开发并验证了一种基于液相色谱-质谱/质谱联用（LC-MS/MS）的方法，用于测定人类尿液中与睡眠质量相关的生物标志物，以供临床检测使用

《Talanta Open》：Development and validation of a LC-MS/MS method for the determination of sleep quality-related biomarkers in human urine for clinical testing

　　李马 | 尤恩高 | 徐梦涵 | 刘志勤 | 李彦颖 | 张凤华
上海医药大学附属周浦医院实验医学系，中国上海市浦东新区周园路1500号，201318

**摘要**
本研究开发并验证了一种灵敏可靠的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于测定人尿液中的七种与睡眠质量相关的生物标志物（SQBs）：皮质醇、睾酮、17α-羟基孕酮、硫酸脱氢表雄酮、褪黑素、6-硫酸氧褪黑素和血清素。由于这些分析物的极性范围广泛，因此采用了两种不同的样品预处理方法：对于类固醇激素采用液-液萃取，而对于极性神经递质则采用一种新型的沉淀纯化策略。这两种新方法与双LC-MS/MS分析方法一起进行了优化。该方法表现出优异的线性（R2 > 0.99）、精确度（RSD < 15%）和回收率（85.85–111.57%），并且基质效应极小（88.47–97.03%）。该方法成功应用于70名健康志愿者的晨尿样本，建立了初步的参考区间。本研究为睡眠生物标志物的分析提供了可靠的工具，并为未来的临床和流行病学研究提供了支持。

**1. 引言**
睡眠障碍已成为一个重要的全球公共卫生问题。流行病学研究表明，普通人群中失眠的患病率在10%到15%之间，是第二常见的心理障碍[1]。睡眠障碍还与多种慢性疾病有关，包括内分泌失调、心血管疾病、认知功能障碍和心理健康障碍[2]。目前睡眠障碍的临床诊断主要依赖于主观问卷调查和客观的多导睡眠监测（PSG）。然而，经常观察到“睡眠状态感知错误”的临床现象，即患者主观报告严重的失眠，而PSG记录显示睡眠参数正常或接近正常[3]。这种频繁的差异挑战了仅依靠宏观结构睡眠相关参数来理解睡眠障碍的局限性。因此，迫切需要客观可靠的生物标志物来补充现有的诊断工具，以预防和管理与睡眠相关的健康问题。

睡眠-觉醒周期由复杂的神经内分泌网络调节，多种激素和神经递质在其中起着关键作用。本研究重点关注七种与睡眠质量相关的生物标志物（SQBs）：
(1) 褪黑素（MEL）及其代谢物6-硫酸氧褪黑素（aMT6s），它们是昼夜节律的核心调节因子，其分泌在夜间达到峰值，并受到光线的抑制[[4], [5], [6]]；
(2) 类固醇激素，包括睾酮（T）、17α-羟基孕酮（17α-OHP）、硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）和皮质醇（CRL），这些激素将睡眠质量与应激反应和代谢状态联系起来[[7], [8], [9], [10]]；
(3) 血清素（5-HT），它是睡眠启动和维持的关键神经递质，也是褪黑素合成的直接前体[11]。值得注意的是，松果体细胞分泌的5-HT通过自分泌机制增强去甲肾上腺素诱导的褪黑素释放[12]，而CRL和MEL表现出相反的昼夜节律[13]。选择这七种生物标志物确保了覆盖了睡眠生理学背后的神经内分泌调节途径。睡眠障碍或睡眠不足会改变这种分泌模式，从而破坏正常的睡眠结构和质量。

与其他生物样本（如血液和唾液）相比，尿液样本在睡眠医学研究中具有几个独特且重要的优势[[14], [15], [16]]。尿液收集是非侵入性的，与自然生理节律一致，对日常生活的影响最小，适合长期监测以及涉及儿童和老年人的特殊人群的研究，显著提高了参与者的依从性。晨尿中的激素水平代表了某一时间段内的累积浓度，而不是单点的瞬时测量值，这更适合捕捉与睡眠相关的整体激素状态[17]。因此，尿液已成为睡眠医学研究中不可或缺的生物基质，特别是在涉及昼夜节律[18,19]和内分泌评估[20,21]的研究中。

