基于定量LC-MS/MS技术的Lycosin-II类似物3的检测方法开发及其在生物基质中的稳定性评估

《Talanta》：Development of a Quantitative LC-MS/MS-Based Assay for Lycosin-II-Analog 3 and Assessment of Its Stability in Biological Matrices

　　

都京敏（Kyoungmin Do）| 李圣洙（Seongsoo Lee）| 朴钟冠（Jonggwan Park）| 吴熙镐（Jun Hee Oh）| 李婕恩（Jieun Lee）| 郑允成（Yoo-Seong Jeong）| 康允杓（Yun Pyo Kang）| 金贤真（Hyun Jin Kim）| 朴允庆（Yoonkyung Park）| 李宇玟（Wooin Lee）

韩国首尔国立大学药学院及药学科学研究所

摘要：

Lycosin-II（L-II）是一种源自Lycosa singoriensis毒液的21个氨基酸肽，它通过破坏细胞膜极化和增加膜通透性来发挥抗菌作用。后续研究证实，其类似物L-II-3具有潜在的抗菌治疗潜力。鉴于基于肽类的治疗药物常存在的药代动力学限制（如代谢不稳定），对L-II-3的生物稳定性和降解机制进行定量分析对于其在体内的应用至关重要。因此，本研究旨在开发并验证一种用于生物样本中L-II-3定量分析的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，并探讨其降解机制。通过直接蛋白质沉淀法制备了小鼠血浆和全血中的校准标准品。该方法在小鼠血浆和全血浓度范围（100-1,000 nM）内均表现出可接受的准确性和精确度（<15%）。稳定性测试表明，L-II-3在血浆中相对稳定（60分钟后剩余88.6 ± 6.2%），但在全血中迅速降解（半衰期为19.7分钟）。在测试的各种蛋白酶抑制剂中，EDTA和菲诺嗪部分延长了L-II-3在全血中的半衰期。进一步使用来自红细胞的胞质组分和膜组分进行的研究表明，胞质组分中的金属离子依赖性酶是L-II-3降解的主要因素，红细胞膜结合也对其降解有一定影响。此外，某些微生物菌株分泌的蛋白酶也会加速L-II-3的降解。这种经过验证的LC-MS/MS方法为L-II-3及其类似物的体内药代动力学研究提供了重要工具，有助于优化其在体内的循环时间和治疗效果。

引言

败血症是一种危及生命的疾病，其特征是由于机体对微生物侵袭的反应失调而导致器官功能急性受损[1]。虽然抗生素一直是控制感染的主要治疗手段[2]，但抗生素耐药性病原体的迅速出现凸显了开发新型抗菌策略的必要性[3]。在这种情况下，抗菌肽（AMPs）作为一种能够克服现有药物耐药性的新型药物受到了关注[4]。

Lycosin-II（L-II）是一种由21个氨基酸组成的线性阳离子α螺旋肽，最初从Lycosa singorinsis蜘蛛的毒液中分离得到[5]。L-II通过破坏细菌膜完整性发挥强效抗菌作用，最终导致细胞死亡。重要的是，L-II对多重耐药细菌菌株和真菌也具有活性，并且在低浓度（1-2 μM）下就能抑制生物膜的形成[6]、[7]。尽管具有这些优异特性，L-II仍存在一些局限性，如代谢不稳定和非特异性细胞毒性，因此人们开发了多种L-II类似物。在通过靶向氨基酸替换合理设计的类似物中，L-II类似物3（L-II-3）将缬氨酸和苯丙氨酸替换为赖氨酸和丙氨酸，显示出更好的抗菌活性，其最小抑制浓度（MIC）处于微摩尔范围（手稿中已提供）。需要进一步研究以探索L-II-3作为下一代抗菌肽的潜力。

尽管L-II具有这些优点，但其非特异性细胞毒性是一个显著问题，这促使人们设计了L-II的衍生物L-II-3。L-II-3（KWLSALAKIGKHLAKHQLSKL-NH₂）是通过将L-II（VWLSALKFIGKHLAKHQLSKL-NH₂）中的Val1替换为Lys、Lys7替换为Ala以及Phe8替换为Lys得到的。这些替换使净正电荷从+4（L-II）增加到+5（L-II-3），同时疏水参数从0.26增加到0.447，表明其两亲性增强。这些改变旨在增强与带负电荷的细菌膜的静电相互作用，并调节局部疏水性，从而影响膜相互作用、选择性和细胞毒性。这种基于结构的优化方法已被广泛用于下一代抗菌肽的开发[8]、[9]、[10]。

