关于氧化锌纳米颗粒在医疗保健和卫生产品中的存在及其生物毒性影响的见解

《Talanta》：Insights into the occurrence and biotoxicity impact of zinc oxide nanoparticles within healthcare and sanitary products

　　阿曼多·桑切斯-卡切罗 | 曼努埃尔·巴托洛梅 | 皮拉尔·费尔南德斯-帕切科 | 玛丽亚·阿雷瓦洛-维莱纳 | 罗莎·德尔卡门·罗德里格斯·马丁-多伊梅阿迪奥斯 | 玛丽亚·赫苏斯·维拉塞尼奥尔 | 安赫尔·里奥斯
卡斯蒂利亚-拉曼查大学环境科学研究所（ICAM）分析化学与食品技术系，卡洛斯三世大道无号，45071托莱多，西班牙

**摘要**
氧化锌纳米颗粒（ZnONPs）在标有“含氧化锌”的医疗和卫生产品中的潜在存在已成为一个新兴问题，这主要是由于它们最近被报道的类似酶的行为所导致的争议性生物毒性。为了监测和阐明这一问题，本研究采用了一种多学科方法。首先，对九种不同的微生物菌株（酵母和细菌）进行了氧化锌和ZnONPs的生物毒性测试，这些微生物是存在于受影响人体组织中的特征性病原体和共生微生物。其次，使用单颗粒电感耦合等离子体质谱法（spICP-MS）分析了多种含有氧化锌（但未声明含有ZnONPs）的商用医疗和卫生产品。为此，采用了含有1% Triton X-100的超声辅助提取方法，并使用商用ZnONP粉末作为内部质量控制材料。从真度（颗粒数浓度和等效尺寸）、精度以及尺寸和浓度的检测限等方面评估了该分析方法的适用性，证明了其在保持纳米颗粒原始尺寸、尺寸分布和数量方面的有效性。生物毒性测试表明，ZnONPs的抑制作用比氧化锌更强，且表现出明显的尺寸依赖性，同时细菌对ZnONPs的敏感性也存在显著差异。最低抑制浓度（MIC）足以对共生微生物造成影响。因此，研究结果揭示了潜在的毒性风险，并强调了使用适当工具进行控制的必要性，因为一些商业样品中的ZnONP百分比超出了安全范围，同时也建议重新评估相关法规框架。

**1. 引言**
氧化锌传统的抗炎和抗菌特性，加上其已被证实的有效阻挡紫外线的能力，使其成为许多日用医疗和卫生产品中的重要且被认为安全的成分，如牙膏、尿布膏、愈合膏、抗真菌粉和防晒霜等[1][2][3][4][5][6]。然而，由于多种降解过程，部分氧化锌可能会意外或有意地转化为纳米颗粒形式（ZnONPs）[4][7]，其生物毒性至今仍存在争议。文献中报道ZnONPs的毒性低于Zn2+或氧化锌块状颗粒[7][8][9]。尽管如此，最近的研究指出，ZnONPs具有新的增强催化活性，如类似酶的功能（氧化酶、过氧化物歧化酶和过氧化氢酶）[10][11][12]，这些功能在癌症治疗、抗氧化、抗菌和靶向激活等方面具有潜在的应用价值[11][12][13]。然而，也必须仔细评估其潜在风险，例如对人类身体和环境的毒性、在生物体内的生物累积，以及控制其暴露量以确保任何治疗应用的安全性[14][15][16]。特别是需要评估它们对医疗和卫生产品应用区域（如皮肤、黏膜和伤口）中人体微生物群的影响，尤其是对维持病原体抑制作用的重要性[17]。因此，需要多学科研究来评估这些风险。

鉴于上述情况，目前许多医疗和卫生产品中都含有ZnONPs，但其安全使用尚未得到完全定义和立法规定。根据欧盟委员会（EC）的规定[18][19][20][21]，制造商必须明确标注材料是否以纳米形式存在（当其中超过50%为纳米形式时）。此外，欧盟消费者安全科学委员会（SCCS）允许在即用产品（尤其是防晒霜）中使用的ZnONPs的最大法定浓度为25%（重量百分比），而在可能通过吸入进入肺部的气溶胶或喷雾产品中则禁止使用[22][23]。因此，开发能够技术上协助立法机构评估ZnONPs潜在风险的分析工具至关重要。然而，目前大多数可用方法仍在开发中，因为既没有标准化方法也没有相应的协议来进行此类检测。特别是，表征颗粒数浓度存在固有难度[21]，这是判断材料是否符合欧盟法律标准的关键参数（基于颗粒数[18]）。因此，这些分析方法必须能够提供关于中位数和平均尺寸以及基于质量和颗粒数的浓度信息，同时避免在样品制备过程中引起物理化学变化，从而避免产生误导性结果。

