青蒿在炭化过程中的化学成分变化及其与颜色特性的相关性——用于质量控制

《Talanta Open》：Chemical Composition Changes of Artemisia Frigida during Carbonization and Their Correlation with Color Characteristics for Quality Control

　　薛莉|张伟|张倩|任布|匡园园|辛红丽|赛娜|陈建平
内蒙古医科大学药学院，中国内蒙古自治区呼和浩特市 010110

**摘要**
Artemisia frigida Willd. 是一种传统的蒙古草药，其临床效用因炭化处理而得到增强。然而，其加工过程依赖于主观的颜色判断，缺乏客观的质量标准。为了明确炭化过程中的化学变化模式并建立客观的评价标准，本研究建立了11批原始样品和炭化样品的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等化学计量方法筛选差异成分，并通过高效液相色谱-量子阱串联质谱（HPLC-Q-Exactive-MS/MS）进行进一步鉴定。同时，测量了样品的颜色参数（L*、a*、b*），以分析与潜在化学标记物的相关性。结果表明，原始样品和炭化样品的指纹图谱相似度很高（>0.90），共鉴定出40种成分（包括12种黄酮类、11种有机酸和14种苷类）。确定了6种关键差异标记物（如绿原酸、异绿原酸A）。值得注意的是，HPLC指纹图谱中的第13峰（chrysoeriol-4′-O-β-D-glucuronide/tricin-7-O-glucuronide）与L*（r=0.938）和b*（r=0.929，p<0.01）呈显著正相关。本研究阐明了Artemisia frigida在炭化过程中的化学变化规律，建立的色-化学相关性为制定客观质量标准提供了科学依据，有助于蒙古草药加工的标准化。

**引言**
根据中医理论和民族医学体系，许多草药需要经过加工以改变其治疗作用。加工的基本目的是转化草药的生物活性，例如炒制至炭化的过程。炭化草药具有悠久的应用历史，特别是在治疗出血性疾病方面，临床应用可追溯至两千多年前[1]。Artemisia frigida Willd.（俗称Xiao Bai Hao、Leng Hao或Tumao Hao）是蒙古医学、藏医学和中医中常用的草药。这种属于菊科的小灌木广泛分布于中国各地，尤其在内蒙古的草原地区，具有重要的药用价值，常用于治疗多种疾病[2,3]。
Artemisia frigida的临床应用在经典医学文献中有详细记载，包括蒙古医学著作《Unmistakable Mongolian Medical Mirror》和藏医学经典《Four Medical Tantras》，其应用历史超过千年[4]。在蒙古传统医学中，Artemisia frigida因其止血和抗炎作用而被广泛用于治疗关节炎、风湿性疾病、各种出血症、关节肿胀和妇科疾病[5,6]。传统临床实践和现代药理学研究表明，炭化后的Artemisia frigida比原始草药具有更强的止血效果[7,8]。现代植物化学研究还发现了该植物中的多种生物活性成分，如黄酮类[9,10]、倍半萜类[11]和香豆素类[12]。目前，炭化Artemisia frigida的加工主要依靠经验判断，操作者通过观察颜色变化来确定最佳加工终点，通常描述为“炒至炭化同时保持其本质”（Chao Tan Cun Xing）。这种主观方法缺乏客观、可量化的标准，导致产品质量不稳定和治疗效果波动。因此，建立基于科学依据的加工终点和质量评估标准至关重要。炭化引起的化学变化是其药效和物理性质（如颜色）改变的根本原因。尽管以往的研究主要集中在原始Artemisia frigida的化学成分和药理活性上[13,14]，但针对炭化过程的系统化学变化研究仍有限。特别是这些化学变化与视觉评估的颜色参数之间的关系尚未明确，这一知识空白阻碍了加工条件、化学成分和最终产品质量之间客观标准的建立。本研究结合了高分辨率色谱技术（HPLC）、质谱（HPLC-Q-Exactive-MS/MS）、化学计量分析和比色法，旨在：（1）阐明Artemisia frigida在炭化过程中的化学变化；（2）建立关键化学标记物与颜色参数之间的相关性；（3）制定炭化的客观质量控制标准。本研究旨在规范蒙古草药加工，并为其他炭化草药的加工提供方法学参考。

