利用未提取的木瓜废弃物酶对牛血进行转化：优化水解工艺以生产氨基酸和抗氧化肽

《Sustainable Chemistry and Pharmacy》：Valorization of cow blood using unextracted papaya waste enzymes: Optimized hydrolysis for amino acid and antioxidant peptide production

　　莫杰塔巴·扎雷亚（Mojtaba Zarea）|努里·M·卡塔·萨迪（Noori M. Cata Saady）|波努萨米·文卡塔查拉姆（Ponnusami Venkatachalam）
纽芬兰纪念大学土木工程系，圣约翰斯，NL，A1B 3X5，加拿大

**摘要**
高昂的酶成本和能源密集型的处理过程限制了富含蛋白质的屠宰场废物的规模化利用，尤其是血液。本研究评估了未提取的木瓜废弃物（PPW）作为直接、低成本的生物催化剂，在常温无添加剂条件下用于牛血（CB）水解的可能性，以替代传统的基于酶的系统。采用中心复合设计（CCD）方法优化了水解时间、PPW浓度和CB浓度，并以蛋白质还原率（Pred）、游离氨基酸浓度（FAA）和挥发性固体减少率（VSred）作为响应变量。模型结果具有高度显著性（p < 0.0001），预测性能优异。最佳条件为：132小时、10.8克PPW/L、3.2克CB/L，此时蛋白质还原率为99.0%，游离氨基酸浓度为1256微克/毫升。抗氧化活性显著提高，DPPH自由基清除能力增加了3.6倍（从14.47%提高到52.61%），总抗氧化能力（TAC）从17.8微摩尔Trlox等效物增加到41.40微摩尔Trlox等效物。傅里叶变换红外（FTIR）分析证实了酰胺I键的断裂。

与传统方法不同，该方法使用未经提取的PPW，无需调整pH值或加热，从而降低了工艺复杂性和成本。所得水解物富含抗氧化化合物，具有在食品、营养保健品和制药领域的应用潜力，同时改善了底物的厌氧消化特性。

**1. 引言**
屠宰场废物对农业地区的土壤和水质有显著影响；含有血液、脂肪、蛋白质等物质的废水会损害水生生态系统的功能，并增加致病微生物的繁殖（Mujere, 2016）。研究表明，屠宰场活动会降低水体的物理、化学和微生物质量（Ansari et al., 2024）。用屠宰场废水进行土壤施肥会增加氮、磷和钾的浓度（Oliveira et al., 2017）。家禽屠宰场的废水含有极高的污染物负荷，化学需氧量（COD）高达5126 ± 2534毫克/升，总悬浮固体（TSS）为1654 ± 1695毫克/升，脂肪、油和油脂（FOG）为715 ± 506毫克/升，铵氮（NH4+-N）为216 ± 56毫克/升，远超南非1998年国家水法（South African National Water Act 36）规定的排放限值（75、25、2.5和6毫克/升），显示出严重的有机和营养负担（Kaskote et al., 2024）。已研究了多种处理策略，包括高级氧化工艺（AOPs）和其他生物方法（McCabe et al., 2020）。作为一种成本和能源效率高的废物管理方法，厌氧消化（AD）已成为污泥处理的标准做法（Huang, 2024）。特别是血液废物，在生物气生成和高价值生物产品的回收方面具有巨大潜力（Otero et al., 2021）。据报道，根据底物类型和操作条件，从牲畜血液中产生的甲烷产量范围为0.3至0.561立方米CH4每千克挥发性固体，表明其具有较高的生物降解性和能源回收潜力。这突显了血液作为通过AD生产可再生能源的有希望的底物的重要性（Bu?kowska and Zielińska, 2024）。然而，仍存在诸如氨抑制等挑战，需要通过共消化和适当的预处理方法来缓解（Bu?kowska and Zielińska, 2024）。除了生物气之外，血液还可以被加工以回收高价值产品，包括蛋白质、血红素铁和生物活性肽，用于制药和食品领域（Lynch et al., 2017）。来自蛋白质水解的生物活性肽表现出多种生物活性，如抗氧化、抗高血压和治疗作用，适用于食品、生物医学和化妆品行业（Shaik et al., 2025）。从牛奶蛋白质中提取的生物活性肽已显示出显著的抗糖尿病、抗氧化和抗炎作用，表明它们作为2型糖尿病等代谢紊乱的天然治疗剂的潜力（Aziz et al., 2025）。使用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、FP400和FPII（来自Aspergillus oryzae的蛋白酶提取物）对鹿、羊和猪的血浆蛋白进行水解，产生的水解物具有显著的抗氧化活性（Bah et al., 2016）。这些策略强调了通过将废物转化为增值产品来推进循环生物经济的重要性，以及实现更可持续废物管理的重要性（Lynch et al., 2017; Puyol et al., 2017）。如果没有明确的水解策略，一个关键挑战是需要更大的反应器和更长的停留时间，这会增加运营成本并降低可扩展性（Jiménez-Urpi et al., 2025）。食品来源的生物活性肽可以通过酶促、微生物或化学水解产生，其中酶促水解（EH）是最常见的方法。该方法利用来自植物、动物或微生物的酶（Mora and Toldrá, 2023）。目前的主要挑战是，大多数酶促水解过程依赖于在受控pH和温度条件下使用的纯化商业酶，需要专用设备并增加操作复杂性（Noman et al., 2018; Sierra-Lopera and Zapata-Montoya, 2021）。酶促水解高度依赖于酶浓度、pH值和温度等控制参数。例如，在木瓜蛋白酶辅助下对中国鲟鱼（Acipenser sinensis）肌肉进行水解时，只有在特定条件下才能达到最佳效果（pH 6，70°C，定义的酶添加量和孵育时间），这突显了精确过程控制的需求（Noman et al., 2018）。EH具有显著优势，因为酶在温和条件下高效工作，确保高催化活性、高产品选择性和环境安全性（Kabir and Ju, 2023; Sharma et al., 2022）。EH是一种高效且可持续的方法，可将富含蛋白质的废物转化为生物活性肽和抗氧化剂等增值产品（Leiva-Portilla et al., 2023）。在乳制品系统中，发酵过程中产生的生物活性肽具有抗氧化、抗菌和抑制酶的活性，表明工艺条件对肽功能的重要性（Gabrilyants et al., 2025）。与化学或热处理方法不同，EH更好地保持了副产物的质量和生物活性（Phing and Kalam, 2023; Ranasinghe et al., 2021）。此外，该方法能有效从食物废物（如鱼类、虾和水果副产品）中保存和回收生物活性化合物，从而提取蛋白质、类胡萝卜素和其他有价值的成分（Bah et al., 2013; De Holanda and Netto, 2006; Leiva-Portilla et al., 2023）。一系列水果来源的酶，如木瓜蛋白酶（木瓜）、菠萝蛋白酶（菠萝）和actinidin（猕猴桃）可用于高效蛋白质水解（Borges et al., 2025; Chalabi et al., 2014; Sethuramalingam et al., 2022）。木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2）是一种半胱氨酸蛋白酶，是Carica papaya中的主要蛋白酶。它由一个通过二硫键稳定的多肽链组成，活性巯基对催化活性至关重要。木瓜蛋白酶作为内肽酶，可切割内部肽键，将蛋白质转化为较小的肽和游离氨基酸（Babalola et al., 2023）。木瓜蛋白酶的活性受pH值影响，不同底物的最佳pH值有所不同（Venetikidou et al., 2025）。先前使用纯化木瓜蛋白酶的研究表明，在受控pH（6）和较高温度（65–70°C）下可实现最佳水解效果（Ahmad Nadzri et al., 2021; Noman et al., 2018）。使用来自木瓜的植物蛋白酶进行蛋白质水解已被证明能有效从多种材料（包括鱼类和家禽血液）中生成生物活性肽（Hartoyo et al., 2022; Sethuramalingam et al., 2022; Tacias-Pascacio et al., 2021）。此外，蛋白质水解在预处理中起着关键作用，因为在AD过程中，肽和氨基酸会因发酵和产甲烷微生物的协同作用而迅速降解，降低了将其作为功能性化合物回收的机会（Du et al., 2022）。一个关键挑战是EH需要高能量和专门的温度控制系统（Corrêa et al., 2026）。另一个工程挑战是，工业酶促过程受到高生产和纯化成本的限制，酶在操作条件下的稳定性有限，以及与传质限制和工艺复杂性相关的放大挑战（Fasim et al., 2021）。一个主要的经济挑战是，纯化酶制剂的价格可能比粗酶提取物高出150倍（Díaz et al., 2025），这对可扩展性和经济可行性构成重大挑战（Díaz et al., 2025; Hu et al., 2016; Ramírez et al., 2009）。除了经济限制外，操作上的挑战还包括酶促水解系统对高能量的需求、对化学输入的依赖以及与工业规模实施相关的挑战（Ramírez et al., 2009）。先前的技术经济分析表明，工艺设计和操作条件强烈影响酶促生物处理的能源效率和运营成本，强调了低能耗配置对工业可行性的重要性（Climent Barba et al., 2022）。

