质谱分析法：蜘蛛群落的挥发性有机化合物排放、脂肪酸组成及细菌群识别

《ChemistrySelect》：A Mass Spectrometric Approach: VOC Emissions, Fatty Acid Profile, and Bacteriota Identification of Spider Communities

　　摘要

本研究首次综合分析了全身蜘蛛样本中的挥发性有机化合物（VOCs）、脂肪酸和可培养细菌群落，结合使用了HS-SPME-GC/MS、GC/MS和MALDI-TOF-MS技术。共分析了来自五种共栖蜘蛛物种的100只蜘蛛：Steatoda opiliones、S. bipunctata、S. triangulosa、Scytodes thoracica和Parasteatoda tepidariorum。鉴定出21种VOCs，包括烷烃、萜烯（法尼烯、樟脑烯）、短链脂肪酸（SCFAs）和挥发性硫化合物（二甲基二硫化物和二甲基三硫化物），显示出明显的物种特异性谱型。S. triangulosa和Sc. thoracica表现出较高的SCFAs相对丰度，这表明微生物对蜘蛛相关挥发组分的形成有重要贡献。脂肪酸分析显示，在大多数物种中油酸占主导地位；相比之下，Sc. thoracica显示出饱和度模式相反，硬脂酸占优势，并存在支链脂肪酸。将样本接种在四种培养基上（胰蛋白胨大豆琼脂、三糖铁琼脂、厌氧琼脂以及添加了7%马血的血液琼脂），然后通过MALDI-TOF-MS进行鉴定，从而揭示了与物种相关的细菌组合。在S. opiliones中主要分离出Lysinibacillus fusiformis；S. bipunctata中特征性地分离出Acinetobacter johnsonii和Enterococcus durans；从S. triangulosa中分离出Aerococcus viridans、Corynebacterium singulare和Lysinibacillus sphaericus；从Sc. thoracica中分离出Lysinibacillus boronitolerans；从P. tepidariorum中分离出Bacillus altitudinis和Sphingomonas parapaucimobilis。观察到的抗菌VOCs（SCFAs和硫化合物）与不同细菌群落之间的关联表明，在人为微生境中可能存在化学介导的宿主-微生物相互作用。总体而言，本研究为探索蜘蛛化学生态学提供了一个方法论框架，涵盖了挥发组谱–脂质组谱–微生物组谱的维度。

1 引言

节肢动物的非凡适应能力和高效的防御机制密切相关[1]。作为内部器官与外界之间的屏障，外骨骼保护昆虫和蜘蛛免受疾病和杀虫剂的侵害[2]。在进化过程中，微生物与昆虫发展出了复杂的共生关系。它们能够在昆虫的外骨骼中生存[3]。节肢动物体内的共生细菌在增强对疾病和寄生虫的免疫防御、处理难以消化的饮食物质以及提供必需营养素方面发挥着重要作用[4]。关于肠道微生物与其宿主之间的相互作用已有大量研究，但对外部微生物的了解仍需进一步深入。与肠道微生物组相比，蜘蛛的外部微生物组研究较少，然而它却包含多种可能影响宿主-环境相互作用的细菌[5]。微生物群的组成对维持健康和福祉至关重要，因为每种动物的微生物组都是独特的，反映了其生活史并影响其行为[6-8]。已有研究表明，节肢动物的微生物组在动物感染传播、人类健康问题以及抗生素抗性基因方面起着重要作用[9]。外部微生物群在不同发育阶段表现出多样性，并对环境刺激和营养物质有不同的反应[10]。挥发性有机化合物（VOCs）是易于扩散的碳基化合物[11]。蜘蛛的VOC谱型无疑受到周围环境的影响，因此也受到蜘蛛所在位置的影响[12]，同时微生物组本身也会受到天气条件和土壤及植物种类化学物理特性的影响[13]。VOCs广泛由微生物、植物和动物产生，可能对植物具有抗菌作用[1, 14]。据报道，火蚁和甲虫也利用VOCs来抵御微生物感染[15, 16]。此外，VOCs还被认为在通信中起关键作用[17]。然而，专门针对蜘蛛VOC排放的研究极为有限，目前仅有一项研究主要关注与社会性蜘蛛巢穴和捕网相关的抗菌VOCs，而非单个蜘蛛的挥发组谱。另一方面，脂肪酸在性信号传递中也可能发挥作用[18]。现有的关于蜘蛛的研究主要集中在捕网、卵囊或特定物种的脂肪酸组成上，而蜘蛛身体组织本身的脂肪酸谱型尚未得到充分探索，也未在不同物种间进行系统比较。重要的是，到目前为止，挥发性有机化合物、脂肪酸谱型和与蜘蛛相关的细菌群落仅被分别研究，尚未有任何研究将这三种分析方法整合到单一实验框架中。因此，本研究的目的是首次对五种蜘蛛物种（Steatoda opiliones、S. bipunctata、S. triangulosa、Scytodes thoracica和Parasteatoda tepidariorum）的挥发性有机化合物谱型、脂肪酸组成及相关细菌群落进行综合分析。