目前，这些生物标志物在生物样本中的检测主要依赖于两种主要技术：免疫测定和色谱-质谱技术。免疫测定（如ELISA、RIA）在临床实验室中广泛使用，操作简单、分析速度快且成本相对较低。然而，这种方法在同时测量多种分析物时存在显著局限性。对于结构相似的类固醇激素，交叉反应可能导致假阳性或假阴性结果[22]。6-甲基泼尼松龙和泼尼松龙在皮质醇检测中分别表现出249%和148%的交叉反应率，几种合成代谢类固醇可能在睾酮检测中产生临床显著的假阳性[23]。此外，传统的免疫测定通常灵敏度较低，难以准确量化尿液中的低浓度分析物[24]。近年来，色谱-质谱技术，特别是液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），已成为激素分析的“金标准”[25]。该技术结合了液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度和特异性，能够同时准确定量多种激素。研究表明，LC-MS/MS在检测这些低体内浓度且具有众多结构类似物的激素方面表现出优越的性能，具有高灵敏度（检测限达到0.01 - 10 ng/mL）和优异的线性（相关系数R2 > 0.99）[[26], [27], [28], [29]]。尽管LC-MS/MS在实验室研究中得到广泛应用，但针对尿液中SQBs的标准化检测方法仍不完善。

现有方法通常针对单一或有限数量的激素——例如，有一种方法仅检测尿液中的褪黑素、皮质醇及其代谢物，以反映睡眠和昼夜节律[30]，因此缺乏检测广泛SQBs的全面方案[31,32]。更重要的是，基于大样本量的明确参考区间缺乏，这对临床检测构成了重大挑战。为了解决这些问题，本研究旨在开发并验证一种用于测定人尿液中七种SQBs（MEL、aMT6s、T、17α-OHP、CRL、DHEAS、5-HT）的LC-MS/MS方法。此外，通过分析70名健康志愿者的样本，证明了该方法在更大样本群体中的适用性和可靠性。获得了健康个体晨尿中这些生物标志物的参考区间，为后续研究和临床应用提供了宝贵数据。

**2. 材料与方法**
2.1. 化学品和试剂
所有标准化合物，包括皮质醇（CRL）、硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）、睾酮（T）、17α-羟基孕酮（17α-OHP）、褪黑素（MEL）、6-硫酸氧褪黑素（aMT6s）和血清素（5-HT），均购自北京Manhag科技有限公司。目标分析物的理化性质列于表S1中。上述化合物的内标（ISs），包括CRL-d4、DHEAS-d6、T-d3、17α-OHP-d8、MEL-d4和5-HT-d4，也来自北京Manhag科技有限公司；aMT6s-D4购自天津Alta科技有限公司。无激素合成尿液购自福州Feijing生物科技有限公司。高效液相色谱（HPLC）级甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）由默克（德国）提供。Milli-Q水（MQ）由Millipore公司的Gradient A10 Milli-Q系统生产。乙酸乙酯购自天津Kermel化学试剂有限公司。HLB和Prime HLB固相萃取（SPE）96孔板购自Waters（上海）。

2.2. 标准溶液和内标的制备
根据尿液中的生理浓度差异，分别用纯甲醇制备了CRL、DHEAS、aMT6s和5-HT的100 μg/mL储备溶液，以及MEL、T、17α-OHP的1 μg/mL储备溶液。储备溶液储存在琥珀色小瓶中，温度为?20 °C。所有分析物分为两组（见2.3节）。然后通过将储备溶液与合成尿液稀释混合来制备校准标准，所有分析物的最终校准标准浓度见表1。混合IS溶液以1 μg/mL的浓度制备在甲醇中。