传统上，显微镜技术（主要是扫描电子显微镜和透射电子显微镜）或动态光散射（DLS）被用于研究化妆品中的ZnONPs[24][25][26]，这些方法在确定尺寸参数方面具有显著价值，但在基于颗粒数的浓度测量方面效果不佳。此外，在某些情况下，样品制备过程复杂且存在较高的物理变化风险[27]。在这种情况下，单颗粒电感耦合等离子体质谱法（spICP-MS）作为一种有前景的方法出现，可以提供关于质量和颗粒数浓度（在所需低水平下）以及等效尺寸分布的信息[28][29]。关于样品处理，通常通过悬浮液、分散液、乳液或提取等方式分离半固体样品中的金属和金属氧化物纳米颗粒[27][30][31][32][33][34][35]。由于现有医疗和卫生产品的多样性及其基质复杂性，以及缺乏适当的（经过认证的）参考或对照材料，目前尚无适当的方法来通过spICP-MS对这些产品中的ZnONPs进行样品制备和后续分析。

本研究旨在阐明ZnONPs的争议性生物毒性，以及监测其在日常使用的卫生产品中的存在和进行分析表征的重要性。为此，采取了两种方法：首先，对九种不同的微生物菌株（酵母和细菌）进行生物毒性测试，这些菌株被认为是这些区域中的特征性病原体和共生微生物；其次，分析这些商用医疗和卫生产品中的ZnONPs。研究结果将有助于揭示潜在风险，以及使用适当工具进行综合控制的必要性，并重新评估现有的监管和法律框架的适当性。

**2. 材料与方法**
2.1. 化学品、试剂和样品
所有使用的化学品和试剂均为分析级。溶液使用Elga PURELAB? Chorus 1（Elga，英国）和Milli-Q（Millipore，美国）水纯化装置制备的超纯水（18.2 MΩ·cm）配制而成。HNO3（69%）和H2O2（30%）分别从Scharlab（西班牙）和Merck（德国）购买。Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和Tween 80也来自Merck（德国）。标准锌离子溶液（10,020 ± 40 μg/mL）从SCP Science（加拿大）购买。铑（995 ± 2 μg/mL）和标准铂（1,000 ± 3 μg/mL）离子溶液从Inorganic Ventures（美国）购买。用于生物毒性测试的块状氧化锌（纯度>99.0%）试剂来自Merck（德国）。商用ZnONP粉末和分散液从Merck（德国）购买。这些材料在我们的实验室中进行了浓度测定，采用ICP-MS方法（按照第2.3节描述的程序），结果分别为总Zn浓度885 ± 125 μg/mL和381 ± 42 μg/mL（n = 3）。同时，使用JEM 2100电子显微镜（JEOL，日本）在200 kV下结合能量色散X射线（EDX，INCA，Oxford Instruments，英国）测量了平均直径，分别为115 ± 39 nm（n = 80）和22.9 ± 4.9 nm（n = 106）。ZnONP粉末溶液的颗粒数浓度通过动态质量流量法（DMF）[36]实验测定。简而言之，将这种材料分散在1% Triton X-100中，使用DMF方法测得ZnONPs浓度为（6.06 ± 0.78）·10^10个/g（n = 6）。此外，使用Malvern Panalytical的Zetasizer Nano ZS测量了这种材料在水中的Zeta电位（-27.3 ± 3.5 mV）。用于测定传输效率的商用30 nm PtNPs溶液稳定在2 mM柠檬酸中（Nanocomposix，美国），制造商提供的标称质量浓度和直径分别为54 μg/mL和32 ± 3 nm。总Pt浓度通过微波酸消化后在我们的实验室中使用ICP-MS测定，结果为45.6 ± 3.4 μg/mL。同样，这些NPs在TEM下分析，得到平均直径为33 ± 2 nm。在分析前，所有含纳米颗粒的溶液均使用Velp Scientifica的ZX3 Vortex以1200 rpm的速度涡旋搅拌30秒以防止聚集。

选择了八种商用医疗和卫生产品样品（编号为S#1-8），这些样品代表了广泛的个人护理和卫生健康产品（如保湿修复霜、防晒霜、牙膏、尿布膏和抗真菌粉）。这些样品从西班牙Ciudad Real的当地药店购买。这些样品的详细成分在补充材料（文本S1）中描述。根据制造商信息，除S#7和S#8（用于对照）外，所有配方中都含有ZnO，其ZnO的重量百分比通过ICP-MS测定（按照第2.3节描述的程序），汇总在表S1–o中。值得注意的是，只有S#1样品声明含有纳米形式的ZO。为保持其原始性质并防止不必要的变化，从原始容器中取出样品，密封在聚丙烯管中，并储存在4°C下。在后续分析前，手动均质化样品以避免重复性问题。

2.2. ICP-MS和spICP-MS分析：仪器条件和数据处理
使用配备Micromist雾化器和旋风喷雾室的三重四极杆ICP-MS iCap? TQ（Thermo Fisher Scientific，德国）进行总浓度定量和spICP-MS分析。两种分析模式的操作条件总结在表1中。设备每天都会调整至最高灵敏度。Zn和Rh的原始信号（15 μg/L，选为校正仪器漂移的内部标准）进一步使用Qtegra? Intelligent Scientific Data Solution?（ISDS）软件和Excel电子表格进行处理。总Zn量的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别使用3 s/m和10 s/m的标准确定（其中s为空白的标准偏差，m为校准曲线的斜率）。