**材料与方法**
2.1. 材料和试剂
用于流动相的HPLC级乙腈购自MREDA Technology Inc.（美国）。HPLC用磷酸和甲醇溶剂购自天津金东天正精细化工试剂厂（天津）。超纯水（25°C时电阻率为18.2 MΩ·cm）使用Millipore Milli-Q纯水系统（Merck KGaA，德国达姆施塔特）纯化。绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和芦丁的参考标准品（纯度>98%）购自上海世峰科技有限公司（上海）。其他化学试剂均为分析纯。
2.2. 样品采集与制备
从中国多个供应商处采集了11批Artemisia frigida样品（S1-S11），包括锡林郭勒盟、通辽、赛汉乌拉（内蒙古）、吉林、黑龙江、河北、河南和青海等地。所有样品的植物学鉴定由药学院薛燕教授完成。
按照先前建立的方案[15,16]，将Artemisia frigida在220°C下炒制20分钟。每批样品同时采集原始样品（R1–R11），随后将所有22批样品研磨成粉末，通过40目筛网，准备进一步分析。
2.3. 质谱数据采集
质谱分析使用Thermo Fisher Scientific公司的Q-Exactive Orbitrap质谱仪，配备电喷雾离子化（ESI）源。检测模式为正负离子模式，扫描类型为Full MS/dd-MS2。Full MS分辨率设为70,000，dd-MS2分辨率设为17,500。源参数如下：鞘气流量30 L/min；喷雾电压3.50 kV（正离子）和2.80 kV（负离子）；离子传输管温度300°C（正离子）和400°C（负离子）；辅助气体温度200°C（正离子）和100°C（负离子）。碰撞能量（CE）分别为正离子模式45 eV和负离子模式30 eV。
2.4. HPLC数据采集
HPLC分析使用Thermo Fisher Scientific公司的Vanquish core HPLC系统。色谱柱为Agilent TC-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），温度设定为35°C。流动相由2%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）组成，梯度程序如下：0–7 min，6%–18% B；7–28 min，18%–26% B；28–29 min，26%–38% B；29–49 min，38%–65% B；49–60 min，65%–88% B。流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL。检测波长为360 nm。
干燥后的粉末样品（1.000 g，通过40目筛网）精确称重，用80%甲醇（v/v）在50°C水浴中超声提取30分钟。冷却至室温后重新称重，补足重量，用80%甲醇调整至初始重量。提取物通过0.45 μm膜过滤器过滤后装入小瓶中，储存在4°C下待分析。
2.5. UPLC指纹图谱方法建立
**特异性**：将用于样品提取的空白溶剂（80%甲醇）在2.4节所述的色谱条件下注入并分析。将空白色谱图与原始样品和炭化样品的色谱图进行比较，检查是否在常见特征峰的保留时间出现干扰峰。
**精度**：按照2.4节所述方法制备相同测试溶液，在相同色谱条件下连续注入6次。以峰1（绿原酸）为参考峰，计算每个特征峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算其RSD值以评估精度。
**稳定性**：按照2.4节所述方法制备相同测试溶液，在制备后0、2、4、8、12和24小时在相同色谱条件下进行分析。计算常见特征峰的相对保留时间、相对峰面积及其RSD值，以评估溶液在24小时内的稳定性。
**重复性**：按照2.4节所述方法制备6份平行测试溶液，在相同色谱条件下进行分析。以峰1（绿原酸）为参考峰，计算每个特征峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算其RSD值以评估重复性。
**相似性分析**：分别准确称量11批原始和炭化Artemisia frigida样品约1克。按照2.4节方法制备测试溶液，并在相同色谱条件下进行分析。将11批原始和炭化样品的UPLC色谱图导入中国药典委员会开发的《中药色谱指纹相似性评价系统》（2012版本）（AIA格式）。使用S5和T5作为参考光谱（SR、TR），通过多点校正后进行自动峰匹配，生成11批样品的指纹图谱。
2.6. 分光光度计数据采集
使用 Guangdong Threenh Technology Co., Ltd.（广州）生产的3nh YS6060分光光度计，在SCE模式下采集固体样品表面的颜色变化。经过黑白校准后，将粉末样品压紧放入石英比色皿中，测量L*、a*和b*值，E*ab值按公式E*ab = (L*2 + a*2 + b*2)1/2计算。每个样品重复测量6次以消除系统误差，取平均值。

