综述：17β-雌二醇电化学生物传感器：识别元件、平台及分析验证

《Talanta Open》：17β-Estradiol electrochemical biosensors: recognition elements, platforms, and analytical validation

　　安东尼奥斯·乔治亚斯（Antonios Georgas）| 特奥多罗斯·普里斯（Theodoros Pouris）| 梅利娜·吉安纳基（Melina Giannaki）| 安杰洛·费拉罗（Angelo Ferraro）| 伊万杰洛斯·赫里斯托福鲁（Evangelos Hristoforou）
希腊雅典国立技术大学电子传感器实验室，雅典15772

**摘要**
17β-雌二醇（E2）是一种重要的内源性雌激素，被认为是一种具有强烈内分泌干扰作用的化合物，因为它在水生环境和生物液体中广泛存在，可能对水生生态系统和人类健康产生不利影响。电化学生物传感技术已成为检测和定量E2的理想方法，因为它能够同时具备高灵敏度、快速响应、简单操作以及便携性等优点。本文介绍了内分泌干扰化合物的定义、作用机制、暴露途径及评估方法，并概述了用于E2检测的电化学策略，重点讨论了生物识别设计和电极/纳米材料工程对分析性能和实际样品适用性的影响。我们探讨了主要的识别途径（包括基于亲和力的分子和合成受体），强调了利用电极平台和表面修饰来增强信号转导和界面稳定性的方法，并总结了用于量化E2的测量方法。最后，本文还分析了将E2电化学传感器从实验室原型转化为实际应用过程中所面临的挑战，特别关注了基质效应、干扰测试、报告结果的可比性以及支持结果重复性的报告实践。总体而言，本文旨在将现有文献系统地整合到一个结构化的框架中，为未来能够满足实际需求电化学生物传感器的设计提供指导。

**1. 引言**
**1.1 内分泌干扰化合物（EDCs）：定义、作用机制、暴露途径及评估**
内分泌干扰化合物（EDCs）通常被定义为能够改变内分泌系统功能的外部因素或混合物，从而对完整生物体及其后代或亚群体产生不良影响[1]。国际化学安全计划（IPCS）、联合国环境规划署（UNEP）和世界卫生组织（WHO）对EDCs的定义与此一致，这些定义强调了它们在水生环境中的存在及对人类的暴露风险[2]。根据公共卫生报告，EDCs可能干扰激素的生物合成、代谢或作用机制，从而偏离正常的稳态控制和/或生殖过程[3]。在研究和监管中，内分泌活性与内分泌干扰之间存在实际且重要的区别[4]。根据欧盟（EU）关于识别内分泌干扰物的指南，只有满足以下三个条件时，某种物质才能被认定为具有内分泌干扰作用：（i）具有不良影响；（ii）具有内分泌活性；（iii）存在生物学上的合理关联，表明该不良影响是内分泌活性的结果[4]。这种三分法在EDCs评估的证据整合建议中也得到了体现，同样优先考虑对效应、内分泌活性及因果关系的结构化评估[5]。

EDCs包括多种化学物质，如工业化学品、塑料和增塑剂、农药、药品、金属以及持久性有机污染物[6]。据全球评估，已知或怀疑有近800种物质会干扰激素受体、激素合成或激素转化过程，但现有清单仍不全面[1]。尽管关于内分泌干扰的讨论主要集中在雌激素效应上，但多项研究表明，其作用机制远超单一的受体中心视角和有限的途径，因此需要采用广泛的、考虑多种机制的筛选和评估方法[7]。从机制上看，许多EDCs通过影响激素合成和/或受体结合来破坏内分泌稳态，进而改变内分泌信号传导和下游生理过程。涉及的受体系统包括雌激素、雄激素、孕酮、甲状腺激素和视黄酸受体等核激素受体；非经典途径还包括通过非甾体受体、转录共激活因子以及参与类固醇生物合成和代谢的酶促途径。与可能需要长时间才能产生效果的基因组响应不同，某些EDCs可以通过膜相关信号途径在几分钟内产生快速的非基因组效应[7]。更广泛的生物学效应增加了结果解读的复杂性，并扩大了潜在相关指标的范围。内分泌干扰的机制涉及表观遗传变化，这些变化可能具有跨代影响，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA的改变[7]。科学声明和机制研究指出，这些效应与延迟或潜伏的结果相关，例如“成人疾病的发育基础”概念[3]。关于水生环境中EDCs的存在和暴露情况的综述也提到了表观遗传机制（如组蛋白修饰和DNA甲基化/乙酰化）[2]。

剂量-反应行为是内分泌干扰研究和评估中的关键问题。全球评估和科学声明揭示了非线性剂量-反应关系（NMDR），同时关注低剂量效应以及低剂量在特定情况下的潜在强效性[1]。欧盟的危害识别指南明确考虑了低剂量效应和NMDR在证据权重和作用机制分析中的作用[4]。然而，其他研究认为低剂量和NMDR存在较大争议，表明在方法学和解释方面仍存在挑战[2]。区分直接的内分泌介导效应和由一般应激或系统毒性引起的间接内分泌终点变化是一个重要难题[8]。如果未彻底检查因果途径，筛查试验可能会检测到通过神经内分泌应激级联或肝脏毒性间接产生的内分泌相关改变，从而增加误分类的风险[8]。这种担忧与需要验证内分泌活性与不良结果之间存在生物学合理关联的识别框架相一致[4]。

EDCs来源于多种来源和释放途径，包括农药、阻燃剂、塑料添加剂、化妆品和药品等工业产品；含有EDCs的产品在环境中释放会加剧污染[1]。“多途径”暴露包括通过饮食摄入受污染的食物、灰尘和水；吸入气体和颗粒物；以及通过胎盘和母乳的生物传递[7]。对于接触工业化学品、杀菌剂和农药的人群，职业暴露的重要性尤为突出[3]。水生环境常被视为EDCs存在和暴露的关键环境领域，废水排放、农业径流、合流制污水溢出以及消费品和工业产品的渗漏都是污染源[2]。当人类和动物的排泄物通过未经充分处理的废水、径流或泄漏到地下水中时，类固醇雌激素常被称为“环境雌激素”，成为水中的新兴微污染物[9]。在欧洲的水生环境中，卫生污水和农业污水是雌激素负荷的主要来源，还包括生活污水、污水处理厂（WWTP）排放物以及用作肥料的浆液/粪便[10]。

传统污水处理方法往往无法完全去除激素活性化合物；研究表明，雌激素和其他雌激素类污染物在污水处理厂中未能被完全清除，且不同处理方法的去除效果存在差异[11]。特别是对于类固醇雌激素，目前尚无单一工艺能够完全消除它们，这加剧了对持续低水平排放的担忧[9]。在欧洲检测的样本中，雌激素的环境浓度通常在0.1至10 ng/L之间，相关研究关注欧盟制定的雌激素活性基准和环境质量标准[10]。更广泛地说，水生栖息地和饮用水中普遍存在EDCs，浓度范围从ng/L到μg/L不等[2]。处理过程中产生的化合物也可能导致人体暴露。例如，在饮用水、淋浴/游泳和游泳池中，消毒副产物（DBPs）会在水源水中的有机/无机物质反应时产生，从而导致摄入、吸入和皮肤接触[12]。关于持久性污染物的研究还提到了全氟烷基物质（PFAS），它们在各种消费和工业用途中的来源及其对设施附近、垃圾填埋场和污水处理厂附近饮用水的污染作用；其持久性和生物累积性是主要问题[12]。

健康和生态问题涉及多个终点和生命阶段。多项研究表明，EDCs与生殖、代谢、神经系统、心血管系统、甲状腺相关疾病及激素敏感恶性肿瘤有关，其中在早期发育阶段的敏感性最高[1]。发育暴露期间，EDCs的影响可能在比成人更低的浓度下就已显现[1]。疾病终点研究也将EDCs暴露与生殖、代谢、神经系统、心血管系统和癌症终点联系起来，包括发育和跨代影响[7]。生殖效应尤为显著且复杂，包括卵泡生成、类固醇生成、排卵和妊娠等过程都受到干扰；早期妊娠暴露可能影响胚胎着床和子宫接受性[7]。多种来源指出，隐睾症、尿道下裂、精子质量下降和不孕症是男性生殖系统的后果；睾丸发育不良综合征与胎儿发育期间雄激素活性降低有关[7]。一些国家还观察到精子质量下降和生殖器畸形增加的现象，尽管具体化学物质的归因仍不明确[1]。肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪肝病（NAFLD）等代谢后果也是研究重点，其机制涉及脂质代谢过程的改变[7]。全球评估强调了结构化证据整合和谨慎的因果推断的重要性[6]。

生态影响广泛且具有机制学意义，因为内分泌途径在不同物种间具有保守性[3]。全球评估总结了野生动物生长和繁殖受到的影响，包括鱼类雌性化/两性畸形和繁殖成功率下降等现象[1]。雌激素相关研究还观察到了跨物种间的效应，如卵黄蛋白生物标志物的诱导、性别比例失衡以及鱼类和两栖动物的繁殖障碍[10]。关于实际暴露混合物的影响，研究强调了混合效应，包括在检测系统中观察到的协同雌激素效应和联合暴露下的叠加或叠加性雌激素活性[1]。尽管监测和评估框架正在发展，但其范围和覆盖范围仍面临挑战。据多个来源称，监测范围有限，尤其是针对某些化学物质的监测较为集中[1]。欧洲的评估强调了需要能够检测极低浓度物质的分析方法，同时指出了监测方面的不足，尤其是在东欧[10]。欧盟指南提出了使用证据权重和作用机制分析的正式危害识别流程，主要针对雌激素、雄激素、甲状腺和类固醇生成（EATS）效应，并将其与经济合作与发展组织（OECD）的概念框架和测试指南联系起来[4]。这些文件还指出，该指南侧重于危害识别而非全面的风险评估[4]。尽管国际上验证的测试方法可能仅能捕捉到部分内分泌干扰效应，这对疾病风险估计有影响[5]。在水相关讨论中，监管覆盖范围不均衡：许多消毒副产物已被识别，但只有少数受到监管；对于PFAS，目前尚未设定最大污染物浓度[12]。在欧洲，雌激素被列入了全欧盟范围的监测清单，并为某些化合物制定了环境质量标准[10]。