**表1. ICP-MS和spICP-MS的操作条件**
| RF功率（KW） | 1.5 |
| 等离子体气体流量（L/min） | 14 |
| 载气流量（L/min） | 1.0 |
| 雾化器气体流量（L/min） | 1.05 |
| 辅助气体流量（L/min） | 0.8 |
| 雾化器类型 | Meinhard |
| 喷雾室类型 | 旋风 |
| Q1偏压（V） | -2.5 |
| Q3偏压（V） | -2.0 |
| 获取时间（s） | 60 |
| 喷雾室温度（°C） | 2.7 |

**spICP-MS**
| 监测同位素 | Zn, 103 | Rh, 195 |
| 分析物质量（u.m.a） | 65.38, 102.9 | 65.38, 195.0 |
| 停留时间（ms） | 50.5 |
| 密度（g/cm3） | 5.61 |
| 传输效率（%，n = 8） | 7.49 ± 0.58 |
| 样品流量（mL/min） | 0.32 – 0.38 |

spICP-MS的工作条件（表1）改编自之前关于金属纳米颗粒的研究[38]。样品测量时间为60秒，停留时间为500 μs，共获得120,000个数据点。原始数据使用SPCal v.1.4.1 [39]处理，应用高斯拟合（因为所有样品的背景信号均>10计数），并设定5-σ阈值（α为2.867·10^-7）。计算等效颗粒尺寸分布、基于颗粒数和质量的浓度时，使用了ZnO的密度、摩尔质量和质量分数，并假设纳米颗粒为球形和固体。为了估算传输效率，采用了基于内部表征的30 nm PtNP溶液（分散在1% Triton X-100中）的数据[2.1]。离子响应因子每天使用不同浓度的离子Zn（100 – 10,000 ng/L）进行计算。样品流速也是通过每天测量仪器在3分钟内吸收的水的质量来估算的，重复三次实验。spICP-MS的检测限（LOD）等效大小和浓度术语（分别为LODs和LODc）是根据Laborda等人（2020年）[40]中描述的规格计算得出的。2.3. 总锌含量测定的样品处理方法商业ZnONP粉末和分散体中的总锌含量，以及选定的样品（S #1-8），是通过使用Milestone EthosPlus微波炉（Milestone，美国）在封闭容器中进行酸微波辅助消化后，通过ICP-MS测定的，该方法是对Rujido-Santos等人（2022年）[31]中描述的程序进行了修改。简要来说，每个样品0.1克与3.125毫升HNO3（69%）、3.125毫升H2O2（30%）和3.75毫升超纯水混合在PTFE容器中。需要强调的是，由于安全考虑，原始方案中使用的氢氟酸被移除了，同时也考虑到钛和硅的消化超出了本研究的范围[31]。然后，加热程序如下：步骤1）从室温线性升温至90°C，持续5分钟；步骤2）从90°C线性升温至140°C，持续5分钟；步骤3）从140°C线性升温至180°C，持续5分钟；步骤4）在180°C下保持恒定温度30分钟；步骤5）冷却至室温。接下来，将样品稀释至最终体积25毫升，并通过ICP-MS进行分析。每批提取过程中也处理了程序空白样品。原始锌信号用内标（Rh）进行了校正，然后使用外部校准曲线（2 – 100 μg L-1 Zn）转换为浓度，随后转换为ZnO含量，其浓度显示在表S1中，单位为mg ZnO/g样品及其相应的百分比w/w。2.4. 用于ZnONP测定的超声辅助提取预处理使用Sonoplus 7 HD 2070（Bandelin Electronics，德国）超声探头，根据Rujido-Santos等人（2022年）[31]中描述的略微修改的程序进行样品中ZnONPs的提取和分离。在手动均质化每个样品后，将0.04克的样品与10毫升Triton X-100 1%混合在聚乙烯管中，并以1,200转/分钟的速度涡旋1分钟。然后，在56瓦特和40%的振幅下超声处理5分钟。样品重复三次（n = 3），并在每批实验中测量一个程序空白样品以排除污染或ZnONPs的形成。尽管如此，在计算时减去了检测到的事件的平均值（< 2）。在通过spICP-MS分析之前，样品被稀释（1:10,000 – 1:100,000）以满足技术要求并避免双重事件。最后，ZnONP的比例（%）是通过spICP-MS在样品中发现的ZnONP质量相对于估计的总ZnO浓度计算得出的。2.5. 大块ZnO和ZnONPs的生物毒性测试测试的微生物包括7种细菌和2种酵母菌株，这些微生物被认为是典型的病原体和寄居在皮肤、黏膜和伤口中的共生人体微生物群（表S2）。所有这些微生物都保存在卡斯蒂利亚-拉曼查大学（UCLM）的酵母生物技术实验室或西班牙类型培养物收藏中心（CECT）的甘油库存中，温度为-80°C。使用前，在理想的条件下培养24/48小时后获得新鲜培养物。所有培养基均从Condalab（西班牙）购买。应用琼脂扩散法进行初步测试，以评估和比较大块ZnO和ZnONPs的抗菌能力。当观察到阳性结果时，计算最小抑制浓度（MIC）[41]。在含有适当培养基的琼脂平板（表S2）上接种每种微生物的标准化接种物（5·10^6 cfu mL-1），以获得均匀的菌层。然后，用无菌尖端无菌打一个直径为6毫米的孔，并将200微升的测试剂（含有大块ZnO或ZnONPs的悬浮液）引入孔中。为了建立可靠的生物毒性评估浓度水平，并基于样品中ZnO含量的结果（表S1），选择了7%和20%（w/w）两个工作浓度水平，作为本研究中研究的大量样品中ZnO浓度的代表。ZnONP悬浮液（来自粉末和分散体的储备溶液）在1% Tween 80中制备（也用作对照），并在360瓦特的超声浴中处理5分钟。平板在30°C或37°C下培养48小时，通过观察孔周围的抑制圈来评估抑制效果，其直径使用游标卡尺测量。完全没有生长的区域记录为完全抑制，使用这个术语来确定MIC。所有测试都重复三次，并进行后续的统计分析。对不同浓度的ZnONPs得到的抑制圈直径数据应用单因素方差分析（ANOVA）来确定处理之间的显著差异并估计MIC。使用Duncan的多范围测试（p < 0.05）进行均值比较。所有统计分析均使用IBM SPSS Statistics软件24.0版（SPSS Inc., 芝加哥, IL, 美国）进行。3. 结果与讨论3.1. 大块ZnO和ZnONPs的生物毒性测试为了评估关于ZnONP生物毒性的争议与大块ZnO的生物毒性相比，使用微生物进行了初步的生物毒性测试（表S2）。结果（表2）显示ZnONPs具有明显的抗菌能力，而大块ZnO则没有这种能力。这种行为在其他研究中也有观察到，例如Salami等人（2022年）[42]的研究，再次表明纳米颗粒（NPs）比大块材料更具危险性。表2. 大块ZnO和ZnONPs对病原体和共生人体微生物群的抗菌活性的定性分析。抑制圈的大小分别用-（无抑制圈）和+、++、+++或+++++（抑制圈大小增加）表示。