2 材料与方法

2.1 样本收集

样本采集于斯洛伐克共和国尼特拉的斯洛伐克农业大学（48°18'N 18°05E）。共收集了100只雄性蜘蛛，分别属于以下物种：Steatoda opiliones（Schrank, 1781）20只、Steatoda bipunctata（Linnaeus, 1758）20只、Steatoda triangulosa（Walckenaer, 1802）20只、Scytodes thoracica（Latreille, 1802）20只和Parasteatoda tepidariorum（Koch, 1841）20只。选择这些蜘蛛物种是因为它们是共栖的，常见于人类居住区和农场建筑中，因此与家畜、食物和人类有密切接触。这种生态背景增加了它们作为微生物和抗菌素抗性载体的潜在作用。在显微镜下鉴定蜘蛛种类，并确认所有物种均不属于濒危且未受保护。采集后，将每只蜘蛛在-20°C下冷冻1分钟。然后通过将每只蜘蛛放入无菌2 mL微量离心管中并加入1 mL无菌0.87%（w/v）NaCl溶液来采集其外部表面样本。接着，将100 μL样本接种到琼脂平板上以分离细菌。

2.2 微生物学分析

使用以下琼脂培养基依次测定总微生物计数、肠杆菌科细菌、厌氧微生物和苛养微生物：TSA（胰蛋白胨大豆琼脂，Oxoid，Basingstoke，英国）、TSI（胰蛋白胨糖-铁琼脂，Oxoid，Basingstoke，英国）、AA（厌氧琼脂）和BA（血液琼脂，Oxoid，Basingstoke，英国），后者还添加了7%马血（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，美国）（表1）。TSA平板在30°C下孵育24至48小时，TSI琼脂在37°C下孵育18至24小时，AA在30°C厌氧条件下孵育24至48小时，BA在37°C有氧条件下孵育24至48小时。从每种琼脂类型中选取8个具有不同宏观特征的菌落以确认物种。选出的菌株通过MALDI-TOF进行进一步鉴定，并在TSA平板上孵育24小时。

2.3 物种鉴定

使用MALDI-TOF MS Biotyper（Bruker Daltonics，德国不来梅）来鉴定与蜘蛛相关的可培养细菌群落。样品的制备按照MALDI-TOF MS Biotyper制造商的说明进行。首先，将细菌悬浮液在300 μL蒸馏水和900 μL无水乙醇中以14,000 rpm的速度离心2分钟。去除上清液后，再加入10 μL 70%甲酸和10 μL乙腈，然后以14,000 rpm的速度离心2分钟。随后使用1 μL上清液进行分析，并将其点在MALDI目标板上，上面覆盖1 μL含有α-氰基-4-羟基肉桂酸的基质溶液。鉴定使用Biotyper Real-Time Classification（RTC）软件版本3.1和Microflex LT仪器（Bruker Daltonics，德国不来梅）进行，操作软件为FlexControl 3.4。根据制造商建议和先前研究[5, 19]，使用≥2.0的得分值进行物种水平鉴定，使用≥1.7的得分值进行属水平鉴定。

2.4 HS-SPME-GC/MS提取

蜘蛛在-20°C下保存待分析。采用HeadSpace-Solid Phase Microextraction（HS-SPME）技术从蜘蛛中提取挥发性有机化合物（VOCs），然后进行GC/MS分析。每种蜘蛛物种选取两只个体分别放入7 mL玻璃小瓶中，使用Supelco（Bellefonte，PA）的SPME装置（带有1 cm纤维，涂层为50/30 μm DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷）来吸附和收集挥发物。调节纤维后，将其暴露在40°C下的样品顶空40分钟。然后，将纤维插入GC进样器中，在250°C下以不分流模式进行脱附。在处理下一个样本之前，将纤维在GC进样器中重新调节20分钟以去除任何残留物。随后在相同操作条件下进行验证分析，以确认没有污染物。

2.5 GC-MS分析

使用配备FID（火焰离子化检测器）的Clarus 500型号（PerkinElmer，美国沃尔瑟姆）气相色谱仪，与单四极杆质谱仪（Clarus 500型号PerkinElmer）联用进行分析。毛细管柱（Varian Factor Four VF-1；60 m × 0.32 mm ID，DF = 1.0 μm）安装在GC烤箱中，初始编程温度为35°C，随后以6°C/min的梯度升温至220°C，持续15分钟。进样器温度设定为250°C。使用氦气作为载气，流速为1 mL/min。质谱检测采用电子离子化（EI）方式，在m/z范围35–550 amu内进行全扫描采集。将获得的MS碎片图谱与NIST11质谱库中的图谱进行比较以鉴定挥发性化合物。此外，使用n-烷烃（C8–C30烷烃）混合物在相同操作条件下注入柱子，计算线性保留指数（LRIs）。GC-FID（火焰离子化检测器）分析使用与GC-MS测量相同的柱子。组分的相对量以峰面积百分比表示，无需使用内标和任何校正因子。分析重复三次。