**1.2 E2：特性、来源及环境行为**
E2是主要的天然（内源性）类固醇雌激素，在毒理学和环境研究中常被用作高活性参考雌激素[13]。其结构为四环结构，包含一个芳香A环，以及位于C17位的β位的酚羟基和第二个羟基[14]。在环境文献中经常报告的化学标识符包括分子式C18H22O2、分子量约为272.38 g/mol以及CAS编号50-28-2，这些标识符反映了实验室工作中分析标准来源的常见做法[15]。E2的物理化学性质影响了其在自然和人工系统中的传输、分布和持久性。E2具有高度疏水性，其辛醇-水分配系数大约在2.6–4.0之间。一些研究者发现该范围更窄，为3.5–4.0，处于E2可能值的上限。与结合雌激素相比，E2的挥发性较低，溶解度也较低，因此更倾向于在颗粒物、沉积物和污泥中积累，而不是挥发[14,16]。其pKa值为10.46，表明E2是一种非常弱的酸，在环境样品中主要以非离子形式存在，这与其典型的环境pH值有关。对于环境样品中的E2来说，这是一个重要的特性，因为非离子形式的化合物更容易被脂质介质吸收[17]。E2主要由脊椎动物体内产生，并主要通过尿液和粪便排出，因此成为环境中天然存在的E2来源[14]。在类固醇雌激素和内分泌活性化学物质的更大背景下，人类活动和基础设施仍然是环境途径和排放路径的重要驱动因素。通过研究确定的一些主要人为排放源包括污水处理厂（WWTP）的进水口和出水口、生物固体以及集中式动物饲养场（CAFO），其中动物粪便和废物富含激素，并经常被施用于土地或排放到水中[18]。农业污泥和动物粪便再次被强调为重要的贡献者，且与水相相比，污泥和粪便固体中的雌激素活性更为集中[19]。E2和其他雌激素从这些来源的传输途径包括直接将处理过或未经处理的废水排放到河流中；来自施肥田地的径流和排水系统；通过沉积物中的优先流动路径渗入地下水；以及与胶体和有机物传输相关的吸附介导的传输[18]。这些途径有助于揭示这些废水和农业来源下游E2的存在情况，也与作为内分泌活性化学物质接收者的水生环境的定义相符。E2是否会重新转化为活性形式或其他形式取决于转化和生物降解过程。生物降解过程，包括微生物将E2氧化为效力较低的雌酮（E1）、硫酸盐和葡萄糖醛酸结合物的解离以及在有利条件下的矿化，通常被认为是自然和人工系统中主要的去除过程[14]。基质、微生物和处理条件对降解动力学有显著影响。参考文献指出，E2在河水中的半衰期从几小时到几天不等（在河水E2生物转化研究中为0.2–9天），而含有沉积物的系统的去除速率比基于水的系统更快；据报道，如Rhodococcus sp. ED55这样的菌株能够在几小时内矿化mg/L浓度的E2（在含有ED55的矿物盐培养基中半衰期约为1.06小时）[14,20,21]。非生物变化也会影响暴露模式。例如，消毒剂的氧化可能导致卤化。对于基于氯的污水处理厂消毒过程，消毒剂的氧化会导致卤化，而卤化化合物的光解速度较快，而游离E2的光解速度通常较慢；这些变化可能导致吸附和生物降解模式的变化[20]。分配到固体上是另一个普遍现象。例如，E2在沉积物、污泥和腐殖质材料中的吸附（表现为高Kd和Koc值）可以限制其在水中的移动性，但也可以保护其免受快速生物降解，并使其在这些固体材料中持续存在[14,22]。根据这些来源和过程，E2可以在废水进水口和出水口、地表水以及农业浆料中以不同的浓度存在，具体取决于与来源的距离和样品基质[16,19]。地表水和地下水中的E2环境浓度范围可以从亚ng/L到数十或数百ng/L不等，而粪便和浆料的浓度则显著更高（μg/L到mg/L级别）[16,19]。从生态毒理学的角度来看，E2被认为是一种效力很强的化合物，在低ng/L浓度下就对鱼类和其他脊椎动物有已知的影响。例如，已经记录了如卵黄生成素诱导和雌性化等效应[23,24]。在监测和评估中经常使用E2当量（EEQ）来考虑混合物和代谢物的叠加效应。鉴于E2的效力及其在处理后的废水和粪便中的存在，E2被视为评估内分泌干扰风险、处理效果和管理农业和市政来源E2时的优先化合物[21]。这些方面影响了分析策略。例如，监测通常包括游离E2及其结合物和代谢物以及转化产物。这是因为在处理过程中或排放到地表水后，E2可能会重新解离为游离E2。此外，像E1（雌酮）这样的代谢物仍保留雌激素活性，尽管效力较低[14]。在监测策略中，水样通常还包括固相。沉积物和生物固体中的E2浓度通常高于上层水体。基于生物测定的EEQ筛选也被讨论为一种额外的化学分析策略[19,22]。在设计监测计划和风险评估时，必须考虑母体化合物和转化产物，因为降解动力学存在变异性，这可能从专门培养物中的快速微生物矿化到与吸附相或卤化衍生物相关的持久性不等[20,21]。图1概述了雌激素进入和水生环境中的主要途径，突显了在实际水系统中监测它们的复杂性。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图1. E2在水生环境中的命运和传输（经许可复制自[25]）。鉴于这种化学和环境背景，快速、灵敏的常规检测变得更为重要：由于低效应浓度、持续排放和转化过程，暴露特征和风险管理变得复杂。1.3. E2及相关雌激素对环境和人类健康的影响：为什么需要灵敏的水质监测由于E2及其类似物E1和雌三醇（E3）作为内分泌干扰物（EDCs）的广泛认可，它们能够干扰野生和人类生活中的自然生理过程，因此人们对环境和水生系统及其使用者的持续暴露危害越来越关注[26]。由于E2的持久性及其来自人类来源的持续排放，人们对水生系统及其使用者的持续暴露危害越来越担忧，因为即使是在微量情况下，它也会对物种产生有害的生物学后果[27]。除了天然雌激素外，17α-乙炔雌二醇（EE2）是一种用于避孕的合成激素，源自天然E2，也被用于环境和人类健康的治疗。与天然雌激素类似，EE2是雌激素活性的主要贡献者，主要来自城市污水处理厂的出水、医院废水和牲畜活动[25]。据称这些雌激素会对水生生态系统产生多种生态毒性效应，包括生殖问题、雄性雌性化、异常以及鱼类和其他脊椎动物的种群水平效应。一些野生动物种群的减少与环境中雌激素的存在有关，记录的影响包括对暴露于雌激素的生物种群的生命周期和代际效应[28]。关于硬骨鱼类对外源性E2暴露的研究显示了生理问题，包括精子发生抑制、性腺体指数下降、肝脏组织病理学变化和生长减缓，这表明可能存在生态风险，特别是对于野生和养殖鱼类种群[29]。顶级捕食者和水生生物消费者受到关注，因为雌激素被认为在沉积物和地下水中具有足够的持久性，并在食物网中生物放大[28]。报告的效应范围从细胞效应到种群效应，包括不育、繁殖失败、雌性化、甲状腺激素紊乱和发育改变。在Gobiocypris rarus的实验研究中，观察到在0.2 ng/L浓度下完全繁殖失败，其他研究报道了对敏感鱼类物种在低ng/L浓度下的最低观察效应浓度（LOECs）和未观察效应浓度（NOECs）[30]。生物标志物响应：在鱼类中，实验室生物指示剂研究表明，E2暴露后脂质过氧化、过氧化氢含量和蛋白质羰基化等生物标志物增加，同时抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）也增加，表明E2诱导了细胞应激反应[31]。此外，肝脏损伤、精子活力下降和繁殖指数下降也与E2处理有关，将生化效应和组织病理学效应与繁殖性能下降联系起来[29]。1.4. 人类健康考虑现有证据表明天然和合成雌激素与人类健康结果之间存在关联，包括生殖平衡的破坏、发育时间的改变以及激素敏感性癌症（如乳腺癌和子宫内膜癌）的可能性[28]。在临床和生物监测环境中，不能过分强调超低检测限的必要性，因为E2从生理水平的变化是早熟和内分泌紊乱等状况的重要生物标志物[32]。尽管致癌和发育效应已被认识到，但评估和审查包括了接触合成雌激素的内分泌干扰潜力，并提供了关于暴露水平与直接关系的矛盾数据[30]。1.5. 为什么需要常规的灵敏监测（以及它对分析的要求）有大量证据强调了在水生环境中监测低水平E2及相关EDCs的重要性。首先，为了进行风险评估，必须在低水平下实现分析灵敏度，因为已经在亚ng/L水平的E2及相关EDCs观察到了生态毒性效应，如繁殖失败和生殖障碍[30]。其次，如欧盟WFD等法规将E2确定为优先物质，并设置了依赖于监测来评估环境合规性和状态的EQS[26]。第三，监测E2及其代谢物是必要的，因为不能确定传统的污水处理厂能否完全去除EDCs，而且处理技术可能会产生毒性未知甚至比原始化合物更高的EDCs[31]。最后，EDCs在多种基质（地表水、废水、沉积物、生物体和某些食品）中的存在及其生物累积潜力被用来证明系统检测的必要性，以保护生态系统和人类健康[28]。满足这些监测需求需要高分析要求，因为相关效应发生在非常低的浓度下，且环境基质复杂。对于某些临床和环境应用，描述了超高的灵敏度要求，目标低至pg/ml（甚至更低）范围，用于临床诊断和环境痕量检测[32]。传统的色谱和质谱方法可以提供高灵敏度，但存在实际限制，包括高昂的成本和操作费用、繁琐的样品准备以及常规现场部署的约束[28]。实验中也报告了特定的分析限制，例如高效液相色谱（HPLC）的检测限限制了在1 ng/L spiked水平下生成降解谱的能力[31]。新兴的生物传感器和适配体传感器方法在便携性、降低成本和快速结果方面显示出潜力，但它们面临可重复性、基质干扰、适配体固定化以及需要放大策略以达到环境和临床决策限等方面的挑战[26]。同时，可扩展的生物降解或修复方法被描述为需要避免产生有毒副产物，并需要评估其安全性、有效性和可行性[27]。总体而言，这些部分的研究共同强调了本综述的重点：E2及相关雌激素在低浓度下具有高效力，持续进入水生系统，在传统处理中去除不完全，以及复杂的转化途径，所有这些都使得在水中的稳健、灵敏检测成为环境评估和健康保护监测的核心[28]。E2的生物识别策略
本章围绕识别策略展开讨论，主要包括适配体（aptamers）、抗体（immunosensors）和分子印迹聚合物（MIPs），并遵循既定的分类体系，探讨了生物识别元件的选择如何影响分析性能、材料选择和设备形式[26,33]。为了保持讨论的焦点，本综述所考虑的论文是通过结合关键词（如内分泌干扰化合物、17β-雌二醇、电化学传感、生物传感器、适配体和分子印迹聚合物）从重要的科学数据库中收集的。特别关注了那些不仅讨论了传感器本身，还包含了分析性能评估以及复杂基质评估的同行评审文章。此外，也考虑了早期发表的标志性论文，因为这些论文对于理解该领域的发展历程和当前传感策略的演变具有重要意义。

基于适配体的传感器（第2.1节）首先被讨论，因为适配体因其高特异性、稳定性和适应性而被认为是识别E2的非常有前景的类别，而且最近的研究主要集中在序列工程（如分裂适配体、截短适配体、SELEX衍生适配体）和核酸扩增策略上，以将检测限（LODs）提升到飞摩尔到纳摩尔的范围[26]。同时，这些扩增方案和纳米材料的集成带来了可重复性和稳定性方面的挑战，这需要在设备设计和实际样品验证中加以仔细考虑[26]。

第2.2节探讨了免疫传感器，其中基于抗体的竞争性免疫传感器和基于标记的电化学传感器展示了纳克/升（ng/L）的灵敏度，并通过磁珠和丝网印刷电极的组合实现了现场测量，但也面临诸如固定化过程中的空间位阻问题以及制备电极在几周内的操作稳定性限制[34]。另一方面，第2.3节重点介绍了非生物识别工具，如分子印迹聚合物（MIPs）。尽管这些无试剂方法因其稳健性而备受关注，但它们的选择性不如生物受体强。因此，将它们与高特异性的转换器结合使用至关重要，以防止具有氧化还原特性的干扰物质干扰生成的信号[33]。

通过这种综述方式，可以比较和对比文献中通常强调的基本权衡因素，如分析特异性、在复杂基质中的稳健性以及实际应用中的可行性。此外，这种形式还为进一步讨论各种转换模式、功能材料以及从实验室设备到即时检测E2传感器所需的技术差距奠定了基础[26,33]。

图2总结了本综述中涵盖的所有分析概念。它详细展示了目标分子（表示为E2）以及各种识别工具（如适配体、免疫传感器和MIPs），以及本文中强调的各种电化学转换模式。

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**图2. 17β-雌二醇（E2）的电化学生物传感路径图。** 该示意图展示了目标分析物（E2）和三种不同的表面修饰平台：适配体传感器、免疫传感器和分子印迹聚合物（MIP）传感器。随后的信号转换通过电化学测量技术实现，具体包括循环伏安法（CV）、方波伏安法（SWV）、差分脉冲伏安法（DPV）和电化学阻抗谱（EIS）。分析工作流程以环境水监测为例，展示了这些传感机制如何应用于实际场景，如河流和地表水。

**2.1 基于适配体的E2电化学生物传感器**
**2.1.1 引言**
基于适配体的电化学传感器已成为检测小分子类固醇E2的多功能生物亲和装置。文献中的报告展示了多种检测架构，从简单的表面固定直接结合形式到分裂适配体三明治结构以及酶或核酸扩增方案，还包括多种电化学转换模式，如阻抗、伏安法、电化学发光（ECL）和光电化学（PEC）读数。综述和比较研究总结了这些方法的多样性以及纳米材料和氧化还原报告剂在提高分析灵敏度（达到亚皮摩尔甚至更低浓度范围）方面的作用[35,36]。