**表1. 目标分析物的校准范围、相关系数和定量下限（LLOQ）**
| 分析物 | 校准范围（μg/L） | 相关系数 | LLOQ（μg/L） |
| --- | --- | --- | --- |
| CRL | 10 - 1000 | 0.99 | 410 |
| T | 0.05 - 200 | 0.99 | 60.05 |
| 17α-OHP | 0.05 - 200 | 0.99 | 30.05 |
| MEL | 0.01 - 100 | 0.99 | 10.01 |
| DHEAS | 10 - 100 | 0.99 | 10 |
| 5-HT | 4 - 100 | 0.99 | 24 |
| aMT6s | 0.5 - 45 | 0.99 | 20.5 |

2.3. 样品制备
由于分析物的理化性质差异显著，因此采用了两种不同的预处理方法。

2.3.1. 分析物组1（CRL、T、17α-OHP、DHEAS和MEL）
将500 μL尿液/质量控制（QC）样本/校准标准与20 μL混合IS混合2分钟。然后加入1 mL乙酸乙酯，涡旋1分钟，在?20 °C下冷冻10分钟以促进相分离并减少乳化，接着以14,000 rpm离心10分钟。上清液转移到离心管中，在温和的氮气流下干燥至几乎干燥，然后用0.2 mL MeOH: MQ = 2:8（v/v）复溶，并用0.22 μm PTFE注射过滤器过滤，转移到插管小瓶中，待分析。

2.3.2. 分析物组2（5-HT、aMT6s）
将200 μL尿液/ QC样本/校准标准与20 μL混合IS混合2分钟。然后加入400 μL乙腈，涡旋1分钟。上清液加载到Prime HLB（SPE）柱上，加载前用1 mL ACN: MQ = 8:2（v/v）激活柱子。样品加载后立即流出的液体（含有目标分析物5-HT和aMT6s）为流出液。然后用1 mL ACN: MQ = 8:2（v/v）冲洗柱子，柱子洗脱步骤中流出的液体（含有残留的目标分析物）为洗脱液。收集流出液和洗脱液并合并。混合物转移到离心管中，在温和的氮气流下干燥至几乎干燥，然后用0.2 mL MeOH: MQ = 2:8（v/v）复溶，并用0.22 μm PTFE注射过滤器过滤，转移到插管小瓶中，待分析。

2.4. 仪器分析和条件
LC-MS/MS分析在超高效液相色谱（UPLC）系统上进行，该系统与三重四极杆串联质谱仪（AB Sciex Triple Quad? 4500，美国）连接，采用电喷雾离子化（ESI）模式。色谱分离在Thermo Hypersil GOLD C18柱（150 × 2.1 mm，5 μm）上进行，柱温设定为40 °C。采用二元洗脱梯度，流速为0.3 mL/min，进样体积为5 μL。由于两组分析物的理化性质差异显著且提取方法不同，因此开发了两种不同的LC-MS/MS方法：
(i) 方法A（用于分析物组1）使用0.2%（v/v）甲酸在MQ水中作为流动相A，LC-MS级甲醇作为流动相B；
(ii) 方法B（用于分析物组2）使用5 mM醋酸铵在MQ水中作为流动相A，LC-MS级甲醇作为流动相B。流动相梯度见表S2（a）和（b）。MS/MS参数设置如下：离子源电压为5500 V/?5500 V，离子源温度为500 °C，检测模式为多反应监测（MRM）。辅助气体压力设为55 psi，碰撞气体压力为9 psi，雾化气体压力为50 psi。优化后的MS参数见表S3。

2.5. 方法验证
根据EMA关于生物分析方法验证的指南（EMEA/CHMP/EWP/192,217/2010 Rev. 1 Corr. 2）[33]对分析方法进行了验证。评估了校准曲线的线性、精确度、回收率、定量下限（LLOQ）、选择性、稳定性和基质效应。