空白细胞对照7%20%大块ZnO大块ZnONPs（粉末）ZnONPs（分散体）大块ZnONPs（粉末）ZnONPs（分散体）L. brevis 4669--++++++++S. aureus UCLM-B7---+--+S. epidermidis CECT 232---+--+K. pneumoniae UCLM-B1-------M. luteus CECT 245-+++++++++++++++++++S. mutans CECT 479 T---+++++++E. coli UCLM-BB1----+++++C. albicans UCLM-1645-------R. mucilaginosa UCLM-1047-50%根据初步抑制测试的结果（表S2），仅对ZnONP粉末和分散体计算了最小抑制浓度（MIC，表S3和S4），使用的悬浮液浓度范围为0.07%至20%（w/w）用于细菌。对于酵母的测试，需要更高的浓度，分散体达到50%（w/w），粉末ZnONPs达到20%（w/w）。表3显示了每种研究菌株的MIC值。测试显示细菌的敏感性因菌株和纳米颗粒大小而异。总体而言，分散体ZnONPs（23纳米）表现出更强的抗菌效果，产生了更大的抑制圈，并且MIC值更低（115纳米）。表3. 根据ZnONP大小的不同菌株的最小抑制浓度（MIC）（未检测到：-）菌株ZnONP粉末ZnONP分散体L. brevis CECT-46695%1%S. aureus UCLM-B70.5%5%S. epidermidis CECT-23220%3.5%K. pneumoniae UCLM-B120%3.5%M. luteus CECT-2453%0.1%S. mutans CECT-47920%7%E. coli UCLM-BB18%3.5%C. albicans UCLM-1645--R. mucilaginosa UCLM-1047-50%这一总体趋势与文献中记录的ZnONPs的尺寸依赖性生物毒性效应一致[43],[44]。较小的颗粒通常表现出更强的抗菌效果，因为它们具有更高的表面反应性、增强的ROS生成和更多的Zn2+离子释放。重要的是，基于ZnO材料的抗菌活性通常是由纳米颗粒驱动和离子介导的机制共同控制的，因为ZnO可以在水性和微酸性条件下部分溶解，释放出生物活性的Zn2+离子。实验研究表明，将ZnO悬浮液分离成无颗粒的上清液可以证明溶解的Zn2+可能占据了抗菌效果的很大一部分，且这种效应因菌株而异[45]。因此，本研究中观察到的较小ZnONPs的增强性能可能不仅反映了它们改善的纳米-生物界面相互作用，还与其较高的表面积与体积比有关[46],[47]。因此，本研究中获得的MIC值可能是纳米颗粒-细胞直接接触、ROS介导的氧化应激和Zn2+诱导的毒性之间相互作用的结果，其相对贡献可能因微生物种类和物理化学微环境而异。M. luteus CECT-245是对较小纳米颗粒最敏感的菌株，在低至0.07%的ZnONP分散体浓度下就表现出抑制作用，产生了3.1 ± 0.1厘米的较大抑制圈。图1A显示了用这种菌株在四种不同浓度（0.007–7%）的ZnONP分散体进行的琼脂扩散测试，其中在0.07%（w/w）浓度下可以清晰地观察到抑制圈。相反，S. aureus UCLM-B7对较大颗粒最敏感，对粉末ZnONPs的MIC最高（0.5%），抑制圈为1.1 ± 0.1厘米。相比之下，S. mutans CECT-479表现出最耐受的表型，需要7%的较小ZnONPs才能显示抑制作用（抑制圈1.1 ± 0.1厘米），并且使用粉末ZnONPs的MIC为20%，对应的抑制圈为1.5 ± 0.1厘米。下载：下载高分辨率图像（406KB）下载：下载全尺寸图像图1. A）不同浓度（a）7%，b）0.7%，c）0.07%，d）0.007%（w/w）的ZnONP分散体处理的M. luteus CECT-245的琼脂扩散测试。B）在20%（w/w）浓度下暴露于ZnONP粉末的R. mucilaginosa UCLM-1047的琼脂扩散测试，未观察到明显的抑制圈。Lb. brevis CECT-4669和E. coli UCLM-BB1在≥1%（直径0.5 ± 0.0厘米）和≥3.5%（直径0.8 ± 0.3厘米）的ZnONP分散体浓度下被抑制，而使用粉末ZnONP则需要更高的浓度，分别为5%（直径0.9 ± 0.2毫米）和8%（直径1.5 ± 0.0厘米）。St. epidermidis CECT-232和Kl. pneumoniae UCLM-B1对较大纳米颗粒表现出高抗性，仅在20%（直径1.4 ± 0.2厘米和1.3 ± 0.2厘米）的浓度下发生抑制，而对较小ZnONP的阈值明显较低。这些结果支持了比较研究，表明革兰氏阳性细菌比革兰氏阴性细菌对ZnONPs的效果更敏感[48],[49]。St. aureus UCLM-B7是一个例外，因为需要较高浓度的ZnONP分散体才能抑制其生长，这可能是由于生物膜的形成，因为它可以调节对ZnONPs的反应并改变尺寸依赖性行为[50]。总体而言，几种菌株（L. brevis CECT-4669、M. luteus CECT-245、St. epidermidis CECT-232和E. coli UCLM-BB1）在中间和高浓度之间的抑制圈大小没有显著差异（p < 0.05），表明较低的剂量可能足以实现类似的抗菌/生物毒性效果。另一方面，酵母测试显示对ZnONPs的抵抗力更强。C. albicans UCLM-1645在任何测试浓度下均未表现出抑制作用，而Rh. mucilaginosa UCLM-1047仅在最高浓度（50%）的较小ZnONP下表现出敏感性（直径0.8厘米的抑制圈）。图1B显示了在20%（w/w）浓度下暴露于ZnONP粉末的R. mucilaginosa的琼脂扩散测试，未观察到抑制作用。类似的结果也由其他作者[51],[52]报告，他们指出ZnONP的抑菌或杀菌效果与膜损伤和ROS生成相关，但低于细菌的效果。这些生物毒性发现强调了在评估ZnONPs的效果时考虑其对共生微生物群的影响的重要性。在本研究中，我们包括了通常有益的微生物（乳酸菌、微球菌）和其他可能作为共生菌或机会性病原体（链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌、克雷伯菌）的物种。数据显示，无论后者被视为目标病原体，抑制它们所需的ZnONP浓度——特别是对于较小的纳米颗粒——都足够高，也会影响有益菌株，从而构成破坏保护性微生物群的明显风险。同样，ZnONP粉末也需要足够的浓度来抑制它们，除了St. aureus，其在非常低的浓度下就能被抑制，这不会影响其他检查的共生菌株。这一担忧得到了最新研究的进一步支持，这些研究表明金属纳米颗粒（NPs）可以通过减少乳酸菌的数量和破坏整体微生物群落结构来改变肠道微生物生态[53]，[54]，这表明未来ZnONPs的应用应该结合选择性靶向策略或剂量优化方法，在有效控制病原菌的同时保护共生菌群。由于不同形式的ZnO表现出不同的行为，因此强烈建议仔细评估提供纳米颗粒浓度和大小信息的商业产品。