**2.1.2 小分子E2的检测原理和格式**
用于E2的适配体检测（aptasensors）采用了多种识别和报告拓扑结构，以适应这种小而非极性的目标分子。一种常见的方法是E2直接与表面固定的适配体结合：目标结合会导致溶液中的氧化还原探针发生空间阻塞或界面阻抗变化，从而实现无标记检测[37,38]。构象变化和结构转换格式利用适配体在目标结合时的折叠来调节氧化还原标签的距离或可及性，或者改变电荷转移路径；这些方法既可用于阻抗“信号开启”传感器，也可用于氧化还原标记的伏安法检测[36]。图3示意性地展示了基于适配体的电化学E2检测的基本原理，其中目标识别转化为电极界面处的可测量变化。

**2.1.3 表面修饰和适配体固定**
固定化化学过程对检测的背景电流、稳定性和重复性有重要影响。已经有许多经过验证的表面修饰策略应用于E2适配体传感器的设计。基于巯基-金（Au-S）相互作用的自组装单层（SAMs）被广泛用于将巯基化适配体直接共价锚定在金表面上。这一步通常会通过使用短链烷基硫醇（如6-巯基-1-己醇（MCH）进行钝化处理，以减少非特异性结合[38,39]。链霉亲和素-生物素耦合在羧基终止的SAMs上提供了另一种固定生物素化适配体的方法，具体步骤包括使用3,3'-二硫二丙酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）激活羧基、链霉亲和素耦合和乙醇胺封闭，适用于金微电极芯片[37]。

电极表面通过纳米材料涂层进行多样化处理，以增加电活性面积并促进固定：在玻璃碳和二维过渡金属硫化物纳米片（如CoS）上电沉积的金纳米颗粒（AuNP）被用作巯基适配体的复合载体，而聚吡咯纳米线和羧基化聚合物微球则有助于将氨基修饰的适配体共价连接到碳基丝网印刷电极上[39,41]。分裂适配体和HCR结构可以通过Au-S键或EDC/NHS连接到AuNP改性的氧化铟锡氧化物（ITO）上，具体取决于所选择的转换模式[35,40]。广泛的调查指出，固定化策略还包括电聚合共聚物、主客体化学和π-π吸附在石墨烯衍生物上，反映了表面设计的丰富工具箱[36]。

**2.1.4 信号策略和放大**
E2适配体传感器中的电化学读数方法主要分为几类。无标记的阻抗传感通过监测目标结合后的电子转移电阻或电容变化来实现，通常使用铁氰化物/铁氰酸盐氧化还原对作为溶液探针；这种电化学阻抗谱（EIS）检测在优化配置下已达到亚皮摩尔灵敏度[35,38]。氧化还原探针介导的“信号关闭”伏安法检测使用相同的铁/铁氰酸盐对：适配体-目标复合物阻止探针的接触，从而降低差分脉冲伏安法（DPV）或方波伏安法（SWV）测得的峰电流[37,41]。氧化还原标记策略将电活性报告剂直接放置在参与检测的寡核苷酸上。亚甲蓝（MB）既可用作富含鸟嘌呤的cDNA报告剂的直接氧化还原标记，也可作为多功能探针，在双模式PEC/EC检测中增强光敏量子点的灵敏度；基于MB的竞争性和HCR放大方案在某些报告中实现了飞摩尔级别的分析灵敏度[39,40]。比率双信号设计结合两种电化学或光电化学电流（例如MB氧化还原电流和参考铁/铁氰酸盐信号），以校正环境或设备间的差异并提高定量可靠性[40]。酶和纳米颗粒放大进一步提高了灵敏度。葡萄糖氧化酶和DNase I循环已被用于将单次结合事件转化为放大的电子转移信号，而纳米颗粒氧化还原探针（如镍六氰铁酸盐（NiHCF）的原位沉积为DPV读数提供了强烈的信号增强[35,36]。光电化学转换将适配体识别与CdTe（碲化镉）或赤铁矿基光阳极产生的光电流耦合，结合纳米结构电极和敏化剂时可实现非常低的检测限[35]。

代表性的性能指标展示了这些策略如何转化为分析能力。一种简单的无标记、铁/铁氰酸盐介导的SWV检测在链霉亲和素包覆的金微电极上实现了0.01–1 nM的线性检测范围和0.1 nM的实际检测限[37]。使用MB标记的富含鸟嘌呤的cDNA在CoS（硫化钴）纳米片上的竞争性杂交检测实现了高达10^?12 M的线性检测范围和7.0 × 10^?13 M的检测限，并成功分析了稀释的人类尿液[39]。分裂适配体三明治DPV传感器在碳基SPE（丝网印刷电极）上达到了4.8 × 10^?13 M的检测限，并通过HPLC验证[41]。铂增强型光电化学/电化学比率HCR系统结合MB和CdTe量子点（CdTe QDs）实现了超低检测限（电化学和PEC比率分别为0.06和0.02 pg/ml），并在大量水样中得到了验证[40]。广泛的调查表明，电化学E2适配体的检测限范围大约在10^?15到10^?8 M之间，具体取决于检测格式、纳米材料放大和转换模式[35,36]。

**2.1.5 在实际基质中的性能趋势和验证**
E2适配体文献的一个优势是包含大量包含实际样品测试和正交验证的研究。尿液是最常用于验证的生物流体，通常经过大量稀释：一种CoS/AuNP DPV传感器分析了稀释100倍的尿液，回收率在94.4%到104.0%之间，相对标准偏差（RSD）<3.4%[39]；而使用巯基化适配体的无标记EIS传感器在稀释1000倍的尿液中实现了接近92–101%的检测率，且再生协议可支持≥10次循环[38]。环境水基质也经过了测试：分裂适配体DPV传感器和比率PEC/EC HCR传感器在添加了污染物的湖水样品中实现了约97–102%的回收率，这些研究使用HPLC（高效液相色谱）或LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）作为参考方法[40,41]。

多项实现提供了可重复性和短期稳定性数据：CoS/AuNP传感器在4°C下一周内的重复性RSD为1.6–3.4%，信号保留率约为95%[39]；比率PEC/EC设备在七天内的稳定性和重复性测量中RSD为约2.5–3.8%[40]。综述总结了许多研究，强调了从缓冲液到生物或环境样品转换时需要考虑的基质效应、所需稀释程度以及正交确认（HPLC/LC-MS/MS）的必要性[35,36]。

**2.1.6 实际限制和转化机会**
尽管有许多关于出色分析灵敏度的报道，但仍存在显著的实际限制。要达到如此严格的检测限，通常需要多步骤的表面修饰、较长的孵育时间或核酸扩增步骤，从而导致分析时间延长和复杂性增加。例如，特定的巯基化适配体EIS传感器需要长达4小时的平衡时间进行结合实验[38]，而分裂HCR方案需要120分钟的E2孵育期来优化MB吸附[40]。此外，通过使用组装协议（如羧基-SAM的形成、EDC/NHS激活、链霉亲和素耦合和封闭）可以抑制非特异性背景信号，但代价是制造过程更复杂且试剂消耗增加[37]。这些平台在检测结构相关的类固醇化合物和常见环境干扰物时具有足够的选择性。经常检测的干扰物包括雌酮（E1）、雌三醇（E3）、双酚A（BPA）、炔雌二醇（EE2）、孕酮（P4）、萘衍生物和1-氨基蒽醌，许多研究报道在10到100倍过量浓度下几乎没有交叉反应[37,39,41]。某些无标记EIS格式（例如EDTA冲洗至少10次循环）可以实现再生和重复使用，但这并非所有传感器类型都普遍适用[38]。

这些技术仍有很大的转化发展空间。结合比率双模式检测和分裂适配体结构可以提高对样品基质变化和设备稳定性的抵抗力，使其更适合低体积的一次性设备[40,41]。此外，作为开发超高灵敏度检测方法的一部分，可以通过使用基于纳米材料的表面积增强技术和基于酶及核酸的信号放大级联反应，将检测限（LOD）提升到亚皮摩尔水平[35,36]。最后，在验证这些生物传感器时，严格的样品制备（包括适当的样品稀释和基于参考物质的方法）为在尿液和环境水样等基质中验证基于适配体的E2电化学生物传感器提供了很大的可能性[[38], [39], [40]]。关于适配体传感器还需要注意的是，它们的性能通常对实验条件的敏感性比最初报告的分析数据所暗示的要高。由于目标识别依赖于适配体保持其正确的三维结构，即使pH值、离子强度、缓冲液组成或样品基质的相对较小变化也会影响其折叠、结合效率，从而最终影响测量信号。这一点在实际样品中尤为重要，因为盐类、有机物、蛋白质和其他共存物质可能会干扰界面条件，降低检测的稳健性。因此，除了实现低检测限之外，还应更加重视稳定性、重现性和在分析相关条件下的可靠性能。

表1提供了选定的基于适配体的电化学E2生物传感器的简要概述，其中包括它们的检测配置和关键分析指标的详细信息。

表1. 基于适配体的生物传感器
适配体序列 & 修改
线性范围 (M) LOD (M)
选择性
稳定性
基质 / 验证

| Ref5′-Biotin-GCT | TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG CAG AGG GTA GCG GCT CTG CGC ATT CAA TTG CTG CGC GCT GAA GCG CGG AAG C-3′ | 1.0 × 10^?11 - 1.0 × 10^?9 | 1.0 × 10^?10 | 1-氨基蒽醌；2-甲氧基萘 | 未报告 | 仅缓冲液 [37] |
| 5′-SH-GCT | TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG CAG AGG GTA GCG GCT CTG CGC ATT CAA TTG CTG CGC GCT GAA GCG CGG AAG C-3′ | 1.0 × 10^?11 - 1.0 × 10^?8 | 2.0 × 10^?12 | 1-氨基蒽醌；2-甲氧基萘 | 可重复使用 ≥10次循环 | 人尿（稀释1000倍）[38] |
| 5′-SH-GCT | TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG CAG AGG GTA GCG GCT CTG CGC ATT CAA TTG CTG CGC GCT GAA GCG CGG AAG C-3′ | 1.0 × 10^?14 - 1.0 × 10^?9 | 5.0 × 10^?15 | 雌三醇；双酚A；壬基酚；邻苯二甲酸二乙酯；间苯二酚；阿特拉津 | 可用50 mM EDTA再生 | 河水 [42] |
| 5′-SH-(CH2)6-TTT | T GCT TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG CAG AGG GTA GCG GCT CTG CGC ATT CAA TTG CTG CGC GCT GAA GCG CGG AAG C-3′ | 5.0 × 10^?13 - 5.0 × 10^?9 | 6.0 × 10^?14 | 双酚A；萘；1-氨基蒽醌 | 在4°C下保存1周后保留95.2% | 人尿 [43] |
| 5′-SH-(CH2)6-GCT | TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG CAG AGG GTA GCG GCT CTG CGC ATT CAA TTG CTG CGC GCT GAA GCG CGG AAG C-3′ | 1.0 × 10^?12 - 1.0 × 10^?9 | 7.0 × 10^?13 | 1-氨基蒽醌；萘；多氯联苯；邻苯二甲酸酯；睾酮；胆固醇 | 在4°C下保存1周后保留94.8% | 人尿 [39] |
| 5′-NH2-(CH2)6-AT | ACG AGC TTG TTC AAT ACG AAG GGA TGC CGT TTG GGC CCA AGT TCG GCA TAG TGT GGT GAT AGT AAG AGC AAT C-3′ | 1.0 × 10^?15 - 1.0 × 10^?6 | 1.0 × 10^?15 | 孕酮；双酚A | 未报告 | 自来水和人尿 [44] |
| Apt1: 5′-SH-(CH2)6-GCT | TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG CAG AGG GT-3′ | Apt2: 5′-AGC GGC TCT GCG CAT TCA ATT GCT GCG CGC TGA AGC GCG GAA GC-SH-3′ | 1.5 × 10^?12 - 1.0 × 10^?10; 1.0 × 10^?10 - 7.0 × 10^?05 | 5.0 × 10^?13 | 雌三醇；孕酮；睾酮；DBP；BSA；阿特拉津；BPAN | 未报告 | 自来水、牛奶、血清 [45] |
| 5′-GCT | TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG CAG AGG GTA GCG GCT CTG CGC ATT CAA TTG CTG CGC GCT GAA GCG CGG AAG C-3′ | 1.8 × 10^?15 - 5.5 × 10^?11 | 5.9 × 10^?16 | AA；UA；谷氨酸；BPA；DES | 在连续运行2000秒后保留96.0% | 自来水和牛奶 [46] |
| 5′-SH-(CH2)6-GCT | TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG CAG AGG GTA GCG GCT CTG CGC ATT CAA TTG CTG CGC GCT GAA GCG CGG AAG C-3′ | 1.0 × 10^?13 - 2.0 × 10^?10 | 5.3 × 10^?14 | 苯乙炔雌二醇；雌三醇；4-壬基酚；阿特拉津；BPA；邻苯二甲酸二乙酯 | 在4°C下保存7天后保留约95% | 废水 [47] |
| Apt1: 5′-AAG GGA TGC CGT TTG GG-3′ | Apt2: 5′-CCC AAG TTC GGC ATA GTG-3′ | 3.7 × 10^?14 - 1.8 × 10^?9 | 2.3 × 10^?14 | 雌三醇；双酚A；己烯雌酚 | 在7天内稳定（RSD 0.8%） | 池水 [48] |