正如研究中的技术经济建模框架所报告的，玉米湿磨过程中酶促水解的规模化主要受酶成本和pH控制的限制；模型假设玉米进料速率为106,000千克/小时（含水量15%）。孵育阶段的蛋白酶用量达到12.12千克/小时，每年增加约144万美元的运营成本，而使用硫酸进行pH控制每年增加4.9万美元（Ramírez et al., 2009）。因此，迫切需要开发一种低成本、简单且可扩展的水解策略，能够在常温条件下运行，无需依赖纯化酶或复杂的工艺控制。尽管在酶促水解生产生物活性肽方面进行了大量研究，但大多数现有研究仍依赖于在受控pH和温度条件下的纯化酶。这些方法增加了工艺复杂性和成本，限制了其实际应用和大规模应用。然而，关于富含蛋白质的水果废物（如木瓜废弃物PPW）是否能够有效水解牛血（CB）并以经济高效的方式利用屠宰场废物生产小分子量的生物活性肽，仍存在研究空白。这种方法还可以减少AD过程中的蛋白质和氨相关抑制。未来的工作应优化水解条件，标准化酶活性，并将酶促处理与物理化学处理相结合。

在建立真正低成本和可持续的蛋白质废物水解策略方面仍存在关键研究空白，主要是因为酶成本是大规模应用EH的主要障碍。一个关键的科学挑战和知识空白是，水果废物（如PPW）是否可以直接作为未经提取和纯化的蛋白酶源，在常温（21°C）下高效水解CB，而无需温度控制、pH调整或添加试剂。同样，尚未证明这种原始酶源能否产生与使用纯化商业酶相当的抗氧化物丰富、低分子量（<3 kDa）的水解物。这些不确定性引发了一些关键问题：（1）酶促预处理的成本是否会使得整个过程不经济，还是能源节省能够抵消酶的费用？（2）未提取的PPW能否减少总酶需求？（3）粗PPW酶能否生成足够小的肽以产生有价值的生物活性和抗氧化产品？这些问题都通过受控批次测试得到了解答，本研究逐一进行了评估。

本研究证明了未经提取的PPW可以在常温无添加剂条件下直接水解CB蛋白质，产生具有增强抗氧化性能和减少有机物的水解物。为了验证这一假设，PPW被用作未经提取和处理的生物催化剂，水解性能通过蛋白质还原率（Pred）、游离氨基酸浓度（FAA）、挥发性固体减少率（VSred）、抗氧化活性（DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力TAC）以及傅里叶变换红外（FTIR）分析进行了评估。工艺优化采用中心复合设计（CCD）在响应面方法（RSM）框架内进行。

**2. 材料与方法**
2.1. 化学试剂
所有试剂均为分析级。使用ninhydrin方法（Sigma-Aldrich）测定水解物中的游离氨基酸（FAA）。使用三氯乙酸（TCA，1.5 M；Sigma-Aldrich）在FAA分析前沉淀蛋白质。使用二甲基亚砜（DMSO；Essential Grade，Sigma-Aldrich）和hydrindantin二水合物（96%，Acros Organics）制备ninhydrin试剂。使用2-丙醇（A.C.S.试剂，≥99.5%；Sigma-Aldrich）稀释样品。使用Bradford蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific?）进行蛋白质定量。使用2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH；Sigma-Aldrich）评估抗氧化活性，使用乙腈（Fisher Scientific，加拿大）在DPPH测定前去除蛋白质。使用总抗氧化能力测定试剂盒（MAK334；Sigma-Aldrich）测定TAC。缓冲液使用1 M醋酸钠（来自醋酸钠三水合物，99%，Thermo Scientific）和冰醋酸（ACS试剂，≥99.7%，Sigma-Aldrich）制备。甘氨酸（Sigma-Aldrich）用作氨基酸测定的校准标准。所有制备过程中使用去离子水以保持分析准确性。本研究的主要底物是CB和PPW，PPW在未经缓冲的常温条件下作为未纯化的蛋白酶源使用。

2.2. 底物
新鲜CB来自圣约翰斯的一家屠宰场。约翰的（位于加拿大纽芬兰和拉布拉多省），被分成若干等份，并在-20°C下储存，直到后续实验中使用。成熟的热带果木瓜被用来制备PPW（番木瓜蛋白水解物）。可食用的果肉被手动去除，果皮被用作酶的来源。这些果皮使用汉密尔顿研磨机（700瓦电机）研磨了2分钟。得到的物质形成了一种半固体浆液，作为粗酶源使用，无需任何化学或缓冲液提取或纯化步骤。这一过程代表的是物理破坏而非化学提取。虽然已知工业PPW的组成可能因加工条件而异，但本研究中使用成熟的热带果木瓜提供了一个一致且可重复的基底。整个实验流程如图1所示，概述了在优化条件下的水解程序以及随后的分析，包括Pred、FAA、VSred、FTIR和抗氧化活性测试。