2.5.1. 校准曲线的线性
校准标准浓度范围见表1。通过绘制目标分析物的峰面积与内标峰面积的比值（y轴）与目标分析物浓度（x轴）的关系，使用1/x2加权线性回归构建校准曲线。计算了决定系数（R2）和反算浓度的准确性。除了在合成尿液中制备的基质匹配校准曲线外，还在相同浓度下用MeOH: MQ = 2:8（v/v）制备了溶剂校准曲线，以帮助评估基质效应。所有分析物的相关系数（R2）大于0.99被认为是可接受的，反算浓度与理论浓度之间的偏差应在15%以内（LLOQ为±20%），并且≥75%的浓度点满足上述要求。

2.5.2. 选择性
使用活性炭纯化6名健康个体的尿液样本，直至背景信号消失。

2.5.3. 精确度和回收率
通过将低、中、高浓度的目标化合物加入合成尿液中来评估回收率和准确性，最终测量浓度见表2。内部精密度是通过分析三个质量控制（QC）水平下的5个重复样品来评估的，而外部精密度则是在连续三天内进行的，结果与理论添加浓度（在纯溶剂中添加）进行了比较。回收率的接受标准为80% - 120%。精度的相对标准偏差（RSD）应在15%以内。表2. 尿液中7种分析物的回收率、精密度和稳定性测试结果。

分析物 空细胞 测量平均浓度（ng/mL） 回收率（%） 同日（%）（n = 5） 不同日（%）（n = 25） 稳定性测试
室温 自冻融 长期 自动采样器
CRLL 3.88 98.3 7.4 9.1 95.3 ±5.8 62.5 ±6.5 92.3 ±5.3 99.7 ±2.5
MQC 294.5 98.6 4.1 5.7 93.5 ±7.6 64.3 ±14.7 88.5 ±6.9 102.3 ±5.3
HQC 810.2 93.9 5.1 3.4 100.0 ±6.3 73.9 ±4.7 95.0 ±6.8 105.0 ±6.1

DHEA SLQC 4.05 98.8 16.8 8.4 94.7 ±7.2 70.3 ±4.5 96.5 ±3.0 93.2 ±8.4
MQC 301.8 92.3 3.9 5.2 93.2 ±8.5 78.5 ±7.4 104.5 ±7.7 89.4 ±7.7
HQC 788.4 90.8 7.2 6.7 91.5 ±3.0 81.6 ±11.3 102.6 ±6.8 96.6 ±4.1

TLQC 0.39 99.7 9.5 10.9 95.2 ±7.5 70.5 ±8.8 118.1 ±9.5 104.3 ±4.4
MQC 7.85 103.4 5.4 7.1 88.4 ±4.3 58.7 ±9.2 92.5 ±7.2 103.0 ±4.2
HQC 16.18 96.8 3.1 4.8 93.5 ±6.6 67.2 ±5.3 95.8 ±4.0 100.9 ±8.6

17α-OHPL QC 0.41 96.9 4.7 10.5 92.9 ±5.9 65.4 ±6.9 113.7 ±11.0 103.0 ±3.6
MQC 8.06 99.9 8.8 6.4 104.6 ±6.4 59.2 ±8.9 106.4 ±8.2 94.2 ±6.5
HQC 15.92 89.1 3.8 10.1 93.0 ±8.2 78.8 ±7.4 98.7 ±2.9 96.6

MELL 0.18 89.8 7.0 10.4 98.1 ±7.4 46.0 ±8.9 90.5 ±4.2 90.5 ±3.1
MQC 1.82 85.8 9.9 6.7 105.8 ±4.9 38.4 ±13.7 80.6 ±7.3 93.6 ±3.7
HQC 4.06 99.1 6.4 9.9 98.8 ±8.8 58.2 ±6.3 93.6 ±7.9
5-HTL QC 41.5 88.5 7.1 8.9 98.8 ±9.1 39.4 ±9.6 87.8 ±8.4 97.1 ±6.8
MQC 297.3 88.7 11.7 13.1 108.7 ±9.2 47.5 ±16.2 85.0 ±11.4 90.5 ±4.3

