开发了一种对酯酶具有响应性的近红外荧光探针，用于快速检测革兰氏阳性细菌的抗生素敏感性

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Development of an esterase-responsive near-infrared fluorescent probe for rapid antibiotic susceptibility testing of gram-positive bacteria

　　

Bolin Li|Zhuoyang Zhou|Xuelin Wang|Ye Tian|Xiaoyan Li

摘要

快速抗菌药物敏感性检测（AST）对于指导抗感染治疗至关重要，然而开发简单快速的表型方法仍然具有挑战性。在这里，我们报告了一种新的荧光传感策略，通过使用近红外（NIR）激活探针IR-A显著加速了AST过程。该探针具有一个半花青素骨架，并功能化了一个酯酶响应的醋酸基团，作为细菌代谢活动的直接生化报告器。当在活细菌中被细胞内酯酶水解时，IR-A会产生强烈的NIR荧光信号，从而实现无需洗涤的高信噪比监测。通过使用四参数逻辑（4PL）模型分析剂量-反应曲线，我们获得了定量药效学数据，如IC??。利用这种探针的整个AST流程可以在3小时内完成，提供可靠的最小抑菌浓度（MIC）值和类别。这项工作通过将目标激活的分子传感与强大的定量分析相结合，为临床诊断和基础抗菌研究提供了一种新的快速表型AST策略。

引言

抗菌药物敏感性检测（AST）是评估微生物对抗菌剂敏感性的关键步骤，在改善患者结果和维护公共卫生方面发挥着重要作用。然而，传统技术依赖于培养和生长监测，导致报告时间较长，无法满足快速诊断和治疗的需求[1]、[2]。对于患者来说，延迟的有效治疗可能导致不良结果和显著增加的医疗成本。对于公共卫生而言，不必要的抗生素使用继续加剧了细菌耐药性的发展和传播[3]、[4]、[5]，为未来的治疗带来了隐秘的危险。因此，开发快速准确的AST技术已成为当前研究和临床实践的重点。

荧光标记技术是表型AST的一个重要进展。用高灵敏度的荧光信号检测替代传统的视觉检查，使得能够表征更微妙的细菌生理活动，从而大幅减少实验室周转时间。例如，通过SYTO 9（SYTO 9绿色荧光核酸染料）/PI（碘化丙啶）双重染色动态分析膜完整性[6]、[7]、[8]，使用吖啶橙定量评估细菌生长[9]，通过新型肽聚糖转肽酶靶向荧光探针监测细菌代谢[10]、[11]。此外，如FASTinov AST这样的荧光AST技术已经成功实现商业化[12]。然而，可见光谱中的荧光信号经常受到生物样本固有自荧光的干扰[13]，从而降低了信噪比，并需要额外的孵育时间以确保准确性。此外，大多数现有的标记方案仍然需要洗涤步骤来去除未结合的染料[14]、[15]，这使过程复杂化，并限制了其在全自动场景中的应用。

近红外（NIR）窗口的光学成像由于其高信噪比、最小光散射和深层组织穿透能力，迅速成为生物医学研究中的关键工具[16]、[17]。它现在被广泛应用于各种领域，如体内成像[18]、[19]、[20]、[21]、NIR响应药物输送系统[22]、[23]和干细胞追踪[24]，同时在体外诊断中也显示出巨大潜力[25]。细菌的自荧光主要来源于氧化的核黄素衍生物，这些衍生物通常在400–500纳米波长范围内发射荧光[26]。因此，使用在NIR区域发射荧光的染料可以有效避免这种自荧光干扰[27]，从而提高检测准确性和灵敏度。目前，用于AST的NIR荧光探针很少有报道。在这项研究中，我们报告了一种利用NIR荧光探针IR-A的快速AST策略（图1）。IR-A是通过在NIR半花青素染料骨架上将原始酚羟基替换为醋酸基团合成的。后者限制了分子内电荷转移（ICT）效应，使探针本身不发光（“关闭”状态）。当在细菌内部被酯酶水解时，酚羟基被再生，恢复ICT效应并“开启”荧光。由于荧光强度与活细菌数量成正比，因此可以建立抑制率和抗生素浓度之间的定量关系，以实现精确的药物敏感性评估。我们已经证明这是一种简单、无需洗涤、时间高效且稳健的快速AST策略。IR-A通过细菌酯酶的特异性激活来开启其荧光，实现无需洗涤的检测过程，无需去除未结合的探针或培养基。整个AST过程可以在3小时内完成，提供可靠的最小抑菌浓度（MIC）值和类别（敏感、中间或耐药）。总体而言，与参考方法相比，类别一致性率达到98.3%（116/118）。

章节片段

细菌标记的一般程序

细菌培养是通过将新鲜划线的Columbia血琼脂平板上的单个分离菌落转移到含有0.45% NaCl溶液的培养管中制备的[28]，根据需要调整细菌浓度。灭活的细菌样本通过在121°C下高压灭菌30分钟来制备。随后，以最终浓度5 μg/mL引入IR-A，然后在37°C下共孵育10分钟。取20 μL的溶液滴加到玻璃上

合成与表征

目标分子IR-A是通过一系列经典化学反应合成的，如图1a所示。简要来说，1,8-萘酰亚胺在碱性条件下与甲基三氟甲磺酸发生亲核取代，得到甲基化中间体1。随后使用甲基镁氯化物作为格氏试剂对化合物1进行甲基化，得到苯并[c,d]吲哚盐化合物2。然后该中间体与化合物3缩合形成

结论

总之，我们开发了一种基于无需洗涤、酯酶响应的NIR探针IR-A的高效精确AST方案，可以在3小时内提供可靠的结果，大大缩短了传统的16–24小时时间框架。然而，由于细菌生长特性和抗生素机制的差异，单一条件难以完美覆盖所有菌株-药物组合。进一步标准化该方法需要积累更多的测试数据以实现

CRediT作者贡献声明

Bolin Li：研究、正式分析、撰写——原始草稿。Zhuoyang Zhou：研究。Xuelin Wang：可视化。Ye Tian：方法学、资源、概念化、撰写——审阅与编辑。Xiaoyan Li：概念化、资源、监督、资金获取、撰写——审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了顺德医院科学研究启动计划[南方医科大学]（SRSP2024007）和[广东省疫情预防和控制应急研究项目（2025B1111060002）的支持。