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图1. 实验流程的示意图。

2.3. 条件设置和样品处理
反应混合物是通过结合PPW和CB按Design-Expert?软件（版本13，Stat-Ease Inc.）生成的实验设计中确定的比例来准备的。PPW和CB的用量是根据它们各自的VS含量计算的，以达到所需的浓度（g VS L?1）（Saady和Nazifa，2025），这两个因素在实验设计中被视为独立变量。称重后，将底物彻底混合，并加入蒸馏水至最终工作体积为50 mL。使用蒸馏水调整工作体积以最小化背景干扰并确保实验结果的一致性。每个混合物在200 mL玻璃反应器中（工作体积50 mL）在开放盖子下静态孵育。样品在1.2、24、96、168和190.75小时时采集（Lin等人，2022；Saady和Nazifa，2025；Zarea等人，2026），这些采样时间是基于RSM框架内生成的CCD选择的，以捕捉早期和延期的水解行为。对于pH和温度分析，从每个反应器中收集3 mL样品到15 mL试管中。测量使用校准过的pH/Ion 510仪表（Fisher Science Education，型号54X002630）进行。

Pred被用作蛋白质水解的操作指标，而VSred代表有机物的整体降解情况。这两个参数都是使用公式（1）计算得出的去除效率。

(1) 去除百分比 = (C0 ? Cf) / C0 × 100
其中Co是初始蛋白质浓度（对于Pred）或VS（对于VSred），Cf是选定采样时间时的相应浓度。

2.4. 分析方法
2.4.1. 固体测定
总固体（TS）和挥发性固体（VS）含量按照《水和废水检测标准方法》（Awwa，1998；Kelly Orhorhoro，2017）中的2540B和2540E方法进行测定。测量pH和温度后，每个15 mL试管轻轻倒置以实现均匀悬浮，然后静置10秒以使大颗粒沉淀。对于TS的测定，样品在105°C下使用VWR 1305U通用烤箱（VWR International，美国）烘干至恒重。干燥后的样品在550°C的马弗炉（Thermo Scientific? Thermolyne? Fisher Scientific，美国）中燃烧30分钟以测定灰分含量。TS表示为干燥残渣质量与原始湿样品质量的比率，而VS则计算为TS与灰分含量之差。

2.4.2. 蛋白质定量
蛋白质浓度使用Pierce? Bradford蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific?，Thermo Fisher Scientific，美国）按照制造商的说明进行测定。样品在6000 rpm下离心7分钟（VWR Clinical 200）以去除不溶性物质，然后使用上清液进行蛋白质测定。接着，将7 μL上清液与250 μL Bradford试剂在96孔微孔板中混合。混合物在室温下轻轻搅拌并孵育10分钟以形成颜色。蛋白质水平使用BSA校准曲线（0-2000 μg mL?1）进行定量，吸光度在BioTek Synergy H1多功能读数器上记录在595 nm处。

2.4.3. 游离氨基酸测定
FAA浓度使用 ninhydrin比色法测定，ninhydrin试剂的浓度为2%（w/v），制备方法参照先前的研究略有调整（Ruggeri等人，2023；Stauβ等人，2024）。通过将100 mg hydrindantin粉末（96%，Acros Organics）溶解在100 mL二甲基亚砜（DMSO；Essential Grade，Sigma-Aldrich）中并涡旋至完全溶解来制备hydrindantin储备溶液（1 mg mL?1）。对于ninhydrin试剂，将1 g ninhydrin溶解在37.5 mL DMSO中，然后加入340 μL hydrindantin储备溶液。加入醋酸钠缓冲液（12.5 mL；4 M，pH 5.5）以稳定反应pH；该缓冲液是通过混合醋酸钠三水合物（Thermo Fisher Scientific，美国；99%）和冰醋酸（ACS试剂，≥99.7%）制备的。试剂存放在室温下的暗容器中以防止降解。为了去除与蛋白质结合的干扰并分离FAA组分，向1 mL上清液中加入250 μL 1.5 M三氯乙酸（TCA；Sigma-Aldrich），样品与TCA的比例为4:1（v/v）。混合物轻轻倒置以确保均匀混合，在4°C下孵育10分钟，然后在9000 rpm下离心10分钟。离心后获得的清澈上清液用于进一步分析。在测定中，将10 μL经过TCA处理的样品上清液与90 μL制备好的2% ninhydrin试剂在1.5 mL试管中混合（样品与试剂的比例为1:9，v/v）。混合物在水浴中加热至85°C持续10分钟，然后在暗处冷却至室温5分钟。冷却后，将25 μL反应混合物转移到96孔微孔板中，并用225 μL新鲜制备的2-丙醇/水（50:50，v/v）溶液稀释。FAA吸光度在BioTek Synergy H1多功能读数器上在570 nm处测量，并根据甘氨酸校准曲线（0–2000 μg mL?1）计算浓度。

2.4.4. 游离氨基酸产率
FAA浓度指数用于量化初始蛋白质转化为FAA的转化率。每个时间点测得的FAA浓度根据之前的研究（Domínguez等人，2024）标准化到第0天的蛋白质浓度，并根据公式（2）进行计算。

(2) FAA产率 (%) = (FAA含量 (μg/mL) / 总蛋白质含量 (μg/mL)) × 100
其中FAA含量 (μg/mL) 是每个采样时间测得的FAA浓度，总蛋白质含量 (μg/mL) 指的是第0天的蛋白质浓度。

2.5. 抗氧化剂定量测定
2.5.1. DPPH自由基清除活性
抗氧化能力针对以下处理进行了评估：PPW对照、CB对照、加热失活酶的PPW（95°C处理30分钟）以及在优化浓度下的活性PPW–CB水解处理（PPW = 10.8 g VS L?1；CB = 3.2 g VS L?1）。抗氧化能力使用DPPH自由基清除测定法进行评估，方法有所修改（Chrzczanowicz等人，2008）。0.2 mM DPPH溶液通过将3.94 mg DPPH（Sigma-Aldrich）溶解在50 mL甲醇（Fisher Scientific）中并在4°C的暗瓶中储存来制备。为了减少甲醇中蛋白质沉淀引起的浑浊，在DPPH反应前向水解物和对照样品中加入乙腈（Fisher Scientific，加拿大），比例为1:1（v/v）。DPPH反应在1.5 mL微量离心管中进行，将150 μL乙腈处理过的样品与150 μL 0.2 mM DPPH溶液混合。在室温下黑暗中孵育30分钟后，短暂离心30秒以去除任何残留颗粒。然后，将200 μL上清液转移到96孔微孔板中，并使用BioTek Synergy H1多功能读数器在517 nm处记录三次吸光度。

为了校准，制备了1.0 mM Trolox储备溶液（Sigma-Aldrich）并在甲醇中系列稀释以获得0、10、25、50、75和100 μM的标准品。阴性对照包含150 μL DPPH溶液和150 μL甲醇，而空白对照包含150 μL样品与150 μL甲醇（不含DPPH）的混合物。然后使用公式（3）计算DPPH自由基清除活性（%）。

(3) 清除百分比 = (A0 ? A ? Ab) / A0 × 100
其中A0是DPPH溶液与甲醇混合后的吸光度（空白），A是样品与DPPH混合后的吸光度，Ab是仅与甲醇混合后的样品的吸光度（背景）。使用Trolox（0–100 μM）制备的标准曲线将结果表示为Trolox当量（μM TE）。DPPH自由基清除活性反映了自由基的淬灭能力，并不暗示特定的抗氧化机制。