2.6 GC-MS测定脂肪酸（FAs）含量

蜘蛛在-20°C下保存待脂肪酸分析。每个样本包含2–20 mg的蜘蛛个体。根据Richoux和Ndhlovu的方法进行脂质提取和脂肪酸甲酯合成后，使用GC/MS技术测定脂肪酸组成（略有修改）。具体步骤为：将每种蜘蛛物种的两只个体溶解在5 mL氯仿/甲醇（2:1 v/v）中，然后用氮气干燥提取物，并用三氟化硼甲醇（BF3-methanol）进行甲基化，随后在80°C下与甲醇回流30分钟。获得的脂肪酸甲酯（FAMEs）用正己烷提取并用氮气蒸发至干燥。将2 μL提取物以不分流模式注入柱子。GC操作条件如下：进样器温度设定为280°C，烤箱温度从170°C以3°C/min的速率升温至260°C，持续15分钟。组分的鉴定和定量按前述方法进行。分析重复三次。

3 结果与讨论

3.1 蜘蛛的细菌计数

细菌计数详见表2。厌氧琼脂上的细菌计数范围从P. tepidariorum的2.68 log CFU/g到S. bipunctata的2.83 log CFU/g。血液琼脂上的总细菌计数在Sc. thoracica中为2.82 log CFU/g，在S. bipunctata和P. tepidariorum中为2.95 log CFU/g，而在胰蛋白酶大豆琼脂上的计数在S. opiliones中为2.23 log CFU/g，在S. triangulosa中为2.45 log CFU/g。在三糖铁琼脂上的细菌数量在P. tepidariorum中为2.63 log CFU/g，在S. opiliones中为2.83 log CFU/g。总体而言，本研究中观察到的细菌负荷与之前报道的蜘蛛相关微生物群的范围相当[5]，并且与我们最近关于蜘蛛细菌群和抗生素抗性潜力的研究结果一致[19]，表明与人类共生的蜘蛛通常携带中等水平的可培养外部细菌。表2显示了通过HS-SPME-GC-MS测定的蜘蛛中的VOCs含量（百分比平均值±标准差）。

表2. 蜘蛛中的VOCs含量（百分比平均值±标准差）

| 组分 | LRIb | LRIc | %d | %e | %f | %g | %h |
|--------------|--------|--------|------|------|------|------|
| 1 | 3-甲基丁醛 | 628 | 31.7 ± 1.12 | — | — | — |
| 2 | 丙基烯丙基醚 | 687 | 684 | — | — | 11.4 ± 0.12 |
| 3 | 戊醛 | 691 | 696 | 32.1 ± 1.24 | 4.3 ± 0.04 | 16.8 ± 0.15 |
| 4 | 二硫化二甲基 | 752 | 747 | — | — | 1.7 ± 0.04 |
| 5 | 2-甲基丙酸 | 768 | 765 | — | — | 24.2 ± 1.55 |
| 6 | 3-甲基丁酸 | 842 | 839 | — | — | 18.4 ± 1.09 |
| 7 | 2-甲基丁酸 | 877 | 872 | — | — | 42.2 ± 2.01 |
| 8 | 苯乙烯 | 885 | 889 | — | — | 10.8 ± 0.09 |
| 9 | 茴香烯 | 952 | 958 | — | — | 12.4 ± 0.14 |
| 10 | 二硫化二甲基 | 963 | 970 | — | — | 2.7 ± 0.15 |
| 11 | 苯丙胺 | 1012 | 1017 | — | — | 6.7 ± 0.10 |
| 12 | 2,6,8-三甲基十二烷 | 1108 | 1104 | 4.7 ± 0.05 | — | — |
| 13 | 十一烷 | 1111 | 1115 | — | — | 13.9 ± 0.12 |
| 14 | 2,5,9-三甲基十二烷 | 1118 | 1121 | 1.1 ± 0.04 | 2.9 ± 0.08 | 9.3 ± 0.09 |
| 15 | 3,8-二甲基十二烷 | 1142 | 1144 | — | — | 31.4 ± 1.55 |
| 16 | 2,6,11-三甲基十二烷 | 1268 | 1275 | — | 29.4 ± 1.34 |
| 17 | 4-甲基十三烷 | 1360 | 1356 | 1.4 ± 0.05 | 3.0 ± 0.02 | — |
| 18 | 6-乙基-2-甲基十二烷 | 1386 | 1390 | 1.8 ± 0.06 | — | — |
| 19 | α-法尼烯 | 1510 | 1507 | 16.2 ± 0.11 | 19.8 ± 0.07 | — |
| 20 | 2,6-二甲基十七烷 | 1785 | 1782 | 3.5 ± 0.03 | — | — |
| 21 | 2,6,10,15-四甲基十七烷 | 1918 | 1914 | 10.9 ± 0.09 | 3.8 ± 0.05 | 24.3 ± 1.33 |
| 总计 | | | | | | 99.9 |