2.2. 用于E2的电化学免疫传感器
2.2.1. 引言
电化学免疫传感器旨在检测E2，利用抗体和抗原之间的特异性，通过多种电分析技术实现。文献表明，大多数研究集中在小分子的检测上，特别是竞争性格式。这些免疫传感器采用多种信号转导机制，包括传统的酶促方法、基于纳米粒子的淬灭技术和无标记的电容方法。此外，研究人员策略性地使用各种电极材料和固定化化学方法，以达到所需的灵敏度、稳健性和实际应用性。以下部分综合了这些方法，特别关注检测设计、转导策略、电极构造和报告的分析性能。

2.2.2. 为什么免疫测定在检测小分子时占主导地位？竞争性格式
像E2这样的小分子缺乏传统夹心免疫测定通常所需的两个独特表位；因此，在电化学文献中，竞争性格式占主导地位。许多团队实施了直接竞争性测定，其中样品中的E2与标记的半抗原或标记的抗体竞争电极结合位点，从而产生与浓度相关的反向信号，适用于低分子量分析物[[49], [50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57]]。竞争性主题的变体包括直接标记的小分子缀合物（例如，酶标记的E2或半抗原-蛋白质缀合物）、标记的纳米粒子半抗原，以及利用溶液中的酶共底物竞争而非电极上的标记抗原的竞争方案[49,50,54,57,58]。这些实现说明了竞争性架构仍然是电化学免疫检测E2的实际默认方法。图4示意性地展示了E2电化学免疫传感器的工作原理，其中抗体识别通过基于HRP的电化学检测转化为可测量的信号。

2.2.3. 标记型与无标记型免疫传感器：信号策略
已经展示了多种信号策略。酶标签（主要是碱性磷酸酶（ALP）和辣根过氧化物酶（HRP）被广泛用于将电不活跃的底物转化为电活性产物，以便进行安培法或伏安法测量；例如，使用ALP标记的试剂通过p-氨基苯酚磷酸盐 → p-氨基苯酚进行安培法检测[49]，使用HRP-雌三醇缀合物通过H2O2/HQ催化和DPV或安培法检测[51,53,54,58]。在许多情况下，酶促格式实现了亚皮克/毫升的灵敏度，例如，在一次性电极上的竞争性HRP或ALP测定的LOD在低皮克/毫升范围内[49,54,56,58]。

与酶促检测并行，纳米粒子标签和混合材料也被用来提高LOD并引入替代的转导机制。基于纳米粒子的半抗原（例如，Polyaniline (PANI)@AuNPs-BSA-E2）被用作标记的竞争者，在ECL系统中作为高效的淬灭剂，与阴极ECL发射器结合时提供极宽的动态范围和超低LOD（报告的灵敏度为飞克/毫升[50]）。负载金属离子的纳米粒子标签与剥离伏安法结合，通过将生物识别事件转化为明显的金属剥离峰，使得E2的检测限可降至10–2皮克/毫升水平，使用Pb2+/Cd2+-负载的Fe3O4标签和方波阳极剥离伏安法（SW-ASV）读出[59]。还探索了混合信号模式：结合内部金属参考（Cd2+）和基于金属有机框架（MOF）的催化报告标记半抗原的比率计和双模式传感器，以提高稳健性并提供互补的DPV和计时安培输出[57]。

无标记的电化学免疫传感器主要是非法拉第电容/EIS平台，也得到了发展，无需标记试剂即可实现非常快速的分析。两个例子使用共价抗体固定在微型化导线电极或ZnO纳米结构Ag线上，通过测量抗原引起的界面电容或阻抗变化来实现低皮克甚至亚皮克的LOD；一个报告了1皮克/毫升的LOD和快速的10分钟检测时间[60]，另一个使用ZnO纳米棒和电容EIS读出实现了飞克/毫升的LOD[61]。这些无标记格式消除了对标签的需求，但要求对表面化学和噪声控制有严格的要求。

2.2.4. 电极平台和固定化方法
电极材料的选择包括丝网印刷碳电极（SPCEs）、玻璃碳电极（GCEs）、多晶金盘或芯片以及低轮廓导线电极（Ag导线）。为了扩大传感区域并提高电子转移效率，这些基础平台经常用纳米级修饰剂进行功能化。一次性印刷碳平台被用于多种酶标记的竞争性测定，通过被动吸附涂层抗原或捕获抗体，从而产生适用于水和血清测试的便捷、低成本的传感器[49,[54], [55], [56]]。玻璃碳电极作为更复杂表面的基础，使用POM-ZrO2 ECL发射器或MXene/聚多胺/Au复合材料进行抗体固定和内部参考[50,57]。金电极和电沉积的AuNPs用于利用硫醇化学和通过Protein G或硫醇化Protein G支架控制固定抗体的方向[52,53,58]。

固定化化学反映了简单性和定向稳定附着之间的权衡。在一次性碳平台上，被动吸附涂层抗原或抗体是常见的，便于制造并在短期测定中具有可接受的稳定性[49,55]。共价接枝策略、p-氨基苯甲酸的电化学接枝后通过链霉亲和素-生物素捕获[54]、丙硫醇SAMs与Cu的欠电位沉积（UPD）和二硫代丁二酰丙酸（DTBP）-硫醇化Protein G支架[52]，以及半胱胺SAMs与AuNPs用于抗体化学吸附[58]，以提高方向性并减少非特异性结合，通常提高重现性并实现重复使用。引入了纳米结构支撑材料，如石墨烯-聚苯胺复合材料、Polyamidoamine (PAMAM)-Au、Ti3C2 MXene、ZnO纳米棒和AuNPs，以增加电活性表面并提供抗体附着或介体结合的化学把手[[50], [51], [52], [57,61]。

2.2.5. 在实际基质中的性能趋势和验证
报告的分析性能在灵敏度和动态范围上相差几个数量级，取决于标签策略和转导方法。在一次性屏幕和改性电极上的酶放大竞争性测定通常实现了亚皮克到低皮克/毫升范围内的LOD；例如，一个ALP标记的丝网印刷竞争性测定的LOD为0.25皮克/毫升，并在河水和自来水中表现出稳健的回收率[49]，以及一个基于HRP的SPCE平台在血清和尿液中的LOD为0.77皮克/毫升[54]。无标记的电容EIS设计报告了相对较低的LOD和非常短的分析时间：11-mercaptoundecanoic acid（11-MUA）SAM Ag线电容传感器的LOD为1皮克/毫升（10分钟测定[60]，以及ZnO纳米棒EIS传感器的LOD为飞克级[61]。使用基于纳米粒子的ECL淬灭（LOD 3.7飞克/毫升）和金属离子剥离方法（LOD 0.015皮克/毫升）与精心设计的转导方案结合时，实现了飞克/毫升范围内的超高灵敏度[50,59]。比率计和双模式方法（例如，Cd2+内部参考与Cu-MOF标签）用于提高可靠性并提供正交读数，在湖水、牛奶和血清中实现了低皮克/毫升的LOD和成功的回收率[57]。在复杂基质中的验证是一个反复关注的重点。几项研究在环境水、牛奶或血清中进行了回收实验，报告的回收率通常在85–106%之间，RSD可接受，表明在许多情况下样品制备最少后仍具有实际应用性[49,51,53,54,57,59]。还报告了与参考方法的比较：一种一次性SPE碱性磷酸酶（AP）测定与LC-APCI-MS/MS在牛血清分析中显示出一致性[56]，以及一种基于纸的无标记免疫传感器与商业ECL系统进行了比较，相对偏差适中[62]。

2.2.6. 实际限制和机会
回顾的文献强调了影响传感器设计的各种实际考虑因素。例如，在酶测定方面，尽管酶测定具有显著的信号放大效果，但酶活性会逐渐下降。例如，在一项涉及流式细胞分析HRP活性的研究中，观察到HRP活性在两周内显著下降，表明在没有冷藏和稳定剂的情况下存在稳定性限制[53]。另一方面，一次性涂层电极的保质期不稳定，一种SPCE格式在冷藏储存21天后仍保留约75%的信号，尽管其寿命仍取决于储存条件和表面化学[49]。就单个测试的成本考虑而言，具有稳健再生协议的可重复使用传感器将更加实用。例如，在一项涉及AuNP-半胱胺SAM传感器的研究中，观察到该传感器在100次重复使用后仍保持其分析性能[58]。

在实际应用方面，测定的实用性很大程度上取决于测定时间和复杂性。尽管在涉及电容测量的无标记检测方法中，检测可以在几分钟内完成[60,61]，但在需要更复杂协议的检测中，如纳米粒子结合和MOF标记以及过夜孵育，整体检测时间可能会受到影响[50,51,57]。对于即时检测设备而言，检测成本仍然起着重要作用，尽管经过优化的纸质微流控设备已经显示出以每个设备仅0.30美元的成本开发此类设备的可能性[62]。展望未来，传感器设计还有几个优化方向。比率内部参考系统结合双模式读数可能提高对基质效应的鲁棒性[57]。ECL和纳米粒子淬灭技术可以扩展检测的动态范围，并将灵敏度提高到fg/ml级别[50]。此外，进一步优化抗体的定向固定方法（提供蛋白质G、巯基化蛋白质G、链霉亲和素-生物素化学的支架）可能有助于提高重复性并减少非特异性反应[52, [53], [54]]。结合这些先进的稳定和标记技术对于实现低检测限（LOD）、样品适用性和合理的检测通量至关重要。表2总结了用于E2的电化学免疫传感器，包括竞争性检测设计、固定和标记策略、信号转导机制以及分析指标。