**结果与讨论**
3.1. 化学成分分析
原始和炭化Artemisia frigida的TIC色谱图及相应的HPLC色谱图（负离子模式）见图1。使用Xcalibur 3.1软件进行质谱数据采集和分析，质量误差（δ）≤ 5×10??。基于文献和公共数据库（如ScienceDirect、PubMed）构建了化合物数据库。在正负离子模式下，共鉴定出40种成分，包括12种黄酮类、11种有机酸、14种苷类、1种糖类和2种苯丙素类。为了鉴定和定位峰，选择混合参考标准品（绿原酸、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸B）在相同MS条件下进行分析，其总离子色谱图（TIC）见补充材料S1。化学成分的详细鉴定结果见表1。

**图1. 原始（A）和炭化（B）Artemisia frigida的TIC色谱图及相应的HPLC色谱图（负离子模式）。**
**表1. 通过HPLC-Q-Exactive-MS/MS鉴定的Artemisia frigida及其炭化产物中的化学成分。**

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**表1. Artemisia frigida及其炭化产物中化学成分的鉴定结果。**以峰1为参考，相对保留时间和相对峰面积的RSD分别低于0.87%和1.32%，确认测试溶液在24小时内保持稳定。重复性：同时准备了六个独立的测试溶液。以峰1为参考，相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于0.91%和1.65%，表明该方法具有良好的重复性。随后建立了HPLC指纹图谱。图2显示，在炒制过程中，A. frigida样品的化学成分发生了变化。将S1和T1的色谱数据以CDF格式导入“中药色谱指纹相似性评估系统（2012版本）”。分别将S3和T5设为参考谱。使用平均法，时间窗口宽度为0.1分钟，进行多点校准和峰匹配，得到原始（S1）和炭化（T1）A. frigida的叠加指纹图谱和参考指纹图谱（SR, TR）。在原始A. frigida样品中标记了20个共同峰，在炭化A. frigida样品中标记了16个共同峰。通过与参考标准的比较，峰1被鉴定为绿原酸，峰5为芦丁，峰9为异绿原酸A，峰10为异绿原酸B。原始A. frigida样品（S1）的指纹图谱与参考指纹图谱（PR）之间的相似度值分别为0.974、0.967、0.985、0.920、0.993、0.981、0.982、0.985、0.990、0.984和0.989，均大于0.90。炭化A. frigida样品（T1）的指纹图谱与参考指纹图谱（TR）之间的相似度值分别为0.912、0.922、0.907、0.943、0.984、0.937、0.956、0.982、0.907、0.991和0.905，均大于0.90。两种样品之间化学成分的高度相似性不仅表明了原始A. frigida批次间质量的一致性，也表明了加工后炭化产品批次间质量的一致性。由于检测原理和目的的不同，HPLC指纹图谱和HPLC-Q-Exactive-MS/MS分析中的峰编号是独立的。HPLC指纹图谱中的共同峰根据其保留时间和360纳米处的UV吸收响应依次编号。相比之下，HPLC-Q-Exactive-MS/MS分析中的峰是根据鉴定出的化学成分进行编号的。HPLC指纹图谱中的所有共同特征峰都通过HPLC-Q-Exactive-MS/MS得到了明确的表征和鉴定，其相应的化学成分在表S1中列出，确保了本研究中的峰注释的准确性和一致性。

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图2. 原始和炭化Artemisia frigida样品的HPLC指纹图谱和参考指纹图谱（SR, TR）。

