基于高亲和力单克隆抗体对的时间分辨荧光微球-侧向流动和电化学免疫传感平台，用于快速定量检测唾液中的幽门螺杆菌

《Talanta》：High-affinity monoclonal antibody pairs-based time-resolved fluorescent microsphere-lateral flow and electrochemical immunosensing platforms for rapid and quantitative detection of Helicobacter pylori in saliva

　　

作者：Jie Zan、Wenjie Guo、Wencheng Tan、Jieying Lan、Tianxu Li、Yongyu Huang、Rui Feng、Aoxue Gao、Chen Wang、Lei Gao、Zhiming Wu、Chaozhan Chen

中国广东省广州市广东工业大学生物医学与药学科学院

摘要

目前用于检测幽门螺杆菌（H. pylori）感染的诊断方法存在诸多局限性。内镜检查具有侵入性，而粪便抗原检测和尿素呼气试验则需要专门的实验室和复杂的样本处理流程。为解决这些未满足的需求，我们提出了一种基于唾液的新型即时检测平台，可实现快速、定量的H. pylori检测。该平台包含两种创新的生物传感器：一种时间分辨荧光微球侧向流动免疫测定条（TRFM-LFIA）和一种电化学免疫传感器，专门用于未处理唾液中的UreB抗原检测。通过整合重组抗原表达、杂交瘤技术和分子对接技术，开发出一对高亲和力的单克隆抗体（2-C2-F5/8-B5-E6），这些抗体能够识别非重叠的UreB表位。这两种生物传感器均采用双抗体夹心格式进行检测，无需样本预处理即可实现高灵敏度（TRFM-LFIA的LOD为91 pg/mL；电化学免疫传感器的LOD为38.3 pg/mL）和宽动态范围（0.1–1000 ng/mL）。这两种生物传感器对常见干扰物具有良好的特异性，重复性低于8%的变异系数，并且在21份唾液样本（11份H. pylori阳性样本，10份健康对照样本）中的检测结果与金标准方法完全一致。最重要的是，这种方法可以直接分析唾液，无需侵入性操作和复杂的基础设施，从而为资源有限的地区提供了一种可扩展且经济高效的解决方案。

引言

幽门螺杆菌（H. pylori）是一种革兰氏阴性、螺旋形的细菌，是慢性胃炎、消化性溃疡和胃腺癌的主要致病因子[1]。自1982年被发现以来，H. pylori与胃部疾病的发生密切相关，在亚洲人群中的感染率超过50%[2]。国际癌症研究机构将其归类为I类致癌物[3]，H. pylori感染显著增加了胃癌的风险，因此需要强有力的、及时的诊断策略来预防和控制这种疾病。

目前H. pylori感染的诊断方法主要分为非侵入性和侵入性两种类型。非侵入性技术，如尿素呼气试验（UBT）和粪便抗原免疫测定，由于对患者造成的不适较少，被广泛用于活跃感染的筛查[4]、[5]。然而，这些方法通常需要专门的设备（例如UBT所需的同位素标记试剂），并且在近期使用抗生素的情况下容易产生假阴性结果[6]。此外，粪便抗原测定的灵敏度受饮食因素或同时存在的胃肠道疾病的影响，限制了其在某些临床场景中的可靠性[5]。侵入性方法，如内镜活检和组织学检查以及快速尿素酶检测，仍是确诊的金标准[7]、[8]。尽管这些方法具有高特异性，但它们与操作不适、高昂的成本以及大规模流行病学筛查中的后勤挑战相关[9]。这些固有的局限性凸显了开发新型诊断策略的迫切需求，这些策略需要兼顾精确性、操作简便性和成本效益，以满足全球医疗保健的需求。