3.2. 选择ICP-MS条件进行Zn测量
为了正确估计ZnONPs的含量，在spICP-MS模式下设置最佳测量条件至关重要。该技术中的干扰（无论是光谱干扰还是同位素干扰）都可能导致误导性的结果，如果可能的话必须将其最小化或避免。如今，得益于这项技术的飞速发展，可以通过选择较少问题的同位素作为分析信号，或在分析中加入碰撞/反应池（CRC）来克服这些问题[28]，[55]。尽管有一些已发表的研究选择了不同的同位素（64Zn或66Zn），或者在CRC中使用了多种气体（He或NH3），但仪器的多样性和CRC的功能性导致了多种有效的选择[31]，[32]，[33]，[35]，[56]。因此，必须探索本研究中使用的仪器在这种情况下的行为。首先，对不同的分析测量条件进行了研究。为此，分析了在2% HNO3中制备的离子Zn的校准曲线（0 – 50 μg L-1）。每种情况下都计算了仪器灵敏度（使用内标校正）、信噪比、LOD和LOQ值，并显示在表S5中。关于Zn同位素，只考虑了66Zn，因为64Zn由于以下仪器原因被排除：作为对同位素干扰（64Ni）的校正，仪器软件（Qtegra?）使用了一个需要60Ni来修正64Zn原始信号的数学方程。这意味着必须在与目标分析物相同的运行中测量该同位素，这对于ICP-MS分析是可行的。不幸的是，spICP-MS模式在四极杆系统中一次只能测量一种同位素，这使得该选项无法用于本研究的主要目的。