3.3. 多变量统计分析
3.3.1. 聚类热图分析
将11批原始和炭化A. frigida指纹图谱中的23个共同峰的峰面积（缺失的峰面积记录为0）导入在线平台www.bioinformatics.com.cn。聚类方法为ward.D2，距离方法为欧几里得距离，数据使用Z分数进行标准化。得到的聚类热图如图3A所示。样品明显分为两组：原始A. frigida（S1～S11）和炭化A. frigida（T1-T11）。这表明炭化后化学成分发生了显著变化。比较炭化前后各组分的趋势，发现大多数化学成分有所减少。峰11、14和20是炭化后新形成的化学成分。HPLC指纹图的峰编号进行了重新分配，HPLC指纹图谱峰编号与HPLC-Q-Exactive-MS/MS峰编号之间的对应关系详见补充表S1。

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图3. 样品中化学成分的综合分析。（A）原始（S1-S11）和炭化（T1-T11）Artemisia frigida样品的聚类热图。（B）原始和炭化Artemisia frigida样品中23个共同峰的相关系数图。

3.3.2. 相关性分析
将11批原始和炭化A. frigida指纹图谱中的23个共同峰的峰面积（缺失的峰面积记录为0）导入在线平台www.bioinformatics.com.cn，进行Pearson相关性分析。Pearson相关系数用于衡量两个随机变量之间线性关系的强度和方向。它不能直接证明因果关系，但可以揭示变量之间的潜在关联模式，为后续探索因果机制提供初步线索[[17], [18]]。Pearson相关系数的绝对值越大，表示两个变量之间的线性相关性越强[19]。相关系数>0.8表示线性相关性非常高。对于Pearson相关性显著性检验，P<0.01表示两个变量之间的相关性极显著。23个共同峰的相关系数图如图3B所示。从图中可以看出，峰1与峰10、12、13；峰4与峰9、10、12、13；峰7与峰8、9；峰9与峰10、12、13；峰11与峰14；峰12与峰13；峰14与峰20；峰18与峰21之间存在强正相关。其中，峰10（异绿原酸A）与峰12（异绿原酸C）之间的相关系数为0.971，是所有变量对中最高的正相关。异绿原酸A和异绿原酸C是异构体；两者都是二咖啡酰奎宁酸衍生物，具有高度相似的生物合成途径，来源于相同的咖啡酸和奎宁酸前体。峰14与峰4、8、9、13之间存在强负相关，这可能是由于炒制过程中这些化学成分的高温热解所致。根据全扫描和MS/MS数据，准分子离子峰为[M?H]? m/z 497.1090，特征碎片离子为m/z 335.0770、179.0336、161.0230和135.0438。因此，峰14被推断为二咖啡酰奎宁酸的分子内脱水产物[21,22]。高温通过羟基氢键的断裂和水的丢失诱导了3,5-二咖啡酰奎宁酸的分子内脱水。在原始草药中，峰9（异绿原酸B）和峰10（异绿原酸A）与峰14之间存在强负相关，表明异绿原酸A和B在高温下发生了分子内脱水，形成了脱水二咖啡酰奎宁酸。

3.3.3. 主成分分析（PCA）
将11批原始（S1～S11）和炭化（T1～T11）A. frigida指纹图谱中的23个共同峰的峰面积导入SIMCA 14.1软件。使用共同峰面积作为变量，进行了PCA分析。得到的PCA得分图如图4A所示。原始和炭化A. frigida样品分别分布在Y轴的两侧，没有重叠，表明炒制后化学成分发生了显著变化。它们可以分为两组：S1～S11聚在一起，T1～T11也聚在一起，这与聚类热图结果一致，表明分析结果可靠。在PCA-X模型中，R2X（解释的方差比例）为0.993，Q2为0.723，表明数据拟合良好。

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图4. 样品中HPLC衍生化学特征的化学计量可视化。（A）11批原始和炭化样品的PCA得分图。（B）11批原始和炭化样品的OPLS-DA得分图。（C）差异组分的VIP图。（D）OPLS-DA分析的S-图。（F）OPLS-DA模型的200次排列检验。