表2. 免疫传感器
生物识别元件 标记/放大 线性范围（M） LOD（M） 选择性面板 稳定性 基质/验证
小鼠抗雌二醇mAb（2F9）通过兔抗小鼠IgG固定 ALP-E2结合物 9.2 × 10^?11 - 1.8 × 10^?9 1.8 × 10^?10 未报告 未报告 提取的人血清[55]
单克隆抗雌二醇Ab（m-E2） 碱性磷酸酶（AP）标记（直接标记的抗体；p-APP底物） 9.0 × 10^?12 - 9.2 × 10^?9 9.2 × 10^?13 17α-雌二醇、雌酮、雌三醇、孕酮 4°C下21天（约75%信号保留） 缓冲液、蒸馏水、河水、自来水[49]
兔抗雌二醇Ab（多克隆） 雌二醇-碱性磷酸酶（AP）结合物 1.1 × 10^?10 - 5.5 × 10^?10 5.5 × 10^?11 睾酮、甲基睾酮、孕酮 4°C下8天（含防腐剂） 未提取的牛血清[56]
单克隆抗雌二醇Ab HRP标记的雌二醇 9.2 × 10^?11 - 5.5 × 10^?9 2.2 × 10^?11 未报告 4°C下2周后信号下降44% 加标的人血清[53]
单克隆小鼠抗雌二醇Ab 雌二醇-BSA结合物 7.3 × 10^?11 - 8.1 × 10^?9 4.4 × 10^?11 17-乙炔雌二醇、孕酮、睾酮 未报告 自来水、河水（加标）[52]
生物素化单克隆抗雌二醇Ab（小鼠） HRP标记的雌二醇 3.7 × 10^?12 - 9.2 × 10^?10 2.8 × 10^?12 孕酮、睾酮、皮质醇、雌酮 8°C下约9天（潮湿环境） 人血清、尿液[54]
抗雌二醇Ab（单克隆） HRP-GO-Ab结合物（竞争性免疫检测） 1.5 × 10^?10 - 2.6 × 10^?8 7.3 × 10^?11 1-氨基蒽醌、2-甲氧基萘 4°C下28天后保留83% 水、牛奶[51]
抗雌二醇Ab（单克隆） Cu2+标记的抗原（E2-BSA-Cu） 1.8 × 10^?13 - 3.7 × 10^?7 5.5 × 10^?14 二乙基己基酚（同时存在）、孕酮、雌三醇 在重复测量中稳定性良好 水、牛奶[59]
抗雌二醇Ab（单克隆） 未标记抗原/未标记抗体（无标记HRP-H2Q-H2O2共底物系统） 1.98 × 10^?15 - 5.00 × 10^?11 3.1 × 10^?15 孕酮、雌三醇 可重复性良好；电极可重复使用约100次 牛血清[58]
抗17β-雌二醇Ab（单克隆） 无（无标记电容免疫传感器） 1.8 × 10^?14 - 3.7 × 10^?12 3.7 × 10^?15 斯蒂格玛甾醇（18%） 4°C下14天后保留约70% 包装饮用水[60]
抗雌二醇Ab（单克隆） 无标记（基于MWCNTs/AuNPs的THI氧化还原介质） 3.7 × 10^?14 - 3.7 × 10^?10 3.7 × 10^?14 FSH、LH、Glu、AA、UA、NSE、CEA 稳定性良好；重复性CV = 2.82% 临床血清[62]
抗17β-雌二醇Ab（单克隆） 无（无标记电容ZnO纳米棒免疫传感器） 3.7 × 10^?14 - 7.3 × 10^?10 3.7 × 10^?14 未报告 稳定性良好；%RSD = 4.35 缓冲液[61]
抗雌二醇Ab（单克隆） PANI@AuNPs-BSA-E2淬灭剂（双机制ECL淬灭：能量+电子转移） 3.7 × 10^?17 - 7.3 × 10^?7 3.7 × 10^?18 DES、雌三醇、雌酮、EE、BPA、DDT、TCDD 7天后ECL保留率超过90% 湖水、牛奶[50]
抗雌二醇Ab（单克隆） Cd2+（参考）+ Cu-MOF-E2-BSA（指示剂）；比率DPV和i-t双模式 3.7 × 10^?15 - 3.7 × 10^?8 1.7 × 10^?15 正壬基酚、雌酮、DES、BPA、葡萄糖、尿酸 操作稳定性良好（比率RSD = 3.2% 湖水、自来水[57]
2.3 基于分子印迹聚合物（MIP）的E2电化学传感器
2.3.1 选择MIPs用于E2检测的原因
由于MIPs在电化学检测中具有高选择性和鲁棒性，它们已被广泛用于E2的合成识别。多项研究利用电聚合MIPs在电极表面直接形成薄而贴合的识别层，从而实现快速电子转移并整合到伏安法检测方案中[63, [64], [65], [66]]。其他研究使用了基于块体的MIPs，如溶胶-凝胶薄膜、磁性核壳MIPs和聚合物纳米粒子，以实现形状和功能特异性识别，适用于从GCEs到SPEs再到CPEs的各种电极配置[67], [68], [69], [70]]。因此，从上述文献可以看出，使用MIPs进行小分子E2检测是基于它们对E2的高选择性和在温和化学和热应力下的鲁棒性[65,67]。
2.3.2 MIP制备策略
为了满足不同的实际需求，所调查的研究采用了多种聚合方法。具体来说，这些方法包括用于表面限制识别的电聚合、用于合成颗粒状MIP的热引发或UV引发的聚合，以及用于生成刚性无机-有机杂化层的溶胶-凝胶技术。
电聚合薄膜：将多个导电单体直接电聚合到电极上形成MIP薄膜。通过循环伏安法（CV）电聚合聚吡咯，在丝网印刷的金电极（SPGE）上印制出聚吡咯MIP薄膜，支持E2的线性扫描伏安检测[63]。同样，Bai等人使用CV将吡咯电聚合到经过CuxO/花状MXene复合材料改性的GCE上，形成用于DPV检测的表面MIP[64]。电聚合的聚咪唑MIP层也沉积在氧化石墨烯（GO）/Ag纳米粒子改性的GCE上，用于基于SWV的检测，具有fM灵敏度[65]。电聚合方法能够形成薄而粘附的薄膜，便于快速模板去除和直接电化学检测[63], [64], [65]]。
热和UV引发的聚合及表面印迹：热自由基聚合产生了用于碳糊电极（CPEs）的MIP颗粒；例如，使用4,4′-偶氮二(4-氰基戊酸)（ACPA）引发剂进行热聚合，生成的MIP颗粒可用于基于吸附剥离伏安法的检测[68]。通过热聚合在磁性Fe3O4@SiO2核心上进行表面印迹，生成磁性分子印迹聚合物（MagMIP）颗粒，这些颗粒被滴铸到CPE基质中，用于差分脉冲吸附剥离伏安法（DPAdSV）检测E2[69]。UV引发的溶液/悬浮液聚合（2,2′-偶氮二(2-甲基丙腈)）用于在GCE上沉积甲基丙烯酸（MAA）/乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）MIP薄膜，实现血清中的宽范围电化学检测[71]。
溶胶-凝胶方法和混合薄膜：溶胶-凝胶化学被用来创建用于E1检测的刚性MIP薄膜，其中苯基三甲氧基硅烷和甲基三甲氧基硅烷作为功能单体，四乙基正硅酸盐（TEOS）作为交联剂；这些薄膜与ECL检测兼容，因为三(2,2′-联吡啶)钌(II)在Nafion/多壁碳纳米管（MWCNT）-COOH平台上的稳定固定[67]。因此，溶胶-凝胶MIPs提供了热/化学稳定性和无机网络，可以稳定嵌入的报告分子并提高薄膜的耐用性[67]。
模板去除程序因聚合物类型而异：对于磁性表面印迹MIPs使用甲醇/醋酸洗涤[69]，对于溶胶-凝胶E1 MIP使用热水冲洗[67]，至少有一项热块体MIP研究在模板去除过程中报告了电化学监测[68]。一些电聚合系统依赖于CV驱动的提取或溶剂洗涤来暴露结合位点[63,66]。
2.3.3 导电复合材料和纳米材料增强的MIPs
报告中的一个共同主题是使用导电纳米材料和复合材料来增强转导、增加电活性表面积并提供内部参考信号。
MXene和混合价态金属氧化物作为比率平台：Bai等人将混合价态的CuxO/Cu2O-CuO复合材料锚定在花状Ti3C2Tx MXene上，创建了一个双峰比率传感器，其中CuxO信号提供内部参考（ICuxO），而MIP调节的E2信号（IE2）通过DPV测量；比率IE2/ICuxO策略实现了高灵敏度和对信号漂移的改进稳定性[64]。
碳纳米材料和金属纳米粒子：氧化石墨烯与电沉积的Ag纳米粒子结合，支持电聚合的聚咪唑MIP，当通过SWV检测时具有fM检测限和宽线性范围[65]。金功能化的羧基化多壁碳纳米管（Au@MWCNT-COOH）用作导电支架，在GCE上的电聚合分子印迹膜下，支持复杂基质中E2的SWV定量[66]。MWCNT-COOH和Nafion用于固定Ru(bpy)3，用于ECL溶胶-凝胶MIP传感器检测雌三醇，MWCNT-COOH既提供导电性又增加了结合位点密度[67]。
纳米粒子MIP和复合糊：磁性Fe3O4@SiO2核心在加入碳糊电极（MagMIP改性CPE）时便于分离和浓缩[69]。无表面活性剂的乳液聚合产生了嫁接在MWCNT-GMA上的MIP纳米粒子，这些纳米粒子被纳入Nafion涂层的SPCE中，用于农业废水分析[70]。在碳糊基质（CPE-MIP-CB）中加入炭黑，以增加活性表面积，用于吸附剥离伏安法检测E2[68]。这些材料策略共同展示了导电和纳米结构支撑如何将基于MIP的识别放大为稳健的电化学信号，适用于伏安法和ECL读数[64,65,67]。
2.3.4 分析性能趋势和实际样品中的验证
基于MIP的E2电化学传感器在灵敏度上跨越多个数量级，并已在多种基质中得到验证。
灵敏度和动态范围：报告的LOD根据转导化学和纳米材料增强而大不相同。在所调查的工作中，最灵敏的电化学MIP系统是在GO-AgNP改性的GCE上的电聚合聚咪唑MIP，其LOD为3.01 fM，线性范围为10 fM至250 nM[65]。He等人报告了一种在Au@MWCNT-COOH/GCE上的电聚合l-精氨酸分子印迹膜（MIM），其线性范围为1 × 100至1 × 10^?6 M，LOD为3.33 × 10^?11 M[66]。另一方面，块体和基于颗粒的MIPs在糊状电极中产生的LOD为微摩尔级别：MagMIP改性的CPE的LOD为0.13 μM[69]，而碳糊MIP-碳黑电极在DPAdSV检测中的LOD为0.03 mmol/L（30 μM）[68]。在SPGE上的电聚合聚吡咯表现出中等性能，LOD为0.00836 ppm（≈8.36 μg/L），线性范围为0.5–10.0 ppm[63]。比率MXene/CuxO支持的聚吡咯MIP实现了低皮摩尔LOD（6.9 pM），线性范围为20 pM至10 nM[64]。UV引发的MAA/EGDMA MIP薄膜在应用于血清时，LOD为0.1 nM，线性范围极宽（0.001–100 μM）[71]。
在实际基质中的验证和回收率：多项研究在环境和生物样品中验证了传感器，回收率令人满意。Bai等人在人工尿液、真实女性尿液、全乳和胎儿牛血清中验证了他们的MXene-CuxO MIP传感器，回收率在92.8%至102.6%之间，RSD低于4.45%[64]。He等人将电聚合MIM应用于加标水、牛奶、猪肉和人血清，回收率为96.6–111.1%，RSD约为4.7–8.6%[66]。溶胶-凝胶MIP ECL工作针对E1进行了验证，并与河水及LC-MS/MS进行了比较，显示出强一致性（相对偏差0.1–4.1%[67]。磁性-MIP CPE和纳米粒子-MIP SPCE分别应用于河水和农业废水，回收率约为96–105%[69,70]。碳糊MIP检测器在研究中使用的高浓度下对加标河水的回收率为103–105%[68]。
选择性评估：选择性测试的范围各不相同。Bai等人进行了广泛的抗干扰评估，包括结构类似物二乙基己基酚（DES）和常见的小干扰物（双酚A-BPA、双酚S-BPS）和离子，显示出在10 nM竞争物浓度下对1 nM E2的强选择性[64]。Regasa等人评估了常见的酚类和甾体干扰物，并报告了良好的区分能力，直至fM目标范围[65]。一些基于颗粒的MIP显示出显著的交叉反应性：MagMIP CPE对E1的响应强烈（95.7%），而热块体MIP颗粒对EE2的响应高（97.3%）[68]。在SPGE上的电聚合聚吡咯在测试条件下显示出对睾酮的选择性[63]。
2.3.5 实际问题：模板泄漏、污染、再生、重复性
MIP基传感器的实际应用引发了一些反复出现的问题，这些问题在不同研究中得到了不同程度的解决。
模板去除和泄漏：一些工作明确报告了模板提取程序，包括使用溶剂洗涤（甲醇/醋酸）去除MagMIP颗粒[69]，热水冲洗去除溶胶-凝胶薄膜[67]，以及电聚合薄膜的电化学/溶剂程序[63,68]。然而，并非所有研究都报告了详细的去除协议，且没有总结包括随时间变化的残留模板泄漏的定量评估，这仍然是一个未解决的操作问题[63,71]。
污染和再生：几种电极架构允许简单再生。带有颗粒/MIP层的碳糊和SPEs可以通过抛光或相反，一些MIP层显示出有限的长期机械稳定性：一份报告[71]指出，UV铸造的MIP层在环境储存四天后开始退化。稳定性和可重复性：许多研究探讨了储存稳定性和电极间的可重复性。Bai等人报告称，他们的MXene/CuxO MIP系统在30天后信号保留率为92.9%[64]。Regasa等人观察到，在八次提取/重新结合循环后性能保留率仍超过90%，其他研究也报告了在多周储存期间的保留率约为89-90%[65,66]。已验证的矩阵的相对标准偏差（RSD）通常是可以接受的：例如，Bai等人的RSD在各个矩阵中低于4.45%，He等人的RSD在复杂样本中约为4.7-8.6%[64,66]。表3概述了基于MIP的电化学E2传感器，比较了压印/制造方法、电极修饰剂、测量模式以及由此产生的灵敏度/选择性和实际样品适用性。