3.3. 选择超声辅助提取条件并验证方法论
样品制备，特别是从复杂基质（如日常护理和卫生产品）中分离纳米颗粒，是任何分析程序中的关键步骤，但对于spICP-MS来说尤其关键。必须正确执行，以避免对目标纳米颗粒进行任何形式的转化（保持其原始的物理化学性质），特别是当需要定量结果时。此外，必须尽量减少聚集现象，因为本研究的主要目标之一是准确确定颗粒数浓度，以评估所处理样品的标签是否符合法规要求。在评估了关于从不同样品中提取ZnONPs的潜在试剂和能源的现有文献[30]，[31]，[32]，[33]，[34]，[35]之后，选择了超声探头作为最合适的能源，因为它效率高且速度快，工作条件略微修改了Rujido-Santos等人（2022）[31]开发的程序。在该方法中，探头以40%的振幅在脉冲模式下运行5分钟（59秒放松，59秒尖端超声处理）。在本研究中，脉冲模式被连续模式取代（40%振幅运行5分钟），因为在初步研究中获得了相似的温度（任何情况下都不超过35°C）和效率（数据未显示）。关于提取剂，通常会考虑水、丙酮、SDS或Triton X-100的不同浓度。在这方面，由于其中一个主要目标是获得稳定的分散液，因此测量了商业ZnONP分散液的Z-Potential，并显示在表S6中。选择了Triton X-100 1%作为提取剂，因为其稳定性优于其他介质。此外，Triton X-100在文献中通常被认为是从类似基质中成功提取ZnONPs的试剂，并且也能提高样品的稳定性[30]，[32]，[33]，[35]。为了检查整个提出的超声辅助spICP-MS策略的分析性能，并确保ZnONPs的完整性（就颗粒数浓度和等效尺寸而言），进行了彻底的分析性能特征评估。由于缺乏含有认证ZnONPs含量的个人护理/卫生健康产品参考材料，因此使用了一种商业保湿霜和牙膏（成分声明中不含ZnO，这也通过ICP-MS得到了确认，见表S1中的S#7和S#8）作为质量控制材料。简而言之，将0.04克保湿霜/牙膏和0.04克ZnONP粉末用玻璃搅拌器混合30秒，然后按照第2.4节中描述的提取程序进行处理，之后稀释（1:10,000）并通过spICP-MS进行分析。

主要分析指标，如真实性或准确性（表示为超声辅助提取和spICP-MS程序得到的计算浓度与DMF确定的值之间的回收率），以及等效尺寸，n = 6；同一天内和不同天内的精度（RSDintra和RSDinter，分别为同一天分析的样品之间的相对标准偏差，以及连续几天分析的样品之间的相对标准偏差，n = 6）；以及两种基质的LOD和LODc都在表4中进行了计算和总结。表4显示了使用添加了0.04克商业ZnONP粉末的S#7和S#8样品进行真度（颗粒数浓度和等效尺寸）、日内精度（RSDintra）、日间精度（RSDinter）、LOD和LODc的分析表征。

表4. 使用添加了0.04克商业ZnONP粉末的S#7和S#8样品作为质量控制材料的分析表征：真度（颗粒数浓度和等效尺寸）、日内精度（RSDintra）、日间精度（RSDinter）、LOD和LODc。
- 粒子数浓度真度（%，n = 6）：99 ± 13% vs 92 ± 10%
- 等效颗粒直径真度（%，n = 6）：113 ± 25% vs 94 ± 18%
- RSDintra（%，n = 6）：159% vs 159%
- RSDinter（%，n = 6）：161% vs 161%
- LOD（nm）：41 vs 40
- LODc（ng L-1）：1.4 vs 1.2

在颗粒数浓度方面，这里获得的真度与根据DMF程序确定的相应值非常吻合。此外，等效颗粒直径的准确性值（198 ± 44 nm vs 175 ± 31 nm）和牙膏（148 ± 38 nm）也与预期尺寸相符，从而证明该方法没有对ZnONPs造成重大变化（图2）。尽管尺寸准确性良好，但使用该技术时必须谨慎处理其局限性。由于在计算过程中假设了ZnONPs与块状ZnO具有相同的密度，并忽略了孔隙率、形态或纳米颗粒涂层等关键参数，因此获得的等效直径可能存在偏差。因此，这些等效直径对应于具有相同质量的球体。

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图2. 在UPW中获得的ZnONP粉末（A）以及添加了0.04克ZnONP粉末后经过提取程序（1% Triton X-100和超声探头处理）的样品S#7（B）和S#8（C）的等效颗粒尺寸分布（nm）。