a. 组分按照在非极性柱上的洗脱顺序报告。
b. 在非极性柱上测量的线性保留指数。
c. 来自文献（NIST）的线性保留指数；tr：平均值<0.1%。
d. 来自P. tepidariorum的组分的百分比平均值。
e. 来自S. bipunctata的组分的百分比平均值。
f. 来自S. opiliones的组分的百分比平均值。
g. 来自S. triangulosa的组分的百分比平均值。
h. 来自S. thoracica的组分的百分比平均值。

在另一项研究中，胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）上的细菌数量在S. bipunctata中为1.18 log CFU/g，在S. castanea中为2.64 log CFU/g。在另一项研究中，三糖铁（TSI）琼脂上的微生物计数在Tegenaria domestica中为1.11 log CFU/g，在P. lunata中为3.26 log CFU/g。血液琼脂（BA）上的细菌计数在S. thoracica中为1.18 log CFU/g，在Malthonica ferruginea中为2.95 log CFU/g。厌氧琼脂（AA）上的细菌计数范围在S. bipunctata中为1.11 log CFU/g，在M. ferruginea中为2.84 log CFU/g[5]。综合这些已发表的值和当前的结果表明，不同蜘蛛物种之间的细菌负荷差异主要由栖息地相关暴露和微环境条件驱动，这与我们最近的研究结果一致[19]。图1显示了从S. opiliones中分离出的细菌种类。总共从S. opiliones中分离出了29种细菌，属于15个属和13个科。分离出的数量最多的是Bacillus属，共有126个分离株。最常分离出的物种是Lysinibacillus fusiformis，占8%，其次是Roseomonas muscosa和Priestia megaterium、Corynebacterium xerosis、Cupriavidus metallidurans、Lysinibacillus boronitolerans和Staphylococcus epidermidis，每种占5%。孢子形成的Firmicutes（特别是Bacillus/Lysinibacillus）的优势与报道的节肢动物相关微生物群的模式一致，这些分类群由于其环境持久性而通常主导外部微生物群落[20-22]，这也与我们最近在与人类共生的蜘蛛中的观察结果一致[19]。

图1显示了从S. opiliones中分离出的细菌种类。总共分离出了29种细菌，属于15个属和13个科。图2显示了从S. bipunctata蜘蛛中分离出的细菌，共有118个分离株，得分超过2。总共鉴定出13个科、15个属和27种细菌。最常分离出的科是Bacillaceae和Staphylococaceae。从S. bipunctata中最常分离出的物种是Acinetobacter johnsonii和Enterococcus durans，各占7%，其次是Cupriavidus metallidurans和Staphylococcus oralis，各占6%。Bacillaceae和Staphylococcaceae的频繁检测与它们在节肢动物表面和环境中的普遍存在一致，这解释了它们在我们研究中的频繁发现[20-22]。图2还显示了将S. bipunctata的细菌种类、属和科进行分类的Krona图。先前的研究也强调了定殖在节肢动物上的微生物群的显著多样性[24]。与人类和其他动物不同，节肢动物拥有庞大的微生物群落，其数量可能超过它们体内的细胞数量[21, 22]。此外，已经证明许多微生物群落在多种节肢动物中都有代表[23]。图3显示了从S. triangulosa蜘蛛中分离出的细菌，共有127个得分超过2的分离株。在这一组蜘蛛中，发现了29种细菌，属于16个属和13个科。这种多样性和机会性环境分类群的出现与更广泛的节肢动物微生物组观察结果一致[24, 25]，并与我们最近关于与人类共生的蜘蛛相关的细菌群的研究结果一致[19]。

图4显示了S. thoracica的微生物组成。在这一组蛛形纲动物中，共鉴定出124个分离株。分离出了26种细菌，属于26个属和12个科，其中Lysinibacillus boronitolerans的分离株数量最多（占7%），其次是Acinetobacter johnsonii、Cupriavidus metallidurans、Stutzerimonas chloritidismutans和Staphylococcus warnerri，各占6%。节肢动物的消化系统和/或唾液腺中发现了多种微生物；因此，这种微生物组可能对媒介传播的感染及其生命周期产生影响。根据Zhang等人的研究[28]，所有蜘蛛物种中都发现了四个微生物门，包括放线菌门、厚壁菌门、真菌门和变形菌门。在变形菌门中，发现了28个科和58种细菌[28]。这里观察到的厚壁菌门和变形菌门相关分类群的优势与之前的蜘蛛微生物组报告一致[28]，并支持了我们最近关于与人类共生的蜘蛛相关细菌的研究结果[19]。

