通过拓扑工程改造的CRISPR/Cas12a级联扩增检测方法直接检测microRNA

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Direct microRNA detection via topologically engineered CRISPR/Cas12a cascade amplification assay

　　

孟 Shen|张培英|丁丽华|杨晓楠|何雷亮|吴永军|于松成

郑州大学公共卫生学院，中国郑州450001

部分摘录

寡核苷酸和材料

所有DNA和RNA寡核苷酸均购自Sangon Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）。DNA和RNA寡核苷酸的序列列于表S1中。LbCas12a核酸酶以及标记有6-FAM和BHQ-1的ssDNA报告基因购自Editgene Co., Ltd.（中国广州）。CRISPR/Cas12a反应使用的是10×切割缓冲液r2.1（50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2，pH 7.9）。

通过MSP检测miRNA-21

为了验证miRNA-21是否能够引发MSP并导致链位移，我们进行了实验

检测机制

在本研究中，我们提出了一种利用CRISPR/Cas12a系统直接检测miRNA-21的方法，该方法结合了两个功能集成的DNA探针。核心创新在于策略性地应用了基于toehold效应的MSP技术和哑铃形放大探针（AMP），从而无需逆转录扩增，实现了单步恒温检测并具备自驱动的级联信号放大功能（图1）。需要注意的是，该方法的信号

讨论

在本研究中，我们通过拓扑结构工程成功开发了一种直接检测miRNA-21的方法，并验证了其技术可行性。与其他分析方法相比，该方法具有较高的灵敏度、更低的检测复杂度和更短的检测时间（表S3）。未来的优化工作应集中在以下几个方面：首先，进一步提高灵敏度，例如将AMP探针和报告基因探针整合在一起

结论

通过功能性DNA探针的拓扑工程，我们实现了直接检测miRNA-21的目标，无需进行逆转录和扩增等额外步骤。这种单步CRISPR/Cas12a平台结合了基于toehold效应的链位移、空间位阻切换以及自驱动的级联信号放大技术，表现出优异的分析性能：检测限为2.88 pM，准确率高达95.5%–108.6%，精度良好（RSD 2.35%–7.18%），

伦理批准

本研究未涉及人类参与者、动物或需要伦理审批的问题。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了河南省自然科学基金（项目编号：242300421266）和河南省海外留学人员回国选择研究资助计划（项目编号：HNLX202605）的支持。