2.5.4 稳定性和携带效应
稳定性测试包括室温稳定性、冻融稳定性、长期稳定性以及制备后样品的稳定性（在4°C下的自动采样器中的稳定性）。存储方法如下：i) 室温稳定性：样品在室温下存储4小时。ii) 冻融稳定性：样品在-20°C下冷冻并在室温下解冻，重复三次。iii) 长期稳定性：样品在-20°C下存储20天。iv) 自动采样器稳定性：处理后的样品在4°C下存储24小时。稳定性样品与新鲜制备样品之间的浓度偏差≤±15%，RSD<10%是可以接受的。稳定性验证测试应用了三个浓度水平（LQC：低质量控制，MQC：中等质量控制，HQC：高质量控制）。

为了估计携带效应，在最高校准水平后注射了一个空白样品，空白样品中的信号≤LLOQ的5%是可以接受的。

2.5.5 基质效应
由于所有目标分析物都是内源性成分，并且某些分析物的浓度很高，因此使用活性炭对6个人类尿液样品进行了纯化，直到背景信号...

2.5.6 稀释完整性
稀释完整性实验表明，浓度超过ULOQ的样品可以通过用合成尿液稀释2-3倍后可靠地定量。将1.5至2倍ULOQ浓度的样品按照上述方法处理，所有准确性和精度值在±15%范围内是可接受的。

2.6 该方法在临床样品和参考区间中的应用
为了评估所提出方法在实际尿液样品中的适用性和可靠性，以及确定目标分析物的参考区间，首先从自我报告的健康人群中收集了早晨的尿液样本（n = 70）。样本来自上海总医院的成年志愿者，包括22名女性和35名男性，年龄范围从23岁到67岁，中位年龄为41岁。

3. 结果与讨论
3.1 色谱条件的优化
为了开发适合所有分析物高效分离和检测的优化色谱条件，系统地评估了各种流动相系统对它们的保留时间、峰特性和响应的影响。基于水-甲醇系统，分别向水相中添加了甲酸、醋酸铵和氨，并评估了它们对色谱性能的影响。向水相中添加0.01%的氨获得了第1组分析物的最佳结果。在这些微碱性条件下，像T这样的分析物的峰面积增加了3.5倍，并且峰的对称性显著改善（如图1E所示，以T为例），这是由于在正ESI模式下离子化效率的提高[34]。在碱性条件下（0.01%氨，pH约10.6），类固醇激素如T（pKa约-1.2为质子化形式）是中性的，并且在正ESI模式下离子化效率提高。切换到酸性条件（0.2%甲酸，pH约2.7）会使碱性基团质子化，从而改变保留时间和降低响应。这解释了基于氨的系统对第1组分析物的优越性。相比之下，第2组中的极性神经递质（5-HT和aMT6s）在这种系统中的保留和离子化效果较差。5-HT作为神经递质组，在这种系统中几乎没有色谱峰（图1A），只显示出轻微的背景噪声，这表明其强极性限制了在微碱性条件下的保留。向水相中添加0.2%甲酸略微改善了神经递质的响应（图1B）。然而，出现了几个额外的峰。同时，第1组分析物的信号强度与基于氨的系统相比明显降低（图1F）。进一步使用5 mM醋酸铵（pH约6.86）作为流动相的实验获得了稳定的保留时间和2-3倍的信号增强（图1C），通过促进稳定前体离子的形成[35]。然而，在醋酸铵系统中，第1组分析物的响应降低。对于T，其色谱峰显示出轻微的拖尾和明显的峰面积减小（图1G）。即使将醋酸铵添加到0.2%甲酸溶液中，T的信号仍然比在氨系统中的弱（图1H），尽管5-HT的响应面积略有改善，但其峰形仍然宽且不规则（图1D）。