2.5.2. 总抗氧化能力（TAC）测定
使用商业抗氧化剂测定试剂盒（MAK334，Sigma-Aldrich）（Akanchise等人，2024）根据制造商的说明测定水解样品的TAC（总抗氧化能力）。在分析之前，通过向每个样品的上清液中加入200 μL 1.5 M TCA（v/v）使蛋白质沉淀。混合物在9000 rpm下离心5分钟以沉淀蛋白质，然后收集清澈的上清液进行测定以最小化蛋白质干扰。该测定基于抗氧化剂将Cu2+还原为Cu+，形成的有色复合物在570 nm处测量。Trolox标准品通过将50 mM储备溶液的5 μL与245 μL超纯水稀释至1 mM工作溶液来制备，然后进行系列稀释（0–1000 μM）。每个96孔微孔板的孔中加入20 μL标准品或样品和108 μL反应混合物（100 μL试剂A + 8 μL试剂B）。在室温下孵育10分钟后，使用BioTek Synergy H1多功能读数器在570 nm处读取吸光度。

2.6. 傅里叶变换红外（FTIR）光谱
为了评估酶促水解过程中的结构和化学变化，对样品的固体组分进行了FTIR光谱分析。在特定时间点（第0天和第7天），从水解反应器中取出混合均匀的等份样品以确保整个浆液的代表性采样。这些样品在70–80°C下烘干24小时以去除水分并浓缩有机物质。大约0.5 g的干燥复合材料使用PerkinElmer Spectrum FTIR光谱仪（型号IR-C115599，PerkinElmer，美国）进行分析。光谱在4000至400 cm?1的范围内收集，分辨率为4 cm?1，以透射率（%）对波数（cm?1）作图。该分析用于定性评估水解过程中富含蛋白质的材料的功能团变化（Saady和Nazifa，2025；Zarea等人，2026）。

2.7. 酶促水解优化
本研究评估了不同的PPW和CB浓度组合，使用CCD（表1）确定。应用Design-Expert?软件（版本13，Stat-Ease Inc.）进行RSM（中心复合设计）以优化影响PPW–CB系统水解的关键参数。采用CCD（n = 3，α = 1.31607）来探索控制PPW–CB系统水解的关键参数。设计包括一个完整的23因子矩阵，每个因子点重复两次，加上六个轴向（±α）点也各重复两次，以及六个重复中心点，总共进行了34次实验运行。中心点重复用于估计实验误差并评估模型适用性。

表1. 中心复合设计（CCD）中的实验因素参数
| 因子 | 单位 | 最小值 | 最大值 | 编码低值 | 编码高值 |
|------------|-------------|-------------|-------------|------------|
| X1 | 时间（h） | 1.24 | 190.76 | ?1 ? 24.00 | +1 ? 168.00 |
| | PPW（g VS L?1） | 2.74 | 13.26 | ?1 ? 4.00 | +1 ? 12.00 |
| | | | 2.53 | 6.47 | ?1 ? 3.00 | +1 ? 6.00 |
| | | | PPW = 番木瓜废弃物；CB = 牛血 | | |
独立变量是反应时间（X1，A：24-168 h；编码为?1至+1）、PPW浓度（X2，B：4-12 g VS L?1）和CB浓度（X3，C：3-6 g VS L?1）（表1）。这些因子范围是基于文献数据和初步试验确定的操作限值。每个变量在五个编码水平（?α，?1，0，+1，+α）下进行评估，而Pred（%）、FAA（μg mL?1）和VSred（%）被用作响应变量。

根据建立的CCD模型，PPW和CB按实验设计定义的浓度组合（表S1）。反应时间、PPW浓度和CB浓度在实验设计中被定义为独立变量，同时在整个实验过程中监测pH和温度以跟踪反应环境的变化。实验数据随后被拟合到二阶多项式模型（方程（5）中，以确定最佳的水解条件。（5）Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β11X12+β22X22+β33X32+β12X1X2+β23X2X3+β13X1X3，其中Y代表因变量或响应变量（Pred、FAA或VSred）；β0、β1、β2、β3是线性项的系数；β11、β22、β33是二次项系数；β12、β23、β13是交互作用系数，X1、X2和X3分别是自变量（时间、PPW和CB）。进行了方差分析（ANOVA），以评估变量及其交互作用对响应变量（Pred、FAA和VSred）的影响，并评估所开发模型的变异性。使用决定系数（R2）和调整后的R2以及方差分析（ANOVA）来评估模型的适用性。生成了实验矩阵、二维（2D）等高线图和三维（3D）表面图，以可视化变量之间的交互作用。使用响应面方法（RSM）模型通过最大化Pred、FAA和VSred来优化酶促水解（EH）。确定了最佳解，该解对应于最高的期望值，并通过额外的实验进行了验证，从而确认了所开发模型的适用性。

