摘录

试剂

本研究中使用的所有化学品和试剂均为分析纯度。溶菌酶（98%，CAS: 12650–88-3）、胰蛋白酶（98%，CAS: 9002-07-7）、多西环素（98%，CAS: 24390–14-5）、卡那霉素（98%，CAS: 8063-07-8）、利卡霉素（98%，CAS: 32385–11-8）、光谱霉素（98%，CAS: 21736–83-4）、阿米卡星（99%，CAS: 39831–55-5）、利福霉素（98%，CAS: 25546–65-0）、奈替米星（99%，CAS: 56391–56-1）和米诺霉素（99%，CAS: 52093–21-7）均由上海阿拉丁化学试剂公司提供

荧光淬灭

在280?nm的激发下，溶菌酶/胰蛋白酶的最大荧光发射分别为337/334?nm，随着多西环素浓度的增加，它们的荧光强度逐渐减弱（图1A和B分别为溶菌酶和胰蛋白酶）。多西环素本身没有荧光，因此检测系统的荧光完全来自蛋白质。荧光淬灭机制主要包括能量转移、静态淬灭和动态淬灭

结论

本研究分别使用溶菌酶和胰蛋白酶作为探针，实现了对多西环素的灵敏检测。通过多种方法（包括UV–vis、CD、FT-IR、荧光、3D荧光、同步荧光光谱和分子对接）研究了多西环素与溶菌酶/胰蛋白酶之间的相互作用。多西环素与溶菌酶/胰蛋白酶之间的结合常数约为10⁴?L?mol^?1，每种蛋白质大约含有一个结合位点

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国吉林省自然科学基金（编号：20260102155JC）的支持。