因此，随后建立了两种专门的LC方法：对于第1组分析物（主要是类固醇激素）使用基于氨的系统，对于第2组分析物使用醋酸铵缓冲系统，以确保两组分析物的最佳检测性能。

3.2 样品预处理程序的优化
使用通用SPE方法（HLB/Prime HLB）进行的初步实验未能实现所有分析物的满意回收率，因为极性和吸附剂亲和力的差异很大。像5-HT和aMT6s这样的高极性化合物很难通过反相相互作用吸附在HLB吸附剂上，导致加载过程中的显著损失。因此，需要开发两种特定于分析物的预处理方法。

3.2.1 第1组分析物的液-液萃取（LLE）
为了提高萃取效率并简化工作流程，采用了液-液萃取（LLE）方法。这种方法有效地去除了尿液样品中的蛋白质和干扰物[36]。在LLE方法中，分析物的色谱响应比使用HLB SPE萃取提高了7倍，比使用Prime HLB SPE预浓缩提高了3.7倍（图2显示了T的色谱图）。乙酸乙酯有效地减少了共萃取的基质成分，防止了乳液的形成，并显著提高了回收率和重现性。

3.2.2 第2组分析物的联合沉淀-纯化
极性分析物的萃取提出了不同的挑战。由于它们在反相HLB吸附剂上的保留较弱，观察到回收率较低。在传统的蛋白质沉淀方法中，通过增加MeOH或ACN的体积来增强分析物的色谱响应（图3（A-C））。然而，在蛋白质沉淀的样品中观察到了额外的峰。

3.3 方法验证
3.3.1 线性和LLOQ
所有分析物在其各自的校准范围内都观察到了良好的线性，相关系数（R2）超过0.99。这表明在广泛的动态范围内响应一致。详细的LLOQ和线性数据总结在表1中。

3.3.2 选择性、基质效应和稀释完整性
在分析空白样品时，没有观察到与所有目标分析物相应保留时间的干扰。关于来自六个不同来源的人体尿液的选择性，没有观察到显著的干扰。
通过使用MQC样品的准确性评估了基质效应。如表S4所列，尿液中所有分析物的基质效应范围为88.47%至97.03%。所有值都在通常接受的80%–120%范围内，表明在所应用的色谱和质谱条件下离子化抑制或增强可以忽略不计。样品制备程序结合优化的LC-MS/MS方法有效地最小化了基质干扰，从而确保了可靠的定量。

3.3.3 回收率和精密度
与添加的浓度相比，所有分析物的分析回收率都是令人满意的，范围从85.85%到111.57%。大多数值落在最佳的90 - 110%范围内，表明量化中的系统偏差很小。值得注意的是，即使在LLOQ水平下，回收率仍然稳健（例如，MEL为89.88%，17α-OHP为96.90%，5-HT为98.56%），证实了测量低浓度的可靠性。通过确定同日（n = 5）和不同日（n = 15）的精密度来评估方法精度，表示为相对标准偏差（RSD）。如表2所示，所有分析物在低、中、高浓度水平的RSD值分别为3.18%至11.75%（同日精度）和3.48%至13.15%（不同日精度）。所有RSD值都低于通常接受的15%阈值，表明该方法在短期和中期内的重复性和精度都是可接受的。

3.3.4 携带效应和稳定性
通过在注射最高浓度标准后分析空白样品来进行携带效应评估。结果表明，所有分析物的携带效应可以忽略不计，浓度低于LLOQ，从而满足方法验证的接受标准。