3. 结果与讨论
3.1 通过响应面方法（RSM）优化酶促预处理
3.1.1 统计分析和模型性能
通过ANOVA评估的Pred、FAA和VSred的简化回归模型的统计显著性和有效性总结在表S2中。所有三个模型的F值都非常显著（Pred：323.41；FAA：1119.87；VSred：53.95；p < 0.0001），这证实了所选的二次模型结构适合用于建模EH过程。拟合不足测试不显著（Pred的p = 0.1274，FAA的p = 0.0746，VSred的p = 0.1176），表明模型能够充分描述观察到的数据，没有系统性的拟合不足（Mirsalari等人，2022）。对于所有响应变量，水解时间（A）、PPW浓度（B）和CB浓度（C）的线性效应都是显著的（p < 0.05），表明它们对响应变量有统计学上的显著影响。AB交互作用（时间×PPW）在所有模型中都是显著的，而其他两个交互作用因响应变量而异。高阶和二次项，包括A2、B2、A2B和AB2，描述了Pred和FAA浓度的非线性动态，而A2C项表示的曲率效应在Pred和FAA模型中都有观察到。这些结果表明，主要效应和交互作用项都对观察到的响应变化有所贡献（Kumar和Reji，2023）。
在当前的数据集中，在相同条件下进行的重复中心运行的残差方差低于其他设计点，特别是轴向点，导致完整的二次模型出现显著的拟合不足。文献中也有类似的报告，即高度精确的中心点与非中心点的大误差结合会产生显著的拟合不足（Taheri，2022）。因此，对所有响应变量拟合了简化二次多项式模型（方程S1–S3），以获得更稳定和可靠的预测。使用决定系数（R2）、调整后的R2和方差分析（ANOVA）来评估模型的适用性。得到的简化二次模型显示出强大的统计性能。R2值分别为Pred的0.9939、FAA的0.9976和VSred的0.9529，表明预测值与实验值非常接近（Renaud和Victoria-Feser，2010）。调整后的R2值（Pred：0.9908；FAA：0.9967；VSred：0.9352）考虑了模型复杂性的影响。预测的R2值（0.9854、0.9954、0.9100）很高，表明拟合良好。模型的精度很高，Pred（4.95%）和FAA（3.73%）的变异系数较低（表S3）。VSred的值略高（11.28%），对于固相消化的可变性是可以接受的（Ibrahim等人，2022）。对于Pred和FAA，在模型拟合之前应用了平方根转换，以改善方差均匀性和残差正态性（Taheri，2022）。
3.1.2 模型验证和诊断分析
预测值与实际值的图表和残差图表（图S1a-f）支持了模型的拟合。预测值与实际值的图表（图S1a-c）显示出强烈的线性关系，Pred（图S1a）和FAA（图S1b）在其范围内表现出良好的一致性，而VSred（图S1c）在较低值时仅有轻微的离散，但总体上仍保持良好的拟合。外部学生化的残差图表（图S1d-f）显示在控制范围内（±3.61）的随机和对称分布，表明数据具有同方差性且没有系统偏差（Morshedi和Akbarian，2014）。这些诊断结果表明模型满足回归分析的假设。
3.1.3 在不同水解条件下的蛋白质减少
响应面和等高线图（图2a和b）显示了水解时间和PPW浓度对Pred的正面交互作用。如图2a所示，随着两个变量的增加，水解程度稳步提高，在最高测试水平（168小时，接近12克VS L?1 PPW）时达到了大约99%。这表明时间和PPW浓度之间存在统计学上显著的AB交互作用（p < 0.0001）。这可以归因于在较高PPW浓度和较长反应时间下酶活性的增加，这增强了肽键的断裂并促进了蛋白质的溶解；因为有报告称较高的酶与底物比率显著提高了水解度和溶解度，在优化条件下可达到80-90%以上（Opazo-Navarrete等人，2022）。响应面的曲率反映了拟合的二次模型。使用Ananas comosus和Carica papaya的粗果渣，也报告了类似的蛋白质溶解度随时间增加的现象，其中水解在常温条件下改善了蛋白质的可用性（Ranasinghe等人，2021）。使用商业木瓜蛋白酶在60分钟内实现了高鱼蛋白溶解度，肽的分解在此之后继续进行（Himonides等人，2011）。在本研究中，使用PPW在168小时内实现了99%的水解，无需提取酶，表明使用粗PPW进行长时间水解可以实现高蛋白质溶解度。水解时间和CB浓度之间的交互作用（图2b）显示出类似的趋势，在酶富集条件下（12克VS L?1 PPW），水解在所有CB浓度范围内都有所增加。这表明足够的酶可用性可以维持不同底物浓度下的有效水解，确保连续的蛋白质分解，因为较高的酶与底物比率可以克服底物限制并减少蛋白水解过程中的抑制效应（Deng等人，2018）。这些发现与报告一致，即增加木瓜乳胶木瓜蛋白酶的浓度可以增强蛋白质溶解度，达到高达87.5%的产率（Medagoda等人，2024）。同样，使用低剂量的木瓜蛋白酶在常温pH条件下从猪-牛肉副产品中实现了高达90%的蛋白质溶解度（Lape?a等人，2018）。据报道，使用木瓜蛋白酶对猪血蛋白的水解可以使球蛋白的DH值达到约13%，白蛋白的DH值约为7%，而血浆蛋白的DH值在几小时内达到平台期（Jin等人，2020）。对于凤梨水解物，也有类似的报道，增加酶浓度（6-8%）和水解时间（4-6小时）可以将可溶性蛋白质提高到8.13毫克/毫升（Yumni和Rosida，2025）。
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图2. 等高线和3D表面图显示了木瓜皮废弃物（PPW）、牛血（CB）和水解时间对蛋白质减少（Pred）的交互效应。增加PPW剂量和延长水解时间增强了蛋白质降解，更高的CB负荷在更长的时间内进一步放大了Pred的减少。
3.1.4 自由氨基酸浓度（FAA）的响应面分析
3D表面和等高线图显示，FAA浓度随着水解时间和PPW浓度的增加而显著增加，在延长处理（168小时）和高PPW负荷（12克VS L?1）下达到超过2461微克/毫升的值（图3a）。随着水解时间的增加，延长的酶-底物接触使得肽键逐渐断裂，水解程度增加，持续的蛋白水解导致FAA增加（Zhou等人，2024）。这些趋势表明，在长时间暴露于粗PPW蛋白酶下，CB蛋白质逐渐转化为低分子量的氨基氮。观察到的FAA随PPW浓度增加而增加归因于酶可用性的增加，这增强了酶与底物的比率并加速了肽键的断裂。也有类似的报告，即增加酶负荷可以增加水解度和FAA的产生，直到达到最佳水平，之后空间阻碍可能会限制效率（Islam等人，2021）。通过延长酶-底物接触驱动的逐步蛋白水解已被证明可以增强FAA和水解程度，在酶处理脱盐卵白蛋白的过程中（Rungchang等人，2025）。使用菠萝中的木瓜蛋白酶对Pangasius sp.副产品的水解也报告了类似的时间依赖性增加，其中更长的孵育时间产生了更高的FAA（Nurdiani等人，2024）。对于黑水蝇蛋白，也有类似的报道，其中增加反应时间至24小时产生了高度的水解和功能性水解物（Abduh等人，2022）。水解时间和CB浓度之间的交互作用（图3b）也影响了FAA水平，FAA随时间在所有CB浓度上增加，但在较低的CB负荷下保持较低，表明当蛋白质输入在测试的CB浓度范围内受限时，氨基酸的可用性降低。这种行为反映了底物限制效应，即较低的CB浓度减少了肽键的可用性，从而限制了FAA的生成，尽管酶的存在足够。也有类似的观察，即增加底物和酶的可用性可以增强木瓜蛋白酶介导的水解过程中的水解度和氨基酸释放（Rosida等人，2021）。这种逐步的FAA积累反映了肽键的连续酶解，因为已知半胱氨酸蛋白酶，包括木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶和actinidin，在蛋白质水解过程中会产生时间依赖性的水解程度增加和小型肽的释放（Kaur等人，2023）。在像PPW这样的粗酶系统中，水解效率受到质量传递限制和底物可访问性的强烈影响。固体底物的酶水解发生在异质系统中，其中高固体负荷增加了粘度并降低了混合效率，从而限制了酶的扩散和与底物的接触。此外，CB和植物来源材料的复杂结构限制了酶的渗透，导致水解不均匀。尽管有这些限制，FA的持续增加表明蛋白水解活性随时间保持有效，使得蛋白质结构逐步分解为低分子量化合物（Rohrbach和Luterbacher，2021；Rosida等人，2021；Sun等人，2023）。
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图3. 等高线和3D表面图显示了水解时间与（a）木瓜废弃物（PPW）浓度和（b）牛血（CB）浓度对自由氨基酸（FAA）释放的影响。
3.1.5 在不同水解条件下VSred的RSM分析
响应面和等高线图（图4a–c）显示，VSred随着水解时间和PPW浓度的增加而逐渐增加，在最高测试条件下达到40%（图4a）。高蛋白质溶解度和有限的VSred之间的这种差异反映了PPW–CB系统的组成异质性。PPW含有大量的木质纤维素成分，包括纤维素、半纤维素和木质素，这些成分形成了结构上坚硬且难以降解的基质，限制了酶的访问性（Alonso等人，2025）。特别是木质素在多糖周围形成了物理和化学屏障，严重限制了植物生物质的生物降解和酶转化（Wo?niak等人，2025）。因此，虽然木瓜蛋白酶型半胱氨酸蛋白酶可以有效地水解CB蛋白质，但在没有特定预处理或纤维素分解和木质素分解酶系统的情况下，PPW的木质纤维素部分基本上保持未降解。