3.3.4. 正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）
此外，还使用监督OPLS-DA模型进一步分析了化学成分的显著变化，如图4B-F所示。模型参数包括R2X（0.86）、R2Y（0.985）和Q2（0.97），均大于0.74，表明模型的解释能力、可靠性和预测能力良好。200次排列检验显示，Q2回归线的截距低于-0.05的阈值，所有排列后的数据点都位于原始点的左侧，表明OPLS-DA模型拟合良好，没有出现过拟合的迹象。结果表明，11批原始和炭化A. frigida样品被清晰地分为两个不同的类别，这与聚类热图和PCA结果一致，但分离度比PCA更明显。根据投影中的变量重要性（VIP）值>1，筛选出了六个关键差异标记。VIP值从高到低依次为：HPLC指纹图谱峰13（对应HPLC-Q-Exactive-MS/MS峰26和27：金雀花素-4′-O-β-D-葡萄糖苷/三芹素-7-O-葡萄糖苷）> HPLC指纹图谱峰10（对应HPLC-Q-Exactive-MS/MS峰24：异绿原酸A）> HPLC指纹图谱峰1（对应HPLC-Q-Exactive-MS/MS峰7：绿原酸）> HPLC指纹图谱峰19（对应HPLC-Q-Exactive-MS/MS峰37：三芹素）> HPLC指纹图谱峰12（对应HPLC-Q-Exactive-MS/MS峰25：异绿原酸C）> HPLC指纹图谱峰3（对应HPLC-Q-Exactive-MS/MS峰15：异山茶苷）。这一顺序与VIP参数的S-图（图4C和4D）中的模式一致。在S-图中，组分距离原点的距离反映了其对组别分离的贡献。峰13、10、1、12、19和3位于原点较远的位置，证实了它们在分类中的重要作用。出现在左下象限的组分在原始A. frigida中含量较高，而位于右上象限的组分，如峰20、11和14，在炭化样品中的含量较高。尽管峰20、11和14可能是炭化后新生成的组分，但由于它们更接近中心，因此在区分两组方面的贡献较小。因此，这六个组分被验证为后续建模和差异分析中重要的变量。

3.4. 颜色特征分析
基于分光光度计的响应，使用L*、a*和b*值客观表征了原始和炭化状态下A. frigida粉末的颜色。整体色度评估的结果如图5A-D所示。L*表示亮度，值越高表示亮度越大。a*表示红绿坐标，正值偏向红色，负值偏向绿色。b*表示黄蓝坐标，正值表示黄色，负值表示蓝色。E*ab是从L*、a*和b*值得出的总色度值，可以客观量化单个样品的总体颜色强度[20]。使用ΔEab量化成对样品之间的颜色差异，当ΔEab>1.5时，表示颜色差异明显[23]。

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图5. 样品颜色特征的可视化效果。（A）L*、a*和b*值的三维散点图。（B）不同组中E*ab变化的径向条形图。（C）每个样品的E*ab值热图。（D）关键化学组分与色度参数的相关性分析。

如图5所示，炭化后所有颜色参数均发生了显著变化。L*值显著下降，表明样品变暗了很多。a*值普遍增加，表明向红棕色转变。b*值大幅下降，反映了黄色的减少。这些变化共同表明了从原始样品的亮黄绿色到炭化样品的深棕色的颜色转变。此外，每对原始和炭化样品之间的颜色差异用ΔEab计算。所有E*ab值（范围为30.48至41.56）均超过了1.5的感知阈值，表明炭化引起的颜色变化不仅在统计上显著，而且在视觉上也非常明显，证实了加工方法对材料外观的显著影响。为了研究炭化前后Artemisia frigida的关键化学组分与其视觉颜色之间的内在关系，我们对VIP值大于1的筛选组分与颜色参数（L*、a*、b*、E*ab）进行了Pearson相关性分析，旨在识别与颜色变化显著相关的标记组分。研究结果显示，在通过VIP筛选的关键化合物中，大多数成分与颜色参数L*（亮度）和b*（黄蓝色度）之间存在显著的正相关关系（p < 0.01），表明这些成分的变化直接影响了样品的亮度和黄色调。值得注意的是，红绿色度（a*）与绝大多数VIP成分之间没有显著的相关性，这与全成分分析的结果一致。这进一步表明，红绿色轴上的变化可能主要由非VIP关键成分主导。其中，成分13与L*值的相关性最高（r = 0.938，p < 0.01），表明该成分可能是影响样品亮度的关键化学基础，也是炭化前后颜色变化的主要因素。成分13也与b*值高度相关（r = 0.929，p < 0.01），表明它可能直接参与了黄色的形成。这些显著的相关性表明，颜色测量可以间接反映VIP关键化合物的整体变化趋势，为未来基于颜色参数开发快速评估模型提供了可能性。特别是，E*ab（总色差）与多个VIP成分的同步变化初步支持了使用色差作为加工终点确定补充标准的潜力。