图5显示了P. tepidariorum节肢动物的细菌种类、属和科。共鉴定出108个分离株，属于11个科、14个属和26种细菌。最常分离出的物种是Bacillus altitudinis和Sphingomonas parapaucimobilis，各占7%。其次是Enterococcus durans、Lysinibacillus fusiformis和Paenibacillus polymyxa，各占6%。图6显示了Ka?ániová等人[5]的研究中，两种常见的物种是B. thuringiensis和B. pumilus。Rhodotorula mucilaginosa、Kocuria rhizophila、Paenibacillus polymyxa和Staphylococcus equorum是最少分离出的物种。来自鸡场、屠宰场和建筑物的样本具有不同的微生物组成。大多数对抗生素具有抗性的细菌分离株来自家禽场。当分离出具有不同抗生素抗性的潜在有害细菌（如沙门氏菌、大肠杆菌及其变种）时，公共卫生面临风险[5]。这些观察结果与我们最近的研究[19]直接相关，该研究表明与人类共生的蜘蛛中的细菌具有抗生素抗性潜力；总体而言，这些结果支持蜘蛛可能作为具有潜在公共卫生意义的多样化细菌群的储存库和机械载体的观点。

通过HS-SPME-GC/MS分析，能够识别出所研究蜘蛛释放的一系列挥发性有机化合物（VOCs）。特别是，共鉴定出21种成分，并在表2中列出。值得注意的是，这是首次对Theridiidae科活蜘蛛直接释放的VOCs进行全面的HS-SPME-GC/MS分析。除了S. thoracica（Scytodidae）外，所有研究的物种都属于Theridiidae科，这表明科级别的系统发育模式可能会影响挥发组合物。三种蜘蛛的特征是存在烷烃。具体来说，在P. tepidariorum中，3-甲基丁醛（31.7%）和戊醛（32.1%）是主要的挥发物；在S. bipunctata中，检测到高比例的2,6,11-三甲基十二烷（29.4%）和十一烷（13.9%），而在S. opiliones中，癸烷、3,8-二甲基-（31.4%）和2,6,10,15-四甲基十七烷（24.3%）最为丰富，其次是戊醛（16.8%）和丙基烯丙基醚（11.4%）。在之前的研究中，发现S. lineatus的表皮含有多种线性和支链烷烃[29]。此外，P. tepidariorum和S. bipunctata还释放了萜类化合物，如法尼烯和茴香烯。这些萜类化合物已知具有广泛的生物活性[30, 31]。虽然节肢动物可以通过甲瓦龙酸途径从头合成萜类化合物，但也可以通过从植食性猎物那里摄取[32]。这些萜类化合物在蜘蛛化学生态学中的生态功能仍有待阐明，尽管类似的化合物在昆虫中具有防御和通讯作用[33]。Lammers等人[34]分析了Stegodyphus dumicola及其在纳米比亚三个地点捕获的巢穴和网释放的VOCs。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）管收集挥发物，并通过GC/Q-TOF进行分析。结果显示，巢穴和网中的挥发物有许多共同点，而蜘蛛自身的挥发物则有所不同。然而，直接比较受到分类学距离（S. dumicola属于Eresidae亚目）和生态差异（S. dumicola是群居在共同巢穴中的亚社会性物种，而我们研究的物种是独居且与人类共生的）的限制。S. dumicola蜘蛛的独特挥发组合物可能反映了它们对群居生活和巢穴微环境的适应[34]。S. bipunctata中的支链烷烃（2,6,11-三甲基十二烷；S. opiliones中的2,6,10,15-四甲基十七烷）的存在与其在表皮防水中的作用一致，这对于栖息在干燥微环境（如地下室和棚屋）的物种来说是一种重要的适应[35]。在其他Steatoda物种中也记录了类似的表皮烃类谱型[29]。S. triangulosa和S. thoracica的挥发谱型有所不同，因为它们显示出高比例的短链脂肪酸（SCFAs），如2-甲基丙酸、3-甲基丁酸和2-甲基丁酸。