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图4. 等高线和3D表面图显示了水解时间、木瓜废弃物（PPW）和牛血（CB）浓度对挥发性固体减少（VSred）的影响。尽管时间×PPW的交互作用显著，但相对平坦的表面轮廓表明有机物的减少比Pred和FAA慢。水解时间和CB浓度之间的交互作用（图4b）进一步影响了VSred，在低CB负荷（3-4克VS L?1）下，延长水解实现了35-37%的减少，而在较高CB浓度（5.5-6克VS L?1）下，响应趋于平坦，最大减少量降至30%以下，表明增加CB浓度超过了粗PPW酶的有效水解能力，从而限制了整体的固体降解。单独增加PPW浓度（图4c）对VSred的影响很小，表明酶的可用性不再是唯一的限制因素。在这些条件下，非蛋白质和木质纤维素固体的持续存在可能限制了VS的进一步减少，即使蛋白质水解仍然活跃。因此，与Pred和FAA相比，较低的VSred值证实了在PPW-CB基质中蛋白质的溶解比总有机物的降解更为容易。这种选择性的降解行为对AD（动物消化）是有利的，因为它表明蛋白质成分被优先水解，而非蛋白质底物（如碳水化合物）仍然可用于后续的微生物转化和甲烷生产（Sun等人，2022年）。3.1.6 优化结果与分析 使用简化二次模型进行了数值优化，以同时最大化Pred、FAA和VSred。理想函数（表2）确定了最佳条件：水解时间为132小时，模型预测的Pred接近上限响应值2573.3 μg mL?1，FAA为39.74%，VSred为最高综合理想值。这些条件表明，延长水解时间和增加PPW的负荷有利于在拟合响应空间内同时提高Pred、FAA和VSred。预测的最佳值132小时位于实验范围（24-168小时）内，因此被用作数值最佳值，而168小时被保留为时间进程比较的上限。表2. 具有预测FAA和Pred理想值的最佳解决方案。目标时间（小时）PPW（克/升）CB（克/升）Pred（%）FAA（μg/mL）VSred（%）最大化FAA和Pred 132.27 310.83 13.21 4117.27 259 3.54 733.16 11.000 PPW = 木瓜废弃物；CB = 牛血；Pred = 蛋白质减少；FAA = 游离氨基酸；VSred = 挥发性固体减少。3.2 PPW–CB水解的时间进程行为 在完成RSM优化后，重新检查了三种选定的PPW和CB浓度（12–6、12–3和8–4.5克/升），进行了三次时间进程实验（0-168小时），以验证预测的趋势。在此阶段，监测了Pred、FAA的生产效率和pH变化，以确认随时间的水解行为。使用公式（2）计算每个时间间隔的FAA浓度指数（%），以评估从总蛋白质含量中生成的FAA的比例，直接衡量相对于蛋白质溶解的标准化FAA生产量。Pred随时间显著增加（图5a），与FAA同步。PPW–CB组合12–6和12–3克/升在168小时时几乎完全溶解（98%），而PPW 8克/升和CB 4.5克/升达到了91%，证实了所有比例下的有效蛋白质分解。Pred和FAA的同时增加表明，溶解的蛋白质进一步被切割成低分子量的肽和氨基酸，表明蛋白水解活动持续进行（Zhou等人，2024年）。FAA浓度指数（%）随着水解时间的延长而逐渐增加，PPW 12克/升和CB 6克/升的组合显示出最高的值。在168小时时，PPW 12克/升和CB 6克/升的组合FAA浓度指数最高，PPW 12克/升和CB 3克/升的组合居中，PPW 8克/升和CB 4.5克/升的组合最低，这证实了在恒定CB的情况下，较高的PPW浓度保持了更高的酶活性，从而维持了反应动力学并促进了更完全的水解。PPW 12克/升和CB 6克/升组合的持续优异表现与这些PPW负荷下的较高酶活性一致。在较低的有效酶-底物比例下，水解不完全可能是由于二次掩蔽效应，其中部分水解的肽形成聚集体，保护剩余的肽键免受进一步的酶攻击，即使在长时间反应后也是如此，这已在包括乳清蛋白在内的多种蛋白酶-底物系统中观察到（Vorob'ev，2025年）。据报道，在木瓜蛋白酶水解过程中，豆类蛋白质的FAA浓度增加了很多倍，例如鹰嘴豆（Cicer arietinum）在12小时处理后增加了118倍，小扁豆（Vicia lens或Lens culinaris）增加了95倍（Domokos-Szabolcsy等人，2024年），证实了木瓜蛋白酶型蛋白酶释放游离氨基酸的强大能力。FAA浓度随时间的逐渐增加反映了典型的酶促水解动力学，即蛋白质分解的初始快速阶段之后，由于底物耗尽和水解产物的积累，反应速率降低，这可能会对蛋白酶活性产生抑制作用（Figueroa等人，2023年；Qi和He，2006年）。本研究中使用的PPW和CB的初始物理化学特性在表S4中呈现。下载：下载高分辨率图像（488KB）下载：下载全尺寸图像图5. 在12-6、12-3和8-4.5克/升条件下，木瓜废弃物（PPW）与牛血（CB）水解过程中（a）蛋白质减少（Pred）、（b）游离氨基酸（FAA）产量和（c）pH值的时间进程曲线。pH值曲线（图5c）显示所有PPW-CB组合都出现了持续的酸化现象，其中12-6（PPW-CB，克/升）的pH值从6.24下降到4.06，对应其最高的FAA和Pred值。12-3（PPW-CB，克/升）降至4.15，8-4.5（PPW-CB，克/升）降至4.42。而CB对照组（CB-Ctrl）保持稳定（7.5-7.6），表明酸化是由有机酸积累驱动的，而不是自发蛋白质降解。FAA浓度最高的区域与pH值从6降至4的区域重合，这可能是由于酸性水解产物的积累。每个肽键在水解过程中断裂会产生一个羧基（–COO-）和一个α-氨基，新形成的羧基会释放H+离子；这种质子释放会改变酸碱平衡，从而在酶促水解过程中产生可测量的pH值下降（Camacho等人，2001年）。总体而言，这些时间分辨的曲线揭示了明显的生化相关性：较高的FAA和蛋白质溶解度与pH值下降密切相关，反映了蛋白水解的深度。蛋白水解是一个动态过程，在此过程中肽片段不断转化，导致反应混合物的组成以及游离氨基酸和中间肽的浓度随时间变化，因为酶特异性的肽键逐渐被切割（Vorob'ev，2026年）。在这种条件下，水解通常遵循“逐个”的机制，即完整的蛋白质逐渐转化为较短的肽和游离氨基酸（Hafeez等人，2025年）。3.3 蛋白酶生成的水解物的抗氧化性质 在优化条件下（PPW = 10.8克/升；CB = 3.2克/升），图6a-d显示了Pred、FAA和抗氧化活性。在对照组（PPW和CB）和热失活酶组（在95°C下加热30分钟）中，7天内（168小时）这些值基本保持不变，表明没有活跃的蛋白水解。在热失活的PPW组和CB对照组中，从第0天到第7天都持续存在明显的红色沉淀物（图7），表明完整的血液成分没有被酶降解；相反，测量的蛋白质浓度明显下降（从2123 μg/mL降至682 μg/mL），而FAA（9 μg/mL）或DPPH活性（20%）没有增加，表明这是非蛋白水解导致的损失。这种解耦表明蛋白质损失可能是由于沉淀、吸附或基质干扰，而不是酶促水解。相比之下，活跃的PPW-CB处理表现出酶依赖的变化，测量的蛋白质浓度下降。此外，FAA从9.20 μg/mL显著增加到1755 μg/mL，DPPH清除活性从15.57%提高到52.6%。这种增加归因于低分子量肽和游离氨基酸的释放，它们通过氢原子转移和电子转移机制捐赠质子或电子来中和DPPH自由基（Heim等人，2002年；Monteiro和Paiva-Martins，2022年；Pan等人，2020年）。同样，据报道，在优化的水解条件下，菠萝蛋白酶水解的糙米蛋白表现出强烈的自由基清除活性，达到76.62%的DPPH和52.96%的ABTS，表明菠萝蛋白酶生成的水解物可以在多种蛋白质底物上实现高抗氧化能力（Selamassakul等人，2016年）。随着时间的推移，DPPH自由基清除活性随时间逐渐增加，这与典型的酶促水解动力学一致，即蛋白质分解的初始快速阶段之后，由于底物耗尽和水解产物的积累，反应速率降低，这可能会对蛋白酶活性产生抑制作用（Figueroa等人，2023年；Qi和He，2006年）。本研究中使用的PPW和CB的初始物理化学特性在表S4中呈现。下载：下载高分辨率图像（591KB）下载：下载全尺寸图像图6. 在7天内，对照组（木瓜废弃物（PW）和牛血（CB）以及热失活酶组（PW:CB）中，（a）蛋白质减少（Pred）、（b）游离氨基酸（FAA）、（c）抗氧化活性（DPPH）和（d）总抗氧化能力（TAC）的变化。下载：下载高分辨率图像（558KB）下载：下载全尺寸图像图7. 随时间变化的活性和失活木瓜废弃物（PPW）和牛血（CB）混合物的水解进展的视觉比较。上图：活性系统（PPW-CB（ACT）），从第0天到168小时，混合物逐渐澄清，表明血液成分被广泛酶解。下图：相比之下，失活系统（PPW-CB（DEAC）从第0天到168小时都保持持久的红色沉淀物，表明在没有活性酶的情况下，血细胞和血红素物质没有被降解。3.4 傅里叶变换红外光谱分析（FTIR） FTIR光谱显示了未水解的CB（0小时）与用10.8克/升PPW和3.2克/升CB处理的PPW–CB样品之间的光谱差异，以及用12克/升PPW和3克/升CB处理168小时后的样品之间的差异（图8）。相应的FTIR峰位置和带位移在表3中总结。观察到与酰胺相关的带变化，这些变化与水解过程中的蛋白质修饰定性一致。这些变化与蛋白质的酶促水解相关，其中蛋白酶切割肽键，导致酰胺I和II带的变化，反映了蛋白质降解和结构修饰（Kristoffersen等人，2020年）。在高波数区域，酰胺A带从3269.6厘米^-1（第0天）移动到3263.6厘米^-1（PPW = 10.8克/升；CB = 3.2克/升），表明氢键环境的变化（Efthymiou等人，2022年）。C–H伸缩带从2926.3厘米^-1（第0天）移动到2922.2厘米^-1（水解样品），表明烷基团环境的变化（Howell等人，1999年）。酰胺I在1608.9厘米^-1，与α-螺旋和β-折叠中的CO伸缩相关，在水解样品中显著减弱，表明肽键连接的二级结构被破坏（Ganim等人，2008年）。这种减少表明有序的二级结构（包括α-螺旋和β-折叠）显著丧失，反映了酶促水解过程中的蛋白质展开和逐步片段化（Kristoffersen等人，2020年）。酰胺II从1583.6厘米^-1移动到1581.9厘米^-1，表明与蛋白质片段化相关的氢键变化（B?cker等人，2017年）。这种位移反映了N–H弯曲和C–N伸缩振动的变化，表明随着蛋白质结构在酶促水解过程中的逐步破坏，氢键网络发生了重组（Kristoffersen等人，2023年）。酰胺III带从1237.6厘米^-1（PPW = 10.8克/升；CB = 3.2克/升）移动到1235.5厘米^-1（PPW 12克/升；CB 3克/升），表明蛋白质主链振动的进一步修饰（B?cker等人，2017年；Haris，1999年；Yusuf，2023年）。这种位移与C–N伸缩和N–H弯曲振动的变化一致，反映了酶促水解过程中肽主链构象和相关二级结构元素的变化（Yan等人，2022年）。在指纹区域，C–O/C–N相关带从1026.2厘米^-1（第0天）移动到1034.7厘米^-1（PPW = 12克/升；CB = 3克/升）和1033.4厘米^-1（PPW = 10.8克/升；CB = 3.2克/升），这与水解过程中离子化官能团的变化一致（Yusuf，2023年）。这种变化反映了C–O和C–N官能团的变化，表明在不同处理条件下，肽结构和水解蛋白质片段的化学环境发生了变化（Sharma和Thakur，2025年）。总体而言，这些光谱变化证实了所应用的水解条件影响了PPW–CB系统内的蛋白质降解和结构重组，表明分子间相互作用和肽结构发生了条件依赖性的改变。表4将基于木瓜蛋白酶的水解条件以及先前研究中报道的水解程度（DH）与当前研究的蛋白质溶解度（Pred）结果进行了比较。需要注意的是，Pred并不直接等同于DH，因为DH反映了肽键断裂的程度，而溶解度也可能由部分水解或蛋白质变性引起。