RSDinter和RSDintra都显示出一些变异性（< 20%），这可能与参考材料的复杂性有关，正如之前研究中所报告的，在这些研究中分析了金属和金属氧化物纳米颗粒，这些基质确实相当复杂[30]。LOD和LODc（分别为41 nm和1.4 ng L-1以及40 nm和1.2 ng L-1）与特定文献中的结果一致[31]，[32]，[33]。还比较了添加了ZnONP的S#7样品和未添加ZnONP的S#7样品的背景水平（以计数表示）。这是为了检查提取程序对结果质量的影响，因为ZnONPs的溶解可能会促进其转化为Zn2+。在这两种情况下，背景水平相似（分别为71和87计数），表明提取程序不会促进ZnONPs的溶解。因此，根据上述分析性能参数的满意评估，可以证明调整后的超声辅助spICP-MS方法适用于商业个人护理和卫生健康产品中ZnONPs的分析表征。

3.4. 商业化妆品和自我护理产品中ZnONPs的存在
迄今为止，ZnONPs的生物毒性仍存在争议[4]，[7]，它们在日常使用的商业个人护理和卫生健康产品中的存在也得到了研究。提供了基于颗粒数和质量的浓度（NPs g-1和mg g-1）、ZnONPs含量（% w/w，相对于整个ZnO质量或整个样品质量）以及平均等效直径（nm），以阐明上述技术和法规方面的问题。每批样品都准备了程序空白样品并通过spICP-MS进行了测量，并在计算中考虑并减去了检测到的事件的平均值（< 2）。每个样品制备了三份并测量了三次，结果总结在表5中。

表5. 通过超声辅助提取和spICP-MS检测的商业护理和卫生产品中的ZnONP颗粒质量（mg g-1）和基于数量的浓度（NPs g-1）（% w/w）以及平均等效直径（nm）（n = 3）：
| 样品 | 颗粒质量浓度（mg g-1） | 颗粒数浓度（NPs g-1） | ZnONPs（w/w ZnO %） | ZnONPs（w/w 样品 %） | 平均等效直径（nm） |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| S#1 | 5.5 ± 1.6 | (1.32 ± 0.48)·10^11 | 7.6 ± 2.6 | 0.61 ± 0.17 | 193 ± 15 |
| S#2 | 6.4 ± 2.2 | (1.09 ± 0.31)·10^11 | 14.15 ± 0.9 | 10.75 ± 0.13 | 240 ± 30 |
| S#3 | 0.33 ± 0.11 | (4.19 ± 0.48)·10^10 | 2.24 ± 0.58 | 0.035 | 4 ± 0.00 |
| S#4 | 0.44 ± 0.13 | (1.00 ± 0.12)·10^10 | 0.45 ± 0.13 | 0.046 | 3 ± 0.00 |
| S#5 | 0.331 ± 0.053 | (3.51 ± 0.23)·10^10 | 0.249 ± 0.04 | 0.033 | 5 ± 11 |
| S#6 | 17.7 ± 2.2 | (2.63 ± 0.50)·10^11 | 134.0 ± 6.5 | 2.00 ± 0.43 | 235 ± 11 |
* | |

声明的ZnONPs含量
等效直径范围为50 – 400 nm，平均尺寸为200 nm（图S1）。在研究的样品中观察到ZnONP颗粒数浓度（从1.0·10^10到2.63·10^11, NPs g-1）和基于质量的ZnONP含量值（0.249 – 34.0 %, w/w）存在很大变异性。这种变异性可以解释为测试的产品和基质的多样性，这些产品和基质用于多种不同的应用（表S1）。根据SCCS提出的安全使用场景，只有两种产品（S#4和S#6）超过了ZnONPs的法定最大浓度。因此，S#6报告的浓度为34.0 ± 6.5%，超过了安全使用阈值（25 % w/w），可能对人类健康和环境有害。S#6样品被标记为抗菌、愈合和修复霜，而S#4（尽管含量较低）是一种基于粉末的产品，其中严格禁止存在ZnONPs，因为存在吸入风险。然而，正如新兴和新识别健康风险科学委员会（SCENIHR）所建议的，日常个人护理和卫生健康产品中较低的纳米颗粒浓度也可能导致生态毒性风险，因为它们的影响与频繁接触开放性伤口和黏膜有关，正如本研究中的一些产品所示[57]。此外，正如欧盟委员会所建议的，如果观察到对人类健康的潜在风险，可以实施更严格的浓度限制，例如如果产品将应用于（或与）呼吸道（特别是呼吸系统）接触，则禁止使用这些产品[23]。关于标签要求，必须计算这些样品中纳米级成分（NPs < 100 nm，基于颗粒数量）的比例，以协助相关法规的执行[19]，[23]。然而，spICP-MS方法在这种情况下的检测限（LOD）相对较高（高达40 nm），这给确定这一参数带来了困难。因此，较小的纳米颗粒成分可能被忽略（尽管它们对总体比例有重要影响）。因此，相关数据并未提供，需要使用其他互补技术（如非对称流场流动分级法）对这些成分进行彻底表征，以全面研究其贡献。不过，只有样品S#1被声明含有ZnO纳米颗粒。