重要的是，短链脂肪酸（SCFAs）主要是细菌发酵的产物，而节肢动物很少能够从头合成它们[36]。我们在S. triangulosa（Aerococcus viridans、Corynebacterium singulare、Lysinibacillus sphaericus）和S. thoracica（Lysinibacillus boronitolerans）中鉴定出的细菌群落包括已知能够通过碳水化合物和蛋白质的厌氧发酵产生SCFAs的属（Russell等人，2013年；Louis和Flint，2017年）。这强烈表明检测到的SCFAs来源于蜘蛛表皮上的细菌代谢或相关微生境，而不是蜘蛛自身的生物合成。据报道，SCFAs对细菌的生长和毒力有显著影响，这种影响与pH值和浓度有关[36]。此外，这两种蜘蛛还含有二甲基二硫化物和二甲基三硫化物等硫化合物。挥发性硫化合物主要是由细菌降解含硫氨基酸（如甲硫氨酸、半胱氨酸）产生的，是包括Bacillus、Pseudomonas和Corynebacterium在内的多个细菌属的特征代谢产物[37, 38]。从这些蜘蛛中分离出的细菌种类被记录为挥发性硫化合物的生产者，进一步支持了这些化合物的微生物来源。这些化合物以其抗真菌特性和抗炎作用而闻名[39-41]。除了它们的抗菌特性外，鉴定出的挥发性化合物可能在通信中也发挥作用[17]。检测到的挥发性化合物的抗菌特性可能直接影响与蜘蛛相关的细菌群落的组成。我们观察到，产生较高水平SCFAs和硫化合物的蜘蛛种类（S. triangulosa、S. thoracica）与以碳氢化合物为主的蜘蛛种类（S. opiliones、S. bipunctata）具有不同的细菌组合。这表明可能存在化学介导的宿主-微生物相互作用，类似于在蚂蚁-微生物共生关系中记录的选择性抗菌效应[39, 40]。因此，我们的结果表明，蜘蛛会释放多种生物活性代谢物，将其化学特征与其生态功能联系起来。所有五个研究的种类都是共栖的，栖息在地下室、棚屋和附属建筑等人造结构中。检测到的挥发性化合物，特别是抗菌化合物，可能在这些通常具有高微生物负荷和潜在病原体暴露的人造微生境中提供选择优势[41]。在P. tepidariorum中检测到的醛类（3-甲基丁醛、戊醛）可能是由脂质过氧化或细菌代谢产生的，这与我们从该物种中分离出Bacillus altitudinis相吻合，这种细菌在氨基酸分解过程中会产生醛类[42]。蜘蛛体内挥发性化合物的来源仍然不清楚。已知昆虫和多足类动物拥有专门的腺体（例如尾节腺、腹部腺、防御腺、胸腺），这些腺体分泌的分泌物具有抗捕食者或抗菌作用[15, 16]。在蜘蛛中尚未详细描述类似的外分泌腺，这引发了这些化合物是全新合成的、从食物来源中获取的，还是由相关微生物产生的问题。先前的研究表明，微生物共生体可以生成具有抗菌或信号传导功能的挥发性代谢物[14, 17]。虽然挥发性化合物的分析技术在昆虫中已经很成熟[43]，但对蜘蛛挥发性化合物的系统性分析仍然很少。与许多具有专门用于化学防御的外分泌腺（尾节腺、后胸腺或防御腺）的昆虫不同[44]，大多数蜘蛛家族缺乏发达的化学腺体。这种解剖学限制可能解释了它们对微生物贡献的明显依赖性，代表了一种类似于真菌生长蚂蚁和树皮甲虫的防御性共生关系[45]。因此，我们在样本中观察到的部分化学多样性可能来源于外部微生物组，而不是蜘蛛本身。需要进一步的针对性实验来明确宿主和微生物代谢对蜘蛛挥发性化合物组成的相对贡献。未来的研究方向应包括：（1）在不同生命阶段、进食状态和繁殖条件下对挥发性化合物谱进行时间监测，以评估代谢可塑性[46]；（2）通过抗生素处理或无菌饲养实验操纵微生物群落，以量化细菌对挥发性化合物产生的贡献；（3）进行行为生物测定，测试捕食者威慑、对抗病原真菌的抗菌活性以及种内通信等生态功能；（4）跨蜘蛛家族和生态类群进行挥发性化合物的比较分析，以确定化学多样性的系统发育和生态驱动因素[47]。此外，使用13C标记底物的同位素标记实验可以明确区分挥发性化合物是由蜘蛛全新合成的还是由微生物产生的[48]。