基于肽类的治疗药物通常面临代谢不稳定（体内半衰期短）、渗透性低和组织滞留有限等挑战[11]。最近的一项分析指出，在30,260种抗菌肽中，仅有约0.3%进入了临床试验阶段，这主要是由于蛋白酶的降解、溶血毒性和不良的药代动力学（PK）特性[12]、[13]。体内的代谢不稳定是一个主要问题，因为抗菌肽可能被血液中的多种蛋白酶迅速降解[14]。因此，评估L-II-3在生物基质中的稳定性对于确定其作为潜在治疗药物的可行性至关重要。

肽类物质的定量通常采用免疫测定或液相色谱（LC）方法[15]。免疫测定需要高度特异性的抗体，但在复杂基质中容易发生交叉反应，限制了其在PK分析中的可靠性[16]。因此，尽管存在一些挑战（如长肽会产生多电荷离子，使光谱解析复杂化[17]、[18]，以及抗菌肽中常见的两亲性序列容易吸附，导致非特异性结合和分析回收率低[19]，但LC与串联质谱（LC-MS/MS）结合使用仍是肽类定量常用的方法。适当的LC-MS/MS方法对于评估L-II-3的体外和体内动态行为至关重要。

基于肽类的治疗药物的成功临床应用在很大程度上取决于其药代动力学（PK）特性。因此，准确量化这些肽类在复杂生物基质中的含量对于理解其在体内的行为至关重要。本研究旨在开发并验证一种简单可靠的LC-MS/MS方法，用于定量生物基质（如小鼠全血和血浆）中的L-II-3，以支持其PK评估。该方法已在两种生物基质中得到验证，并用于评估L-II-3的稳定性及影响其降解的因素。由于微生物蛋白酶可能降解抗菌肽，从而影响其耐药性和抗菌效果，因此还使用本研究开发的LC-MS/MS方法测定了L-II-3在微生物上清液中的稳定性。

章节片段

材料

L-II-3（纯度97.8%，分子量2369.6 Da）由Beadtech（韩国京畿道）合成；稳定的同位素标记L-II-3（用作内标，纯度95.0%，分子量2416.1 Da）由Dandicure（韩国忠清北道）提供。肝素来自JW Pharmaceutical（韩国京畿道）。甲酸和乙腈购自Fisher Scientific（美国新泽西州费尔劳恩）。蛋白酶抑制剂混合物III?（PI cocktail）以及磷酸二碱和一碱钾也由该公司提供。

LC-MS/MS条件及样品制备溶剂

图1显示了L-II-3的结构及推荐的MRM跃迁。Q1扫描显示了具有多个正电荷的前体离子，这与L-II-3的碱性氨基酸组成一致。最丰富的前体离子是[M+5H]⁵⁺，其m/z值为475.0。产物离子谱也显示出多个碎片；在m/z值为475.0时，主要产物离子出现在m/z值为84.0和129.0处。选择m/z值为129.0的碎片进行定量分析，因为该片段的基质干扰最小。

结论

本研究开发并验证了一种用于血浆和全血中L-II-3定量分析的LC-MS/MS方法。该方法在100-1,000 nM浓度范围内表现出可靠的性能，准确度为91.1-108.8%，精确度为2.1-8.5%。通过该方法确认L-II-3在生物相关环境中不稳定：在血浆中相对稳定，但在全血中迅速降解。

CRediT作者贡献声明

康允杓（Yun Pyo Kang）：撰写、审稿与编辑、方法设计、实验研究。郑允成（Yoo-Seong Jeong）：撰写、审稿与编辑、实验研究、数据分析。金贤真（Hyun Jin Kim）：撰写、审稿与编辑、研究监督、资金筹集、概念构思。朴钟冠（Jonggwan Park）：撰写初稿、数据可视化、实验研究、数据分析。李圣洙（Seongsoo Lee）：撰写、审稿与编辑、实验研究、数据分析。李婕恩（Jieun Lee）：撰写、审稿与编辑、数据可视化、实验研究、数据分析。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究的利益冲突。

数据获取

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助（项目编号：RS-2024-00401422）。