图8. 牛血（CB）蛋白质在木瓜废弃物（PPW）水解前（对照组，第0天）和后的FTIR光谱（条件10.8:3.2和12:3（g VS L?1），第7天）。酰胺A、I、II、III以及C–O/C–N带的变化表明了氢键的形成、肽键的断裂和二级结构的破坏。

表3. FTIR峰位变化量化（cm?1）。

官能团 | 带类型 | 第0天（对照组） | 第7天（10.8:3.2） | 第7天（12:3） | 变化方向 | 解释
|-------|---------|------------|------------|------------|---------|
| N–H伸缩 | 酰胺A | 3269.5 | 9326.3 | 1—↓（轻微） | 氢键暴露，蛋白质展开 |
| C–H伸缩 | — | 2926.3 | 2922.2 | 2922.2 | 0↓ | 疏水侧链的减弱 |
| CO伸缩 | 酰胺I | 1608.9 | — | 带丢失 | 肽键断裂 |
| N–H弯曲 + C–N | 酰胺II | — | 1583.5 | 1581.8 | 6↓ | 自由胺和肽的形成 |
| C–N + N–H弯曲 | 酰胺III | — | 1235.5 | 1237.6 | 2↘ | 二级结构的破坏 |
| COO?/C–N伸缩 | 指纹峰 | 1026.1 | 1034.6 | 1033.3 | 6↑ | 低分子肽，氨基酸释放 |