3.3 脂肪酸含量

通过对蜘蛛提取物进行GC–MS分析，检测并鉴定了10种脂肪酸（表3）。这是首次对整个蜘蛛身体组织进行全面的脂肪酸分析，补充了之前仅关注蜘蛛丝脂质的研究[38, 49]。在所有研究的蜘蛛种类中，不饱和脂肪酸的比例都超过了饱和脂肪酸的比例，其中油酸是最丰富的化合物。相比之下，S. thoracica的情况则相反，饱和脂肪酸占主导地位，硬脂酸是主要代谢物。此外，在这种蜘蛛中，十四烷酸（12-甲基-）和花生四烯酸（3.9%）的相对含量远高于其他蜘蛛。S. thoracica（Scytodidae科）独特的脂肪酸谱可能反映了系统发育距离和不同的代谢策略。Scytodidae蜘蛛采用一种独特的“喷射”捕食策略，涉及从改良的丝腺中产生粘性毒液[2]，这可能需要不同的脂质代谢来支持特殊粘性化合物的合成。棕榈酸在所有样本中的趋势相似，其百分比值在10.0%到22.2%之间。亚油酸在P. tepidariorum（11.3%）和S. opiliones（15.3%）中最丰富，而硬脂酸在不同物种中的趋势各不相同，S. bipunctata（7.2%）和S. triangulosa（10.0%）中的百分比值较低。这是首次研究这些蜘蛛标本的脂肪酸含量。先前的研究报道了Nephila clavipes的脂肪酸组成，与我们报告的结果一致，显示油酸和亚油酸含量丰富[50]。最近关于蜘蛛卵囊丝的研究证实了含有抗菌特性的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的存在[49]，尽管我们的研究是首次分析Theridiidae蜘蛛的全身组织脂肪酸谱。研究表明，动物的脂肪酸组成在某种程度上受到饮食的影响[51]。由于蜘蛛主要是食虫动物，它们的脂肪酸组成应该与昆虫相似[52]。然而，大多数研究物种中油酸（C18:1）的占主导地位表明可能是选择性保留或全新合成的，因为饮食中的脂肪酸谱通常会被消费者的代谢需求所改变[53]。P. tepidariorum和S. opiliones中较高的亚油酸含量可能表明它们更依赖于食物来源，因为节肢动物通常无法自行合成C18:2，必须从猎物中获取[54]。

表3. 通过GC–MS测定的酯交换提取物的脂肪酸含量（百分比平均值±标准偏差）。
| 组分 | LRIb | LRIc | %d | %e | %f | %g | %h |
|-----------------|---------|---------|-----------|-----------|-----------|-----------|
| 1 | Myristic acid, C14:0 | 1762 | 1759 | 0.4 | 0.9 | 1.2 | — |
| 2 | Tetradecanoic acid, 12-methyl- | 1775 | 1771 | — | 0.1 | 0.1 | 4.2 |
| 3 | Palmitoleic acid, C16:1n7 | 1936 | 1930 | 0.8 | 14.5 | 4.0 | 1.9 |
| 4 | Palmitic acid, C16:0 | 1972 | 1973 | 10.0 | 16.3 | 22.2 | 21.1 |
| 5 | Margaric acid, C17:0 | 2045 | 2038 | 0.3 | 0.3 | 0.4 | 0.8 |
| 6 | Linoleic acid, C18:2n6 | 2110 | 2107 | 11.3 | 1.4 | 9.1 | 15.3 | 5.8 |
| 7 | Oleic acid, C18:1n9 | 2155 | 2152 | 61.1 | 59.0 | 49.6 | 49.7 | 27.5 |
| 8 | Stearic acid, C18:0 | 2192 | 2188 | 15.4 | 7.2 | 20.6 | 10.0 | 34.3 |
| 9 | Arachidonic acid, C20:4n6 | 2326 | 2324 | 0.4 | 0.1 | 0.3 | 0.3 |
| 10 | Arachidonic acid, C20:0 | 2372 | 2380 | — | 0.2 | 2.0 | 3.9 |
| 总计 | | | | | | | 99.7 | 100.0 |

饱和脂肪酸：26.1 | 25.0 | 35.7 | 32.7 | 64.3 |
不饱和脂肪酸：73.6 | 75.0 | 63.0 | 66.9 | 34.4 |

a 组分按照在非极性柱上的洗脱顺序列出。
b 在非极性柱上测量的线性保留指数。
c 来自文献（NIST）的线性保留指数。
d P. tepidariorum组分的百分比平均值。
e S. bipunctata组分的百分比平均值。
f S. opiliones组分的百分比平均值。
g S. triangulosa组分的百分比平均值。
h S. thoracica组分的百分比平均值；tr：平均值<0.1%。