**结论**
依赖传统的经验判断来确定炭化药品的加工终点（如“在保持其本质的同时进行炒制至炭化”）具有高度主观性，这对蒙药生产的工业化和标准化构成了重大挑战，最终无法保证临床供应的一致性和可靠性。相比之下，本研究建立了一种综合分析策略，结合了化学指纹图谱（HPLC）、高分辨率质谱（HPLC-Q-Exactive-MS/MS）、化学计量学和比色法。该方法系统地数字化并分析了A. frigida在炭化前后的特征变化，提供了更全面、客观和多维的质量评估框架。研究成功将定性的经验概念转化为可量化的化学和比色指标，实现了原材料和加工材料之间的精确区分。

具体而言，通过PCA和OPLS-DA多变量分析，识别出六个关键差异化学标记物，其VIP值大于1，分别是chrysoeriol-4′-O-β-D-glucuronide、tricin-7-O-glucuronide、isochlorogenic acid B、chlorogenic acid、tricin和isoschaftoside。其中，chlorogenic acid衍生物（尤其是isochlorogenic acid A）在炭化后显著减少。chlorogenic acid通过quinic酸和caffeic酸之间的酯键形成，在高温下容易发生降解和分子内脱水。同样，热不稳定的黄酮类化合物和黄酮苷的含量也减少了[24]，其中HPLC指纹图谱峰13（对应于MS峰26和27）与L*（r=0.938）和b*（r=0.929）之间存在极显著的正相关关系**。

加工后，A. frigida的颜色从黄绿色变为深棕色，L*和b*值显著降低，而a*值增加。特定标记物与客观颜色参数（L*、b*）之间建立了强相关性。这架起了数百年来经验评估与现代分析科学之间的桥梁，为开发“基于颜色辅助、成分验证”的质量控制协议提供了直接基础。这些化学变化为传统上对其性质改变的描述提供了物质基础。经典文献如《蒙古药典》中提到：“Chagan-Xibaga（A. frigida）的炭黑色质具有神奇的止血效果”，《 Jing Zhu Ben Cao》将其归类为“性凉的止血药”，炭化后变为温性并促进凝血[25]。峰13黄酮苷的热降解以及假定的脱水二咖啡酰奎宁酸的形成，阐明了这些古代文献中记录的疗效和性质的变化。

然而，本研究也存在一定的局限性。尽管分析了来自主要地理来源的11批样品，但未来研究可以扩大样本量，以进一步验证和完善已识别的标记物和相关性，提高模型的可靠性和普遍性。更重要的是，虽然本研究明确了整体化学变化情况，并确定了假定的脱水二咖啡酰奎宁酸作为主要的新成分，但这一新成分的止血机制及其对止血效果的潜在贡献（即光谱效应关系）仍有待进一步研究。关于“炭化保持本质”和“炭化增强凉血和止血效果”的传统理论的完整科学解释，需要进一步药效学研究将这些化学变化与关键治疗结果联系起来。

**CRediT作者贡献声明**
Xue Li：正式分析、软件使用、方法学、验证、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。
Wei Zhang：软件使用、正式分析、数据管理、验证。
Qian Zhang：软件使用。
Ren Bu：方法学。
Yuanyuan Kuang：数据管理。
Hongli Xin：方法学、实验研究。
Na Sai：审稿与编辑。
JianPing Chen：资金筹集、概念构思、监督。

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