表4. 本研究与其他相关研究结果的比较总结。

**注：** 本研究中报告的蛋白质溶解度（Pred）并不直接等同于水解程度（DH），因为DH反映了肽键断裂的程度，而溶解度也可能包括部分水解或蛋白质变性。

4. 过程的可扩展性和实际意义
本研究的一个主要优势是证明了未经提取或纯化的PPW可以直接在常温、无添加剂的条件下有效水解CB。这消除了通常阻碍大规模酶水解（EH）的主要经济障碍，特别是商业蛋白酶的成本以及控制pH和温度操作所需的基础设施。在21°C且无化学投入的情况下，能够实现高达99%的蛋白质溶解度和高达89.8%的初始蛋白质转化率（FAA浓度），使PPW成为工业废物转化的实用生物催化剂。

从操作角度来看，PPW具有几个优势。首先，它提供了极低成本的酶来源，避免了纯化酶带来的财务负担，后者每单位活性的成本通常要高几个数量级。其次，消除pH控制和加热显著降低了资本和运营支出，同时简化了设备要求。尽管有这些简化，水解性能在趋势上与文献中报道的使用纯化木瓜蛋白酶的传统系统相当。该过程还通过生成两种具有工业价值的产物支持循环经济的整合：（1）富含抗氧化剂的水解物，其DPPH清除活性提高了3.6倍，适用于食品、营养保健品或制药应用；（2）稳定的固体部分，作为厌氧消化（AD）的改进底物。FTIR光谱的变化以及FAA的增加和VS的减少在质量上与水解过程中的蛋白质修饰一致。为了支持工业应用，提出了两种可扩展的PPW辅助CB水解实施模型（图9）：

1. **现场水解（小型/中型屠宰场）**：水果废弃物被送到小型屠宰场设施进行PPW：CB水解，从而生产生物活性化合物和生物气体。
2. **集中水解（大规模处理）**：来自多个屠宰场的CB被运输到区域水解设施，在受控条件下进行水解。该模型实现了连续处理，确保了产品质量的标准化，并促进了高产量的抗氧化活性水解物的生产。所得到的稳定残渣可以进一步送往工业AD设施，潜在地减少了氨的抑制。基本的温度和pH控制以及封闭的处理系统对于管理气味、病原体和安全至关重要。

针对食品、营养保健品或制药肽市场的应用，还需要额外的步骤，如巴氏杀菌、内毒素筛查、细胞毒性检测和法规合规性检查。对于仅用于AD的应用，当前的水解过程减少了腐败并稳定了材料，便于后续的AD处理。

总体而言，PPW辅助的水解将两种丰富的废物流CB和木瓜残渣整合到一个循环经济过程中，产生了高价值的抗氧化肽和适合AD处理的固体。这种双输出路径减少了环境负担，降低了与商业酶相比的处理成本，并扩大了能源回收和产品多样化的机会。

5. 局限性和未来工作
本研究证明了PPW可以作为实用的、低成本的生物催化剂，用于屠宰场血液的转化，为工业应用提供了一条切实可行的途径，且处理要求较低。通过消除酶提取、pH控制和温度调节，该方法直接解决了通常阻碍酶水解大规模应用的主要经济障碍。该过程完全在常温（21°C）下进行，且不使用化学添加剂，但在实验室规模上实现了高蛋白质减少、FAA浓度增加和抗氧化活性提升。尽管本研究确立了技术可行性，但在工业应用之前仍需解决几个限制。例如，本研究未包括氨基酸分析、肽大小分布或分子表征，因为其主要目标不是确定PPW是否能在未经缓冲的常温条件下直接生成可测量的FAA和抗氧化活性，以及这种转化的强度和速度。未来的研究应具体调查肽大小分布（例如<3 kDa的组分）、氨基酸组成和结构-活性关系，以确定负责抗氧化活性的化合物。此外，当前工作未评估能源需求、反应器配置、传质限制或全成本结构。这些工程和经济因素必须通过技术经济分析和生命周期评估来确定该过程在试点和工业规模上的可行性。此外，还应优化反应器设计、混合条件和固液相互作用，以解决在异质PPW–CB系统中观察到的潜在传质限制。环境效益也未在研究中量化，未来工作应通过甲烷产量、氨含量和稳定性测量来进行评估。此外，在长时间水解过程中使用开放的非无菌条件可能会引入微生物活动，这可能影响蛋白质降解和代谢产物的形成；因此，不能完全排除微生物过程的贡献。虽然使用热失活的对照组支持了酶活性的作用，但未来的研究应纳入无菌或过滤的酶对照，以进一步区分酶和微生物的贡献。

最后，建议与其他水果来源的粗蛋白酶（特别是来自菠萝和猕猴桃的废弃物）进行基准测试。这些废弃物含量丰富，含有强烈的蛋白水解活性，可能提供不同的性能特征。比较研究应评估不同水果废弃物的水解效率、酶活性稳定性和产品质量，以确定PPW是否是最优选择或更广泛的废物衍生酶平台的一部分。

6. 结论
本研究展示了一种低成本、无添加剂的策略，使用未经提取的木瓜废弃物（PPW）在常温、无缓冲条件下进行牛血（CB）水解，无需调整pH或加热。在优化条件下，该过程实现了高达99%的蛋白质减少（Pred），游离氨基酸（FAA）浓度超过1200 μg mL?1，挥发性固体（VSred）减少了约40%。同时，抗氧化活性显著增加，DPPH自由基清除率从14.47%上升到52.6%，TAC从17.8 μM Trolox当量增加到41.4 μM。傅里叶变换红外（FTIR）分析通过酰胺I的丢失和酰胺II/III带的变化证实了蛋白质结构的降解，表明肽键的断裂。抗氧化剂丰富的水解物和改善的厌氧消化底物特性的同时产生，突显了这种方法的双重价值。生成的水解物在食品、营养保健品和制药行业中具有潜在应用，因为它们具有生物活性和抗氧化特性，而稳定的残渣适合增强生物气体生产。此外，高蛋白底物（如CB）的预处理可能有助于减轻厌氧消化过程中的氨相关抑制。

总体而言，这种方法提供了一种实用且可扩展的替代方案，解决了废物转化中的关键成本和操作限制。通过将生物活性化合物的回收与改进的生物气体生成潜力相结合，该方法支持了循环经济框架。未来的工作应集中在工艺放大、技术经济评估和其他富含酶的水果废弃物的比较评估上，以进一步确定其工业适用性。