表3. 基于MIP的生物传感器。

**聚合方法**
**功能单体/交联剂**
**提取/重新结合条件**
**线性范围（M）**
**检测限（LOD）（M）**
**选择性**
**稳定性**

**电聚合**
咪唑（单体）+ GO + AgNP（纳米复合材料修饰剂）
提取：PBS:丙酮（4:1），12分钟；重新结合：9分钟
河水（添加样品）
1.0 × 10^?14 - 2.5 × 10^?7
3.0
1 × 10^?15
酚类、儿茶酚、胆固醇、氢醌
25天后保留率约为90%；45天后保留率为89.65% [65]

**块状/表面压印**
甲基丙烯酸（MAA）/乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）
提取：甲醇/醋酸（9:1），索氏提取；重新结合：10分钟
河水（添加样品）
5.0 × 10^?7 - 1.4 × 10^?5
1.3 × 10^?7
雌酮、氢醌、 carbendazim
重复性RSD为3.2% [69]

**用于碳糊电极的块状聚合MIP颗粒**
甲基丙烯酸（MAA）/乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）
提取：甲醇/醋酸（9:1）+ 甲醇 + 水；重新结合：未指定时间步骤
河水（添加样品）
51.0 × 10^?7 - 2.3 × 10^?5
3.0 × 10^?8
氢醌、尿酸、carbendazim；EE2
河水样品（三次重复）：RSD 0.10–0.18；回收率103–105% [68]

**乳液聚合**
N-甲基丙烯酰-L-半胱氨酸（MAC）/HEMA / EGDMA
提取：1 M NaCl；重新结合：流动条件
人工尿液和血清
1.0 × 10^?11 - 3.0 × 10^?9
2.3 × 10^?10
胆固醇、豆甾醇、雌二醇异构体
可重复使用最多4次 [70]

**电聚合**
L-精氨酸（L-Arg）/无交联剂
提取：乙醇/醋酸（4:1），8分钟；重新结合：150秒
水、牛奶、猪肉、人血清
1.0 × 10^?10 - 1.0 × 10^?6
3.33 × 10^?11
雌酮、雌三醇、DES、多巴胺、维生素C、葡萄糖、尿酸、Na+、K+
7天后保留率约为90% [66]

**溶液/悬浮聚合（滴铸MIP薄膜）**
甲基丙烯酸（MAA）/乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）
提取：甲醇洗涤；重新结合：未指定
人血清
1.0 × 10^?9 - 1.0 × 10^?4
1.0 × 10^?10
双酚A、孕酮
保留率约为98%；稳定性约为4-5天 [64]

**3. 电极平台和纳米材料工程**
3.1. 范围和章节路线图**
本章概述了用于E2电化学生物传感的电极基底和纳米材料工程，强调了平台类别、材料作用、界面化学、抗污染/基质策略以及在实际复杂样品中实现稳健传感的实用制造指导[72]。我们将通用平台/纳米材料分类（例如，塑料和纸上的SPEs、光刻Au芯片/盘、玻璃碳、ITO、柔性/可穿戴和微型线格式、碳纳米材料、贵金属、2D材料如MXenes/石墨烯以及MOF杂化物）与表3中编译的E2特定案例研究相结合，以将技术选项与已展示的实现和性能联系起来[73]。章节从综合概述（表4）逐步过渡到特定平台的部分，包括纳米材料工具箱和机械作用、界面固定方法、抗污染/基质处理和稳定性，最后是实用工程工作流程和集成路径，以指导设计选择[74]。图5展示了E2生物传感器中常用的表面工程架构的统一视图。

**表4. 电极平台和测量技术**

**识别类型**
**电极/基底**
**纳米材料/掺杂剂**
**固定策略**
**电化学技术**
**参考文献**

**适配体**
Au—生物素-链霉亲和素（非共价）
SWV, CV [37]
适配体
GCE
Au, CoSAu
Au-S相互作用（共价）
DPV, EIS [39]
适配体
Au—Au-S相互作用（共价）
EIS [38]
适配体
BDD
Au
Au-S相互作用（共价）
EIS [42]
适配体
GSE
CuS, Au
Au-S相互作用（共价）
CV, DPV [43]
适配体
GSE—EDC/NHS（共价）
EIS [44]
适配体
Au—Au-S相互作用（共价）
CV, DPV [45]
适配体
ITO；生物阳极：CNC/AuNP/ITO
生物阴极：CNC/AuNP/ITO
CNCs, AuNPs, PMNPs
滴铸
CV, EIS, E_OCV [46]
适配体
Au
AuNPs
DNA杂交
EIS, CV, DPV [47]
适配体
LIG
Au, ZIF-8
Au-S相互作用（共价）
EIS, CV, SWV [48]
免疫传感器
SPCE—被动吸附
CV [49]
免疫传感器
GCE
AuNPs, PANI
吸附
ECL, EIS, CV [50]
免疫传感器
GCE
GO, Graphene, PANI
共价
DPV, EIS [51]
免疫传感器
Au
AuNPs
亲和力/SAM
安培法, CV, SWV [53]
免疫传感器
Au—亲和力/SAM
SWV [52]
其他
SPCE
rGO, GO, Graphene
吸附
SWV, CV [75]
免疫传感器
Au
AuNPs
吸附
SWV, CV [58]
免疫传感器
SPCE—共价
安培法 [54]
免疫传感器
SPCE—被动吸附
DPV, CV [55]
免疫传感器
银线（直径=0.25毫米）双电极设置；（有效表面积为7.85平方毫米）—共价
EIS [60]
免疫传感器
银（Ag）线与ZnO纳米棒（Ag-ZnONRs）—共价
EIS [61]
免疫传感器
SPE—被动吸附
DPV [56]
免疫传感器
SPCE
AuNPs, MWCNTs, THI
吸附
DPV, CV, ECL [62]
免疫传感器
GCE；AuMOFA
亲和力/SAM
DPV, EIS, 安培法, 计时安培法 [57]
免疫传感器
GCE
Graphene
π-π堆叠
EIS [59]
MIP
GCE
FL-Mxene, CuxO
电聚合
DPV（比率信号IE2/ICuxO），CV, EIS [64]
MIP
Au；CPE
碳黑
其他
DPV [68]
MIP
GCE
MWCNT, CNT, Au
电聚合
SWV, CV, ECL [66]
MIP
GCE
AgNPs, GO, Graphene
电聚合
SWV, CV [65]
MIP
CPE—吸附
差分脉冲吸附剥离伏安法（DPAdSV），CV, EIS [69]
MIP
GCE—滴铸
DPV, CV, 安培法 [71]
MIP
SPCE
MWCNT, Nafion
吸附
DPV, CV [70]

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**图5. 用于构建β-雌二醇（E2）电化学生物传感器的典型表面工程“堆栈”以及用于读数的测量格式。示意图总结了从电极基底（例如，SPE, GCE, Au）开始的常见构建顺序，接着是纳米材料层（例如，rGO, CNTs, AuNPs, MXene）以增强表面积和电荷转移，以及连接剂/锚定化学（例如，EDC/NHS偶联、巯基自组装、重氮基接枝、π-π相互作用）以实现稳定的功能化。然后引入生物识别层（适配体、抗体或MIP），并应用阻挡/抗污染涂层（例如，BSA, PEG, 两性离子层, Nafion）以减轻非特异性吸附并提高在复杂基质中的性能。随后通常使用CV进行电化学表征来评估界面，同时使用DPV/SWV/EIS来测量分析信号。**

**3.2. E2电极平台的综合概述**
为了能够并行评估免疫传感器、适配体传感器和MIP的平台设计和工程权衡，表4总结了每项调查的E2研究中使用的电极基底、纳米材料修饰剂、指定作用、固定化学和电化学测量技术。该表使读者能够将诸如SPCE与Eu2O3@rGO、带有SAM/链霉亲和素支架的Au芯片、带有石墨烯-聚苯胺/PAMAM-Au和酶标签的GCE以及带有AuNP/DNA/QDs组件的ITO等基底-修饰剂配对与其不同的分析用途联系起来。这些作用包括增强导电性、增加活性传感表面积、为生物受体固定提供稳定锚点、生成内部参考信号以及在DPV、SWV、EIS、ECL和PEC读数下促进电催化过程。**

**3.3. 打印和基于纸张的平台**
SPEs，包括SPCEs和SPGEs（丝网印刷金电极）、交错微电极（SP-IDMEs）、多工作电极阵列、纸基微流控集成以及柔性/可穿戴变体，依赖于制造商的专有参数来确保墨水成分和固化的一致性[73]。基于纸张的平台使用纤维素基底，结合丝网印刷、激光刻写或铅笔绘制的碳轨迹。这些可以集成到可折叠的折纸或弹出式微流控设计中，其中毛细流动使得无需泵即可操作，适用于便携式使用[74]。关于打印和基于纸张的E2研究包括通过被动吸附和阻挡构建的碳SPCE免疫传感器[49,55,56]，用Eu2O3@rGO改性的SPCE来催化E2氧化[75]，结合EDC/NHS激活的聚合物微球的SPCE适配体传感器用于共价适配体连接[41]，带有电聚合聚吡咯MIP的SPGE [63]，以及用MWCNT/Thionine(THI)/AuNP纳米复合材料改性的纸基印刷工作电极用于无标记免疫检测[62]。预处理通常包括对碳SPEs进行电化学激活和通过滴铸或电沉积进行局部修饰，以实现一次性格式上的可重复电活性和空间限制的功能化[73]。

**3.4. 光刻Au芯片、Au盘和基于导线的配置**
通过溅射/光刻制造的Au微电极芯片已经用羧基终止的SAMs、EDC/NHS耦合的链霉亲和素和生物素化适配体进行了功能化，并在铁氰化物介质中使用SWV/EIS读数[37]。Au盘免疫传感器在巯基化中间层（例如，半胱胺SAM + 化学吸附的AuNPs）上使用AuNP支架，以恢复和增强电子转移并支持抗体固定，并通过蛋白质阻挡和在酸性介质中的再生来抗污染[53,58]。通过丙硫醇在Au上稳定的潜在沉积Cu单层最小化了非特异性吸附，并提供了对巯基化蛋白质G支架的强亲和力，用于定向抗体展示[52]。微型双电极线传感器包括带有11-MUA SAMs的Ag线，与EDC/NHS抗体耦合用于电容传感，以及带有磷酸酯SAMs改性的Ag线用于EIS/电容传输在小体积中[60,61]。

**3.5. 玻璃碳和氧化物/2D改性电极**
在玻璃碳电极上，使用石墨烯-聚苯胺和PAMAM-Au复合材料作为导电换能器，羧基化的GO支持高负载的HRP-GO-Ab催化标签，利用GOCOOH进行酶/抗体结合[51]。在2D硫化物纳米片上的适配体换能器上使用MCH填充物和MB读数，以利用增加的电活性面积和Au-巯基固定[39]。通过顺序沉积AgNP、GO电沉积和咪唑的电聚合在GCE界面构建了MIP复合材料[65]。基于MXene的2D杂化物包括Cd2+/Au/pDA/Ti3C2复合材料，既作为支撑也作为内部参考，与Cu-MOF标签配对用于比率DPV和计时安培法[57,64]。金属氧化物ECL发射器通过滴铸在GCE上，并与PANI@AuNP淬灭剂结合通过EDC/NHS组装，以构建双机制淬灭免疫传感器[50]。

**3.6. 碳糊和块状改性电极**
块状改性的碳糊电极将MIPs和碳黑结合到糊中（CPE-MIP-CB），调整修饰剂负载以平衡电荷转移阻力与对压印腔的访问[68]。通过混合Fe3O4@SiO2支持的MIPs制备的磁性MagMIP-CPEs通过简单抛光提供选择性识别和可再生表面[69]。溶液合成的MIPs也可以作为薄膜滴铸在抛光的GCE上，以提供直接的压印识别涂层[71]。