已在人类唾液中检测到H. pylori，这使得唾液采样成为一种方便且非侵入性的H. pylori感染检测方法[10]。尽管如此，由于唾液中H. pylori的含量较低，因此需要高度敏感的检测方法。虽然已经开发出几种基于PCR的技术来提高唾液样本中H. pylori的检测灵敏度[11]、[12]，但这些方法需要基因组DNA分离、专业设备和熟练人员，并且检测时间较长。最近，一些创新的生物传感平台，如基于花青素的比色测定[13]、[14]、时间分辨荧光微球侧向流动免疫测定条（TRFM-LFIA）[16]，以及使用金印刷电极（AuSPE）的免疫传感器[17]、[18]、[19]，具有高灵敏度和用户友好性的优势。然而，这些研究并未阐明所使用抗体识别的具体毒力因子，也未全面评估TRFM-LFIA条或AuSPE基免疫传感器的临床性能。解决这些问题是提高H. pylori检测准确性和可靠性的关键。

H. pylori通过分泌的尿素酶分解尿素来在胃酸环境中存活，从而产生氨以中和局部环境[20]。尿素酶的B亚基（UreB）因其结构保守性、丰度、免疫原性和稳定性，成为商业粪便抗原检测的主要靶标[21]。重要的是，UreB通过细菌的口腔传播进入唾液，越来越多的研究表明可以在唾液中检测到H. pylori [22]、[23]、[24]，这使得非侵入性的即时检测成为侵入性或实验室依赖方法的直接替代方案。本研究通过开发两种针对唾液中H. pylori UreB的新型即时检测平台（TRFM-LFIA条和电化学免疫传感器，见图1A），满足了迫切的需求。这项工作的核心是一对针对H. pylori UreB的高亲和力单克隆抗体（mAb）。利用来自伴侣蛋白辅助的原核系统的高纯度重组抗原，通过夹心ELISA和分子对接技术实现了最佳的mAb配对。这种独特配对的mAb被应用于两种生物传感器中。全面评估证实了这两种平台的高特异性、宽线性检测范围和一致性，检测限（LOD）分别为91 pg/mL（TRFM-LFIA）和38.3 pg/mL（电化学免疫传感器）。在区分临床H. pylori阳性和阴性唾液样本方面的强大诊断准确性进一步验证了它们的实用性。这些最小侵入性的平台提供了便携且用户友好的解决方案，为资源有限的地区建立了实用的非侵入性筛查范式。

章节片段

化学物质、材料和设备

本研究中使用的所有化学物质均为分析级，除非另有说明，否则无需进一步纯化。 potassium ferricyanide（K₃[Fe(CN)₆）、potassium ferrocyanide（K₄[Fe(CN)₆）、hydrogen peroxide（H₂O₂）、cysteamine和3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine（TMB）溶液均购自上海Macklin生化有限公司。磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.1 M，pH 7.4）由Lanjieke科技有限公司提供。0.5 M H₂SO₄标准溶液购自厦门...

UreB单克隆抗体的制备

在本研究中，将重组UreB蛋白与His标签融合后，通过镍柱亲和层析进行纯化。SDS-PAGE分析显示，纯化的UreB蛋白的分子量约为66 kDa，与理论预测相符，纯度超过95%，适合后续的单克隆抗体开发（见图2A）。用纯化的抗原免疫Balb/c小鼠后，产生了四条杂交瘤细胞系...

结论

我们开发了两种新型的敏感即时生物传感器——TRFM-LFIA条和电化学免疫传感器，用于非侵入性地检测唾液中的H. pylori UreB抗原。使用一对具有非重叠表位的高亲和力单克隆抗体（2-C2-F5/8-B5-E6）实现了高度特异性和敏感性的夹心免疫测定，这是两种传感器的核心。电化学免疫传感器的灵敏度更高，LOD为38.3 pg/mL，优于TRFM-LFIA...

CRediT作者贡献声明

Chen Wang：软件开发、数据分析、概念设计。Lei Gao：写作——审稿与编辑、监督、软件开发、数据分析、概念设计。Zhiming Wu：写作——审稿与编辑、监督、资源协调、数据分析、概念设计。Chaozhan Chen：写作——审稿与编辑、监督、软件开发、数据分析、概念设计。Jie Zan：写作——审稿与编辑、初稿撰写、监督...

伦理声明

本研究已获得中山大学癌症中心伦理委员会的批准（B2025-122-01）。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了广东省中医药实验室（HQL2024PZ022）的科研孵化计划和技术研发计划，以及广东省科技计划（编号：2023B1212060062）的支持。