在未添加EDTA或抗坏血酸的情况下，评估了分析物在各种存储和处理条件下的稳定性。总体而言，该方法在大多数与常规实验室工作流程相关的条件下表现出可接受至优异的稳定性，特别是在冻融循环方面。通过模拟典型的样品处理时间来评估室温（台式）稳定性。所有七种分析物在这种条件下都表现出优异的稳定性，平均回收率范围从88.47%（T）到108.73%（5-HT），相对标准偏差（RSDs）低于10%（3.64%至9.22%）。在4°C下对完全处理的提取物进行了24小时的自动采样器稳定性评估。所有分析物都保持稳定，回收率在89.14%（MEL）到105.02%（CRL）之间，RSDs ≤ 12.04%。这证实了预处理后的样品可以在4°C下的自动采样器中存储24小时，从而实现高通量批量分析而不影响结果准确性。通过将样品在-20°C下存储20天来测试长期稳定性。大多数分析物在这些条件下表现出满意的稳定性，回收率从80.62%（MEL）到118.14%（T）。值得注意的是，MEL（80.62%）和5-HT（85.02%）的平均回收率接近接受标准的下限（80 - 120%），表明在冷冻存储过程中有降解或吸附的趋势。冻融稳定性带来了最大的挑战。经过三个完整的冻融循环后，一些分析物的稳定性较差。最严重的是，MEL和5-HT的平均回收率分别为38.45%（MQC）和39.42%（LQC）。T和17α-OHP也受到显著影响，回收率约为60 - 70%。这些值远远低于可接受的85–115%范围，表明每次解冻循环都有大量的分析物损失或降解。相比之下，DHEAS和aMT6s对冻融过程更具抵抗力，回收率分别为70 - 80%，尽管仍在可接受的范围内。

根据上述结果，建议将用于分析这些生物标志物的尿液样品储存在-80°C下，每个样品只解冻一次用于分析，并且还应考虑使用抗氧化剂。临床应用与参考区间

基于本研究早期验证的良好线性、较低的相对标准偏差以及稳定的回收率，所提出的方法能够准确量化临床尿液样本中的目标生物标志物，从而有助于建立参考区间。如图4所示，所有7种分析物均在尿液样本中被检测到。当分析物浓度超过校准范围的上限时，会对其进行稀释以使其处于可定量范围内。所有分析物的平均浓度范围为18.7 pg/mL（MEL）至777.1 ng/mL（DHEAS）。DHEAS是含量最高的分析物，其次是5-HT（456.2 ng/mL）和aMT6s（227.5 ng/mL）。

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图4. 从中国上海收集的尿液样本中测量的目标生物标志物浓度

由于数据分布非正态，根据CLSI C28-A3指南[37]的建议，采用了百分位数方法（P2.5–P97.5）来初步建立参考区间。P2.5 - P97.5区间被推荐为健康成年人的95%参考区间（如表3所示）。

表3. 健康人群晨尿中7种生物标志物的推荐参考区间

| 生物标志物 | 参考区间（ng/mL） |
|---------------|------------------|
| Cortisol (CRL) | 11.04 - 183.67 |
| Testosterone (T) | 0.08 - 9.20 |
| 17α-Hydroxyprogesterone (17α-OHP) | 0.05 - 6.91 |
| Dehydroepiandrosterone Sulfate (DHEAS) | 14.98 - 1695.5 |
| 6-Sulfatoxymelatonin (aMT6s) | 1.15 - 782.5 |
| 5-Hydroxytryptamine (5-HT) | 69.67 - 1238.68 |
| Melatonin (MEL) | 8.47 - 67.45 (× 10–3) |

本研究中的CRL参考区间（11.04 - 183.67 ng/mL）高于另一项包含88名志愿者的研究结果（4.22 - 27.5 ng/mL），这反映了晨尿（我们的研究）与常用的24小时尿液（文献报告）之间的差异[38]。作为主要的应激激素，晨尿中的皮质醇能够可靠地指示下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴在醒来时的峰值活动，并与睡眠-觉醒转换和急性应激状态密切相关[8]。而24小时尿液不受皮质醇昼夜脉冲分泌模式的影响，代表了其总体输出水平。

尿液中的睾酮是评估性腺功能的关键指标。数据显示男性样本中的睾酮水平通常较高，这与已知的性别差异一致[39]。极端值可能是由于个体生理差异或特定生理状态造成的，在统计分析中被视为异常值。