**3.7. 纳米材料工具箱和机械作用**
碳纳米材料，包括石墨烯/rGO、Carnob纳米管（CNTs）、碳黑和石墨烯量子点，增加了多个电极平台上的电活性表面积、生物受体负载能力和电子转移动力学[73]。金属纳米结构如AuNPs、Ag、Pt和Pd提供了导电路径、Au-巯基固定位点和催化增强，而介导剂纳米颗粒如普鲁士蓝适用于一次性SPE和纸张环境[74]。2D材料，包括MXenes和石墨烯衍生物，提供了高导电性、可调表面终止和与微流控和可穿戴集成兼容的机械灵活性[76]。金属有机框架和MOF衍生物复合材料提供了高表面积用于预浓缩、多孔结合环境、电催化中心以及防止嵌入纳米颗粒聚集或溶解[72]。在石墨烯家族中，rGO恢复了导电性，而GO上的氧化位点和连接剂化学（例如，1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（PBASE），EDC/NHS）支持控制的固定；用BSA、聚乙二醇（PEG）和Tween-20进行阻挡，减少了在便携式/读数系统中的非特异性吸附[77]。

**3.8. 抗污染、基质处理、稳定性和可重复性**
抗污染策略包括在Au上的三元SAMs/MCH钝化、聚多巴胺涂层、BSA阻挡、乙醇胺淬灭残留的COOH以及在SPCE上的PVA阻挡，以减少在血清、尿液和水基质中的非特异性吸附[73]。纸/折纸微流控利用毛细流动和试剂堆叠来减轻基质效应，而介质选择和设备几何形状允许在便携式格式中以低电位操作以抑制干扰[74]。MOF/碳复合材料和MIP层提供了选择性，但可能会引入非特异性吸附或水性稳定性问题，通常需要在血清、尿液和水中进行跨基质验证以确定适用性[72]。表3中的稳定性和重复性示例包括一次性SPE的短期储存、可再生的基于Au的免疫传感器、可重复使用的适配体EIS电极、能够进行多次洗脱/重新结合循环的MIP接口，以及在不同EC/ECL/PEC模式下修改电极的多周储存数据。

**3.9. 实用工程指导和集成路径**
丝网印刷实现了低成本的大规模生产可重复的一次性传感器，墨水配方和固化条件决定了批次可重复性，打印最适合平面基底[73]。基于纸张的工程利用激光刻写、喷墨/数字分配、模板和3D打印，具有不同的分辨率和废物方面的权衡；毛细作用消除了对泵的需求，并支持智能手机/迷你电位计的连接，适用于即时护理和可穿戴设备[74]。MXene薄膜可以通过溶液处理（DPV还用于读取氧化还原指示剂标签：一种适配体传感器，其中MB与富含鸟嘌呤的cDNA结合，并通过DPV测量MB峰值电流作为分析信号，而仅使用铁氰化物进行电极表征[39]。SWV常用于介体阻断或直接氧化/还原酶产物的报告机制。早期的适配体芯片通过SWV测量了5 mM铁氰化物介体下的电流抑制（目标结合时信号降低）[37]。免疫辅助和酶辅助的竞争性格式也使用SWV：Monerris等人通过HRP/H2O2化学反应后，使用SWV检测酶生成的邻苯醌[58]。除了简单的峰值电流检测外，多项研究还实施了比率或多峰DPV策略以提高鲁棒性。例如，使用CuxO/MXene MIP平台的双峰内部参考DPV（IE2/ICuxO比率读数），以及分别使用Cd2+和Cu-MOF氧化峰作为内部参考和报告剂的双模DPV[57,64]。分子印迹传感器还采用吸附剥离变体DPAdSV或DPV进行模板去除/分析，以提高对非酶目标的灵敏度[68,69]。

4.3 无标记接口中的阻抗读数（EIS）
EIS是无标记、基于亲和力的测定的主要读数方法。适配体传感器利用EIS测量目标结合时电荷转移电阻（Rct）的变化（“信号开启”或阻断响应），使用铁氰化物作为法拉第探针，以适应Randles电路[38]。综述强调，无标记EIS和伏安法介体阻断格式是E2适配体传感中的常见方法[35]。阻抗或电容非法拉第读数也用于抗体传感器：微型双电极电容免疫传感器无需氧化还原介体即可报告直接电容变化，从而实现快速、低体积的测定[60,61]。EIS通常既作为主要读数（无标记检测），也作为逐步电极修改的表征工具，通常使用[Fe(CN)6]3-/4-作为氧化还原探针进行界面诊断[38,57]。

4.4 安培法和酶联格式
安培读数和酶标记在许多免疫传感器设计中仍然占据中心地位。一次性丝网印刷安培免疫传感器使用碱性磷酸酶（AP）或HRP标记物，这些标记物产生可电活化的产物，通过稳态电流进行测量（例如，在+300 mV下测量AP → 对氨基酚；通过安培法测量HRP → 邻苯醌的还原[49,53]。保持酶结合物在溶液中的竞争性格式利用DPV/SWV来量化酶产物（例如，通过DPV检测ALP产生的1-萘酚[55,56]）。混合电化学模式也存在：计时安培i-t测量与催化纳米材料（例如，Cu-MOF催化H2O2）结合，提供时间分辨电流作为分析信号，同时DPV捕获伴随的金属离子氧化峰用于比率读数[57]。

4.5 实际可比性
表4中显示了一些实际模式：铁氰化物仍然是CV/EIS中最常引用的表征探针，而MB、硫辛酸和其他氧化还原指示剂作为共价或非共价连接的报告标签在适配体测定中反复出现。最近的报告明确使用了比率法和双模策略（电化学/光电化学或内部参考DPV峰）来提高稳定性和抗干扰性能[40,64]。许多研究包括了具体的支持电解质和介体浓度、伏安脉冲参数或孵育时间，强调这些实验细节对于跨研究比较和重复性至关重要[37,39,41]。在回顾的E2生物传感研究中，伏安脉冲技术（DPV/SWV）和阻抗测量（EIS或电容读数）作为主要分析格式；DPV/SWV经常与酶或氧化还原标签结合以放大电流/峰信号，而EIS和非法拉第电容测量则适用于无标记亲和力检测。安培法和计时安培催化读数在酶标记和电催化纳米粒子测定中继续发挥重要作用[49,53,57]。最近的研究显示，越来越多地使用比率法和双模读数来提高鲁棒性和减少干扰，这表明了电化学E2传感方法发展的当前方向[40,64]。

5. 讨论：实际样品分析、干扰、可比性和展望
5.1 实际样品：正在验证的内容及其方法
环境水体在各种格式的实际样品演示中占主导地位，包括河流、自来水、湖泊、废水以及一般的“水”样品，无论是免疫测定还是（生物）无识别电分析设计[39, [40], [41], 44, 49, 61]。仅过滤的工作流程在水测试中很常见，例如在双模适配体测量前对湖水进行过滤，或在SWV或DPAdSV读数前对河水进行离心/过滤[39, 57, 61, 63]。一些水测定完全避免预处理，例如一次性SPE安培免疫传感器直接用于河水和自来水，以及依赖电极阻断和竞争化学的丝网印刷协议[49, 54]。相反，也有报道在分析前对水进行固相提取，这表明即使在同一基质类别内，样品制备方法也多种多样[52]。图6总结了用于E2传感的主要电化学识别策略，并强调了它们在代表性实际样品基质中的应用。

图6展示了多种生物传感器策略，包括适配体传感器、免疫传感器、基于酶的传感器以及基于分子印迹聚合物（MIPs）、石墨烯、碳纳米材料和基于金属的纳米结构的传感器。这些生物传感器表现出高灵敏度和特异性，能够快速检测血液、尿液、牛奶和水等生物和环境样品中的17β-雌二醇（转载自[26]并已获得许可）。生物基质在各种格式和预处理强度中的分布不均，“血清”、“尿液”和“牛奶”经常与加标基质和认证对照品一起出现[36, 50, 54, 55, 58]。值得注意的是，未经提取的牛血清可以直接通过DPV或竞争性AP免疫测定进行测量，并通过LC-MS/MS或HRP淬灭方法进行确认，而早期的SPCE DPV测量需要在测量前用乙醚提取血清[55, 56]。人血清通过认证材料或临床样本与参考方法进行验证，体现了无标记和标记电化学读法的临床应用[54, 62]。尿液出现在适配体和MIP格式中，据报道稀释因子为10^2–10^3，以减轻基质对阻抗和DPV测量的影响[38, 39, 64]。牛奶被广泛用作免疫传感器和MIPs的测试介质，强调了E2检测在食品安全背景下的重要性[50, 51, 57, 64]。其他生物流体，如唾液，也已被成功分析。特别是，SWV电催化Eu2O3@rGO/SPCE系统仅需要简单稀释即可进行样品制备，这表明在酸性支持电解质中操作替代生物流体的可行性[75]。

当前文献揭示了两种主要的方法学模式。首先，水样品的分析通常需要最小的预处理或简单的过滤或稀释。相反，生物基质往往需要严格的提取（例如，SPCE-DPV的乙醚提取）或依赖于表面阻断和竞争化学的专门协议[52, [54], [55], [56]]。其次，比率法和内部参考策略在水和牛奶/血清验证中越来越常见，作为一种抑制基质诱导变异性的方法，而无需复杂的样品处理[40, 50, 57, 64]。

5.2 干扰和选择性：常规测试的内容及未测试的内容
干扰面板强烈反映了共存类固醇和酚类物质的化学性质，E1、E3、EE2、P4、睾酮和BPA经常被用来评估抗体、适配体和MIP基设计之间的交叉反应性[41, 49, 50, 52, 57, 64]。这些面板通常通过包含DES和壬基酚来强调结构相似性，在某些情况下，化合物以高倍数过量存在以探测复杂背景下的选择性边际[41, 49, 57]。选择性测试还包括非甾体芳香族化合物和染料，如2-甲氧基萘或1-氨基蒽醌，作为阴性对照，特别是在早期的适配体工作和混合无标记读数中[38, 39, 51]。除了分子类似物外，还有几项研究检查了实际水或生物流体中可能存在的电活性干扰物、阳离子/阴离子和生物分子背景物质，包括抗坏血酸、尿酸、多巴胺、常见离子和蛋白质，在非生物电催化平台和选择性MIP层中，即使在10倍过量时也报告了可容忍的信号变化[65, 66, 69, 75]。然而，许多研究仅评估单一干扰物而不是混合物，而且干扰测试通常在缓冲液或简化基质中进行，即使传感器最终应用于实际样品，这也表明选择性筛选条件与目标基质的组成复杂性之间存在差距[51, 54, 62]。阻断和钝化步骤，如BSA、牛奶蛋白、MCH或乙醇胺，被广泛用于管理非特异性吸附，但很少有工作在真实基质中纵向量化抗污染性能，尽管已经成功证明在储存或重复使用几天到几周内信号稳定[39, 54, 58]。尽管如此，测试的干扰物范围仍在扩大，比率内部参考和选择性印迹腔体越来越多地被用来抑制共存酚类和氧化还原活性物质的模糊响应[40, 57, 64, 65]。

5.3 分析性能指标的可比性：为什么LOD和范围不能直接比较
由于传感器模式、转换化学和测定方法在测量共同分析物方面的差异，分析性能指标（如LOD和线性范围）的比较并不容易[38, 50, 51, 75]。例如，无标记EIS适配体传感器在尿液样品中的超低LOD（10^3稀释）或非法拉第电容免疫传感器在包装/自来水样品中的LOD与DPV或ECL免疫测定在最小稀释的血清或牛奶样品中的LOD不可比较[38, 50, 60, 62]。此外，在竞争性免疫测定中，酶标记物的不同（例如AP和HRP）决定了信号化学的不同（例如，1-萘酚、氢醌/邻苯醌或ECL淬灭）。这些化学差异直接影响信噪比，从而影响LOD，无论基质效应和提取方法如何[49, 50, 54, 55]。比率技术的整合在评估跨研究的分析性能时引入了额外的复杂性层次。虽然将双信号标准化到[Fe(CN)6]3-/4-、金属离子参考或内部纳米材料峰可以有效减少信号方差，但所得指标即使在类似的校准条件下也无法映射到单信号LOD框架中[40, 57, 64]。一个很好的例子是使用Cd2+作为内部参考和Cu-MOF作为催化标记的比率DPV免疫传感器，它产生了不同的DPV和计时安培LOD和线性范围，这突显了信号标准化和读数方法对表观灵敏度的影响[57]。同样，双模PEC/EC适配体传感器在过滤后的湖水中产生了超低pg/ml的LOD，通过利用光电流和MB氧化还原信号的标准化来实现。然而，这一结果不能直接与复杂生物血清中的标准单模DPV测量进行基准比较[40]。