值得注意的是，具有较高不饱和脂肪酸含量的物种（P. tepidariorum、S. opiliones）与S. thoracica（以饱和脂肪酸为主）具有不同的细菌组合。这是否反映了因果关系或独立的适应策略，还需要进一步研究。S. thoracica中存在支链脂肪酸（特别是12-甲基-十四烷酸）是值得注意的。支链脂肪酸在真核生物中相对罕见，但在细菌膜中很常见，尤其是在革兰氏阳性细菌中，包括Bacillus及其相关属[55]。这提出了一个有趣的可能性，即一些检测到的脂肪酸可能来源于细菌，而不是蜘蛛本身，或者代表了蜘蛛-细菌相互作用的代谢产物。未来的研究可以使用稳定同位素探针来区分由蜘蛛全新合成和由微生物产生的挥发性化合物[56]。总体而言，蜘蛛中观察到的细菌、挥发性化合物和脂肪酸的组成可能反映了与微生物防御和种间相互作用相关的适应策略。我们的三种分析方法——挥发性化合物组学、脂质组学和微生物组学的整合揭示了蜘蛛与其相关微生物群之间潜在的化学介导的相互作用。例如，抗菌挥发性化合物（SCFAs、硫化合物）和生物活性脂肪酸可能选择性地塑造细菌群落的组成，而细菌代谢可能为蜘蛛的化学武器库做出贡献。这种三方面的化学生态学（宿主-微生物-环境）代表了蛛形动物生物学的一个新兴前沿[57]。这些生态方面强调了蜘蛛不仅是捕食者，而且还是嵌入其环境中复杂化学网络中的生物体[12, 17, 28]。作为共栖物种，这些蜘蛛栖息在与人造结构相关的微生境中，这些微生境与自然环境中的微生境具有不同的微生物群落[58]。检测到的脂肪酸和挥发性化合物可能在这些人为生态系统中提供竞争优势，这可能解释了它们在人类居住地成功定植的原因。未来比较研究自然栖息地和共栖栖息地中的同种种群，可以揭示对环境微生物压力响应的化学可塑性程度。

4 结论

本研究中应用的光谱学和微生物学方法有效地整合了与蜘蛛相关的挥发性有机化合物、脂肪酸和细菌群落的特征分析。这项工作是首次结合HS-SPME-GC/MS挥发性化合物组学、GC/MS脂质组学和MALDI-TOF-MS微生物组学对整个蜘蛛标本进行综合研究，为Theridiidae和Scytodidae蜘蛛的宿主-微生物-化学关系提供了新的见解。我们的结果表明，蜘蛛释放的挥发性化合物谱在不同物种间存在显著差异，并且与它们相关的细菌群落的差异密切相关。特别是，产生高水平短链脂肪酸和挥发性硫化合物的物种（S. triangulosa、S. thoracica）具有不同的细菌组合，这强烈表明微生物对检测到的挥发性化合物的关键成分有贡献。此外，尽管所研究蜘蛛的脂肪酸组成在定性上相似，但在定量上观察到了明显差异，尤其是在Theridiidae物种和Sc. thoracica之间，这表明了物种特定的代谢和生态适应。在Sc. thoracica中检测到支链脂肪酸进一步支持了细菌来源的脂质贡献的可能性，并促使未来的同位素标记研究来澄清代谢起源。与蜘蛛相关的细菌群落特征是存在一个以Bacillaceae和Staphylococcaceae为主的分类单元核心群落，伴随着可能受环境暴露和微生境条件影响的额外微生物。使用MALDI-TOF-MS，我们鉴定出了与每个蜘蛛物种相关的可培养细菌种类，包括Lysinibacillus fusiformis（S. opiliones）、Acinetobacter johnsonii和Enterococcus durans（S. bipunctata）、Aerococcus viridans和Corynebacterium singulare（S. triangulosa）、Lysinibacillus boronitolerans（Sc. thoracica）以及Bacillus altitudinis和Sphingomonas parapaucimobilis（P. tepidariorum）。抗菌挥发性化合物、生物活性脂肪酸和特定细菌分类单元的共同存在表明，蜘蛛与其微生物群之间可能存在化学介导的相互作用，这可能有助于微生物防御和生态成功，尤其是在共栖环境中。鉴于所有研究物种都栖息在可能具有较高微生物负荷的人造结构中，检测到的化学谱可能代表了在人为微生境中持续存在的适应特征。总体而言，这项研究首次提供了对五个蜘蛛物种全身标本的挥发性化合物组学、脂质组学和可培养细菌群的全面见解。获得的数据加深了对蜘蛛化学生态学的理解，并突出了宿主-微生物相互作用在塑造蜘蛛相关化学谱及其环境界面中的重要性。未来使用微生物群操作（例如抗生素处理）、同位素追踪和行为生物测定等研究将有助于确定因果关系，并阐明蜘蛛相关挥发性化合物和脂肪酸在防御、通信和微生物组调节中的生态功能。本文建立的方法论框架为研究其他蛛形纲动物及研究不足的节肢动物群体中的化学生态学与微生物组相互作用提供了模板。作者贡献：

Stefania Garzoli：概念构思、正式分析、初稿撰写、审稿与编辑、数据管理、监督工作。
Ján Kollár：资源提供。
Miroslava Ka?ániová：概念构思、初稿撰写、审稿与编辑、数据管理、监督工作、项目管理工作。

资金情况：
作者们无需报告任何资金相关事宜。

利益冲突声明：
作者们声明不存在任何利益冲突。

数据公开声明：
支持本研究结果的数据可应合理请求向通讯作者索取。