在类似的研究中[30]、[31]、[32]、[33]中也观察到了样品之间的异质性，这些研究中各种化妆品在spICP-MS分析前都经过了相似且可比较的提取处理。总体而言，参考文献中报告的纳米颗粒浓度（含/不含ZnONP）和等效直径相似（表6），而发现的差异可能归因于这些产品的不同用途。

表6. 类似研究中获得的颗粒数量浓度（NPs g-1）、ZnONPs（% w/w）和平均等效直径

| 产品类型 | 颗粒数量浓度（NPs g-1） | ZnONPs（% w/w） | 平均等效直径（nm） |
| --- | --- | --- | --- |
| 眼影、面霜和乳液 | 0.28–31.57 | 3–157 | - |
| 防晒霜 | 2.37·10^11–5.34·10^12 | 0.2–2.58 | 6–175 |
| 眼影和面粉 | 3.1·10^7–1.1·10^8 | -96–116 | - |
| 防晒霜 | 1.43·10^3–1.02·10^4 | 0.05–0.22 | 74–98 |
| 本研究 | 防晒霜、牙膏、尿布膏、愈合膏和抗真菌粉 | 1.00·10^10–2.63·10^11 | 0.25–34.09 | 3–240 |

另一个需要指出的问题是，这些限制和建议是针对特定类型的纳米颗粒（例如ZnONPs或TiO2NPs）提出的，但实际上这些纳米颗粒（或其他类型的纳米颗粒）可能共存于同一产品中，从而通过协同或叠加效应增加其毒性并超过安全限值[58]。目前，这种共存情况仅在防晒霜中得到考虑，欧盟建议每种纳米颗粒在产品中的最大含量为25%[23]。不幸的是，对于多种纳米颗粒共存于同一医疗和卫生（或其他日常用品）产品中的影响及其毒性增强程度，我们仍知之甚少。因此，需要在该领域开展科学和立法工作，以改进含有纳米颗粒（如ZnONPs）的日常产品的安全生产和使用，特别是针对低浓度和长期暴露的影响。

4. 结论

本研究从微生物学和分析学的角度对医疗和卫生产品中的ZnONPs进行了重要探讨。首先，利用通常接触含ZnO产品的生物组织中的病原菌和共生微生物群开发了一系列生物毒性测试。这些结果解决了关于ZnONPs的尺寸依赖性毒性的争议。观察到的ZnONPs增强毒性突显了针对特定纳米颗粒进行风险评估的重要性，因为仅基于ZnO块状特性的传统评估无法反映其真实的生物学影响。生物毒性测试显示了明显的尺寸依赖性效应：小尺寸的ZnONPs表现出比大尺寸ZnONPs更强的抗菌活性。最小抑菌浓度（MIC）在不同尺寸间存在显著差异，证实了小尺寸纳米颗粒具有更高的反应性和生物活性。这些发现强调了在安全评估和监管框架中考虑纳米颗粒尺寸的关键性。

测试的微生物对ZnONPs的敏感性各不相同。Micrococcus luteus是最敏感的菌株（分散态ZnONPs的MIC为0.07–3%，粉末态ZnONPs的MIC为7–20%），而Streptococcus mutans则具有最强的抗性。这些生物毒性测试还表明，对病原菌起作用的纳米颗粒浓度也足以影响共生微生物群，从而可能破坏有益的微生物群落。考虑到最近的微生物学证据，某些商业产品中检测到的ZnONPs水平表明需要加强监测，因为这些微生物群的意外改变可能对宿主健康造成不利影响。

此外，从分析角度来看，本研究对一种商业ZnONP材料进行了表征，并将其用作spICP-MS分析中的可靠质量控制基质。通过全面的分析表征证实了该方法的适用性，证明了其在样品制备和分析过程中能够保持纳米颗粒的尺寸、尺寸分布和颗粒数量浓度。

对含有块状ZnO（但未标注ZnONPs含量的）的各种商业医疗和卫生产品的spICP-MS评估结果令人担忧，因为两种商业产品（S#6和S#4）未符合专业机构制定的安全标准。具体来说，样品S#6含有34.0 ± 6.5%的ZnONPs（% w/w），超过了SCCS的安全阈值，对人类健康和环境构成潜在风险。样品S#4是一种粉末制剂，由于吸入危害，明文禁止含有ZnONPs，但其中仍含有大量纳米颗粒。

最后，本研究的结果突显了当前存在的风险以及实施适当控制措施的必要性，即使考虑到纳米颗粒的共存及其新发现的类酶行为。因此，建议立法机构（如SCCS）重新评估现有的监管框架。

作者贡献声明：
Manuel Bartolomé：撰写 – 审稿与编辑、撰写初稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。
Armando Sánchez-Cachero：撰写 – 审稿与编辑、撰写初稿、可视化、验证、监督、方法学、研究、数据分析、概念化。
ángel Ríos：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念化。
María Jesús Villase?or：撰写 – 审稿与编辑、撰写初稿、可视化、验证、监督、研究、数据分析、概念化。
Rosa Carmen Rodríguez Martín-Doimeadios：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念化。
María Arévalo-Villena：撰写 – 审稿与编辑、撰写初稿、可视化、验证、监督、数据分析、概念化。
Pilar Fernández-Pacheco：撰写 – 审稿与编辑、撰写初稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析。