报告的分析性能还受到样品制备及其积累方法的影响。例如，使用吸附剥离伏安法的MIP平台通过表面积累电位引入了预浓缩步骤，而相反，非剥离的DPV/SWV协议仅依赖于简单的平衡结合[68, 69]。此外，预分析修改，如血清的乙醚提取、环境水的过滤和尿液的广泛稀释，导致LOD声明难以进行跨研究评估，因为人为地抑制了基质负荷和基线噪声[38, 54, 55]。除了样品处理外，电化学参数（如氧化还原介质的选择（例如MB、THI、铁氰化物）和施加的电位窗口）也会导致背景电流和动态范围的变化[39, 51, 62]。最后，基于Eu2O3@rGO/SPCE的无识别电催化SWV或比率MIP平台监测内在的E2氧化峰反映了与基于亲和力的测定根本不同的分析范式，使得跨这些类别的比较最有意义[56, 67]。

限制跨研究LOD和动态范围可比性的关键实验和报告因素在图3中进行了总结。

5.4 稳定性、可重复性和应用：什么支持转化
可重复性和操作稳定性已被多次证明，但根据机制和表面化学的不同而有很大差异，有几项报告详细说明了在适度冷藏条件下的多天存储和多循环使用[38, 57, 58, 65]。用EDTA再生的适配体EIS传感器至少可以重复使用10次，并具有可重复的Rct响应，而未标记的SWV免疫传感器在使用酸性甘氨酸解吸的情况下可以报告大约100次测定，并且在三周内保持稳定的电流响应[38, 58]。MIP薄膜和复合材料在多次提取-结合循环中表现出持续的性能，而经过抛光的碳浆/MagMIP界面可以在十次以上更新而不会失去性能，这表明在环境监测中有实际的可重复使用途径[65, 69]。在4–8°C下的存储稳定性在酶标记免疫传感器、比率免疫传感器和MIPs中约为1–4周，初始响应的80–90%，尽管一些平台在两周后显示出更快的下降，这强调了报告保质期对于最终应用的重要性[49, 57, 63, 65]。丝网印刷和基于纸张的设备以及基于SPCE的竞争性测定在可重复性和操作稳定性方面表现良好，包括一次性SPE免疫传感器、基于SPCE的竞争性测定和集成纸基微流控免疫传感器，这些都已经通过临床参考方法进行了验证[49, 54, 62]。SPCE/SPGE和芯片上设计的普遍性表明了一条通向按需测试的路径，具有适度的仪器和低每次测试成本，如基于纸张的DPV免疫测定与ECL医院测定相关联[62]。同时，一些最低的LOD来自台式ECL或双模PEC/EC设计，可能需要数小时的孵育和专门的发射器或光活性试剂，这可能在资源有限的设置中以灵敏度为代价[40, 50]。因此，临床转化的主要障碍不再是电极的制造，而是如何成功整合长期稳定性、强大的抗污染策略以及能够抵抗基质影响的信号转导机制，并采用快速、无需预处理的实验方案[49,54,58,62]。

5.5 当前对“选择性”和“基质验证”的理解
目前，“选择性”通常是通过在理想缓冲液中测试离散的干扰物（固定或增高的浓度）来定义的。而“基质验证”则是通过使用过滤或稀释的真实样本进行加标回收实验来评估的，而不是对未加标的原始样本进行盲测[38,51,57]。例如，用于分析牛奶和水样的DPV和EIS免疫测定法通常会筛查DES、E1、E3、BPA和NP，并在处理过的样本中进行加标回收测试。尽管一些研究通过酶联免疫吸附测定（ELISA）或LC-MS/MS来交叉验证结果，但在实际应用中其特异性尚未得到充分证明[50,51,56,57]。同样，用于检测尿液的适配体传感器会大幅稀释样本（10^2–10^3倍）以测量电流变化（Rct）或氧化还原电流。虽然稀释可以提高回收率，但在原始尿液中的性能仍无法得到验证[38,39]。采用剥离或比率双峰技术的MIP传感器表现出更强的抗干扰能力，并在加标的河流或废水样本中显示出良好的回收率，但这通常是在过滤或稀释的条件下[65,69,70]。最终，定义“选择性”的主流方法依赖于受控的干扰物测试，而“基质验证”通常仅限于在简化或预处理过的真实样本中的标准添加方法，直接比较临床或环境样本的验证方法仍然很少[55,56,62]。尽管如此，某些研究通过使用LC-MS/MS分析未提取的牛血清样本，或使用ELISA或HPLC-FLD（荧光检测）来基准测试未经处理的湖泊、血清和牛奶样本，从而提高了其实际应用的可信度[56,57,64]。

5.6 前景：基于证据的优先事项
1) 优先考虑未提取的生物流体测试，并明确披露有效的稀释因子。尽管现有文献证明了这些传感器在血清、尿液和唾液等基质中的可行性，但稀释和提取步骤的差异会导致报告的检测限（LOD）和回收率出现偏差[38,54,56,75]。为了建立基质的稳健性，未来的研究必须在多个稀释水平上进行平行测试，重点关注最小稀释情况[62]。
2) 使用真实的混合分析物面板来标准化干扰物测试。研究应从常见的单一干扰物测试（在简单缓冲液中）转向混合分析物的挑战，包括天然共存的类似物（如E1、E3、EE2、P4、睾酮、BPA和DES），从而获得更准确的交叉反应性[41,49,52,57]。此外，生物亲和测定法应借鉴电催化和MIP研究的做法，整合电活性物质和常见离子，以评估氧化还原干扰和基线漂移[65,75]。
3) 通过正交方法交叉验证原始样本的结果。由于单独的加标回收数据提供的准确性证据有限，研究必须将其传感器的性能与LC-MS/MS、HPLC-FLD、ELISA或临床ECL等成熟技术进行基准测试。因此，随着直接比较扩展到未加标的基质，该方法的可靠性将得到进一步验证[51,56,62,64]。
4) 优先考虑比率型和双模式传感策略，以最小化基质效应，确保与单信号基线的定量比较。整合内部参考信号（如铁氰化物、重金属参考物或内部纳米材料峰）可以一致地提高水、牛奶和血清基质中的重现性和检测限。为了全面了解实际应用中的权衡，未来的研究必须将这些双模式系统与其传统的单信号对应物进行基准测试[40,57,64]。
5) 标准化样本制备和积累报告，以实现透明的检测限比较。目前，分析灵敏度经常因使用吸附剥离预浓缩、血清提取和过度稀释等技术而被人为夸大。为了解决这个问题，应直接披露积累参数（时间和施加的电位）、提取方案和稀释因子，以及它们报告的分析范围和检测限[38,55,68,69]。
6) 使用真实世界的基质随时间评估抗污染技术。尽管标准做法是使用BSA、牛奶、MCH或乙醇胺进行表面阻断，但在复杂样本中对抗污染指标的定量报告仍然不足。在真实基质中对钝化和原始界面进行多日重复评估对于优化传感器设计至关重要[39,51,54,58]。
7) 在与现场相关的储存和操作条件下评估稳定性和可重复使用性。尽管目前有报告称传感器的储存能力为8-45天，操作周期为7-100次，且表面可再生，但由于缺乏在真实环境下的测试，这阻碍了比较分析。未来的工作应实施标准化的加速老化和表面再生方案，以准确评估不同平台上的保质期和操作寿命[38,58,65,69]。
8) 采用可大规模生产的电极，并简化适用于现场应用的测定方案。尽管这些传感器与现有方法具有高度相关性，但其实际应用受到操作复杂性的限制。为了使即时检测成为现实，可扩展的格式（如SPCE、SPGE和纸质传感器）必须结合低孵育时间和无需中介物的读出策略[49,54,62]。

总体而言，这些优先事项促进了基质的实际验证、可比性和设计上的稳健性。通过关注比率标准化等成熟方法，可以迅速利用多种E2传感器和转导方法所展示的成功。

6. 结论
电化学E2传感器的进展体现在识别化学和电极设计的多样化上。基本问题仍然是在复杂基质中敏感且选择性地测量这种小的疏水分子。文献综述表明，传感器的性能不是由任何单一组件主导的，而是通过识别化学、电极设计和测量格式的和谐组合实现的。具体来说，识别化学决定了选择性及结合特性，而电极及其纳米结构修饰则影响了信号转导过程的效率、容量和抗污染性能。同时，测量格式决定了分析信号的稳定性和性质。为了将这些技术从实验室推向实际应用，需要关注技术的实用性，特别是其在复杂基质中的表现、对天然激素和污染物基质的干扰测试，以及长期稳定性和适用性的评估。通过将这些传感器与微流控设备结合，可以解决处理真实世界样本的物理挑战。通过自动化流体处理并确保一致的体积输送，微流控技术消除了对高技术设备（如微量移液器）和高度训练人员的依赖，从而实现了即时检测。

总体而言，这一系列优先事项促进了基质的实际验证、可比性和设计上的稳健性。通过关注比率标准化等成熟方法，可以快速利用多种E2传感器和转导方法所取得的成功。

6. 结论
电化学E2传感器的进步在识别化学和电极设计方面表现出多样性。基本问题仍然是在复杂基质中敏感且选择性地测量这种小的疏水分子。文献回顾表明，传感器的性能不是由某个特定组件主导的，而是通过识别化学、电极设计和测量格式的协调组合实现的。具体来说，识别化学决定了选择性及结合特性，而电极及其纳米结构修饰则影响了信号转导过程的效率、容量和抗污染性能。为了将这些技术从实验室推向实际应用，需要关注技术的实用性，特别是其在复杂基质中的表现、对天然激素和污染物基质的干扰测试，以及长期稳定性和可重复性的评估。处理真实世界样本的物理挑战可以通过将这些传感器与微流控设备结合来解决。通过自动化流体处理并确保一致的体积输送，微流控技术消除了对高技术设备（如微量移液器）和高度训练人员的依赖，从而实现了即时检测。

此外，建立标准化的分析报告至关重要，因为不一致的报告会阻碍整个领域的进展。校准条件、基质处理和计算指标的差异限制了我们直接比较不同研究中的传感器性能的能力。为了进一步发展电化学E2生物传感技术，需要更紧密地整合合理的电极设计选择和稳健的验证方案。更一致地报告电极制造、表面化学、稳定性、选择性和真实样本回收情况将使该领域更容易理解，并加速开发出不仅敏感而且可重复且易于实际应用的传感器设计（图7）。

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图7. 限制电化学17β-雌二醇（E2）生物传感器跨研究比较检测限（LOD）和动态范围的关键因素。该图概述了实验变异性的常见来源，包括：(i) 在缓冲液中进行的评估与在复杂生物样本中的评估；(ii) 样本制备方案的不同；(iii) 氧化还原探针部署和电化学参数的差异；(iv) 电极面积和制造方式的差异（特别是对于印刷和纳米结构电极）；(v) 孵育方案的差异以及测定架构（如竞争性结合与直接结合格式）；(vi) 选择性评估的严格性。这些因素即使在结构相似的传感器设计中也会显著影响分析性能，强调了在特定应用环境中进行透明报告和验证的必要性。

**资金**
本研究由欧盟资助，项目编号为：101,135,402—Mobiles—HORIZONCL6–2023-ZEROPOLLUTION-01。然而，所表达的观点仅代表作者本人，并不一定反映欧盟或欧洲研究执行机构的立场。欧盟和欧洲研究执行机构对此不承担责任。

**机构审查委员会声明**
不适用。

**知情同意声明**
不适用。

**CRediT作者贡献声明**
Antonios Georgas：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，验证，方法学，调查，概念化。
Theodoros Pouris：撰写 – 原始草稿，验证，调查。
Melina Giannaki：撰写 – 原始草稿，验证，调查。
Angelo Ferraro：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，正式分析。
Evangelos Hristoforou：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。