17α-OHP是类固醇激素合成的关键中间体。其在晨尿中的水平（0.05 - 6.91 ng/mL）相对稳定，个体波动反映了肾上腺皮质的基线分泌功能。

作为肾上腺雄激素的前体，DHEAS表现出最宽的浓度范围（14.98 - 1695.51 ng/mL）和最大的个体差异。这种极端变异性已有充分记录，主要受年龄、遗传因素和肾上腺储备能力的影响[40]。我们的数据证实，DHEAS的参考区间必须较宽，未来需要更大样本量的研究来建立分年龄和性别的参考区间，以便于临床应用。

MEL本身的检测浓度较低（8.47 - 67.45 pg/mL），这是因为只有极少量的MEL以未代谢的形式通过尿液排出。作为褪黑素的主要尿液代谢物，aMT6s被广泛认为是评估内源性褪黑素分泌和昼夜节律的“金标准”生物标志物。本研究观察到其浓度波动较大（1.15 - 782.57 ng/mL）。样本51（男性，35岁）中的浓度为2500 ng/mL，而样本22（女性，67岁）中的浓度低于2 ng/mL，因此该样本被排除在外。一项包含68项研究的综述报告称aMT6s的参考区间为13.1 - 245.9 ng/mL/mg肌酐[41]，这与我们的研究结果相当（考虑到晨尿中肌酐的标准浓度为2 mg/mL）。

尽管大部分5-HT位于肠道和血小板中，但尿液中约2–10%的5-HT反映了身体的整体代谢状态和单胺神经递质的周转情况[42]。我们研究中的参考区间（69.67 - 1238.68 ng/mL）比之前的一项研究（13.4 - 207.2 ng/mL，样本量为90人）要宽，因为那项研究收集的是第二天的晨尿样本，可能导致分析物稀释；样本量不足也可能是出现极端值的原因之一。本研究的数据为探索其病理生理波动提供了基础。

建立的参考区间填补了缺乏标准化LC-MS/MS方法的空白，为与睡眠质量相关的尿液生物标志物提供了基准。这些区间可以作为客观工具，用于识别睡眠障碍患者（例如，昼夜节律障碍中的aMT6s水平低、压力相关失眠中的CRL升高）的异常神经内分泌特征，并开展关于睡眠健康与慢性疾病关联的流行病学研究。

4. 结论

总之，我们开发并验证了一种可靠的LC-MS/MS方法，用于量化人类尿液中的七种与睡眠质量相关的生物标志物。通过解决分析物的不同理化性质问题，我们采用了两种优化的样品预处理方法（类固醇激素的液-液萃取和极性神经递质的沉淀纯化）以及相应的色谱系统（基于氨和醋酸铵的流动相），确保了方法在线性、精度、回收率和基质效应控制方面的优异性能。该方法已成功应用于临床样本，建立了初步的参考区间，填补了睡眠医学领域的空白。

本研究存在一些局限性。首先，样本量相对较小（n = 70），且仅限于上海地区的人群，这可能限制了参考区间的普遍适用性。未来的研究应扩大样本量，包括不同年龄组、性别和地理区域。其次，当前的两步预处理过程降低了分析效率，因为单一沉淀方法并不适用于所有分析物，寻找新型SPE材料以实现所有分析物的一步萃取是方法优化的重要方向。此外，这种方法未来还可用于研究SQBs与睡眠问题之间的相关性。

资金支持

本研究由上海浦东新区卫生健康委员会的重要薄弱学科建设项目资助（项目编号：PWZbr2022–03）。

作者贡献声明

Li Ma：方法学、实验设计、数据管理
Yun Gao：验证、数据分析
Menghan Xu：初稿撰写、验证、实验设计
Zhiqin Liu：验证、数据分析
Yanying Li：初稿撰写、概念构思
Fenghua Zhang：审稿与编辑、方法学、资金争取