基于天鹅绒状g-C3N4的羟乙基纤维素增强电化学发光传感器，用于超高灵敏度检测3-硝基-L-酪氨酸

《Talanta》：Hydroxyethyl cellulose-boosted electrochemiluminescence sensor based on velvet-like g-C3N4 for ultrasensitive detection of 3-nitro-l-tyrosine

　　张华昌|徐睿|魏晓峰|江俊才|张瑞忠|宋大谦|丁兰|陈彦华
吉林大学化学学院，吉林大学光谱分析仪器工程技术研究中心，长春，130012，中国

**摘要**
本研究首次将羟乙基纤维素（HEC）引入电化学发光（ECL）传感策略中。通过修饰一种新型的类似天鹅绒的石墨碳氮化物（V-g-C3N4），该材料具有优异的导电性和发光性能，我们成功构建了一种基于HEC功能化的V-g-C3N4（HEC/V-g-C3N4）的高灵敏度ECL传感器。HEC的引入确保了V-g-C3N4在玻璃碳电极表面的稳定固定，从而促进了更多激发态物质的生成，显著增强了ECL信号强度。与常用的壳聚糖功能化的V-g-C3N4（CS/V-g-C3N4）相比，HEC/V-g-C3N4的ECL强度提高了4.35倍。因此，HEC/V-g-C3N4被应用于ECL传感器中，实现了对人体唾液中3-硝基-L-酪氨酸（3-NT）的超灵敏检测。在优化条件下，该传感器表现出宽检测范围（1×10^-10至1×10^-5 M）和极低的检测限（2.8×10^-11 M）。在唾液样品中检测3-NT时，传感器的准确度较高，回收率在96.77%至106.1%之间，相对标准偏差在1.15%至5.56%之间。结果表明，该ECL传感器具有出色的选择性、稳定性和重复性，为健康个体唾液中3-NT的高灵敏度检测提供了一个新颖、可靠且经济有效的平台。

**引言**
3-硝基-L-酪氨酸（3-NT）是一种关键的生物标志物，通过酪氨酸残基的硝化反应产生，这一过程由过量的活性氧（ROS）与蛋白质在氧化应激条件下的相互作用引发[1,2]。3-NT的浓度是氧化损伤的直接指标，有助于了解与氧化应激相关的疾病（包括冠心病、糖尿病和癌症）的严重程度[3]。因此，准确测量3-NT对于评估疾病进展和理解氧化应激相关病理机制至关重要。
目前，已经开发了多种检测3-NT的方法，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[4]、高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）[5,6]、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[7]、荧光方法[8,9,10]以及电化学方法[11]。虽然HPLC-ECD和LC-MS/MS具有高灵敏度，但其广泛应用受到高昂的设备成本、复杂操作和耗时程序的限制。相比之下，ELISA和电化学方法较为简单，但容易受到环境因素的干扰，可能导致误差。荧光方法虽然简单且响应速度快，但灵敏度低于基于HPLC的技术。因此，人们不断努力开发结合高灵敏度、低成本、操作简便性和快速响应的新方法，以使3-NT的检测更加普及和广泛应用。
为应对这些挑战，大量研究致力于开发具有高灵敏度、成本效益、易用性和快速分析能力的新型检测平台，以提高3-NT检测的实用性和可及性，使其更适合临床诊断和研究，并最终促进其在监测氧化应激相关疾病中的更广泛应用。
电化学发光（ECL）传感器因其高灵敏度、操作简便、低背景噪声和成本效益而受到广泛关注。ECL过程涉及对电极施加特定电压，触发发光材料中的电化学反应或化学反应，使其达到激发态。当这些激发态材料返回基态时，会发出光，产生ECL信号[12,13]。近年来，ECL传感器已广泛应用于金属离子[14]、小分子[15]和生物标志物的定量分析[16]中。这些传感器的性能在很大程度上取决于发光材料的性质，这些性质对检测的灵敏度和效率起着关键作用。
在这方面，石墨碳氮化物（g-C3N4）作为一种有前景的ECL发光材料而脱颖而出[17]，相比传统的发光剂（如钌联吡啶复合物[18,19]、鲁米诺[20]、金属纳米簇[21]和碳点[22]具有明显优势。这种无金属的半导体材料具有出色的热稳定性和化学稳定性、生物相容性以及低成本，并且可以通过简单的热解大规模合成[23]。在分子层面，g-C3N4的π共轭系统与三嗪环单元和sp2杂化的碳-氮网络结合，形成了2.7 eV的带隙，赋予其优异的光学和电化学性能[24,25,26]。2012年，Xiao及其同事首次将g-C3N4用于ECL传感器，成功检测到了Cu2+离子[25]。此后，g-C3N4在ECL传感领域取得了快速发展。值得注意的是，目前尚未有研究报道使用这种有前景的材料检测唾液中的3-NT。这一非侵入性诊断领域的空白激发了我们当前的工作，旨在开发一种基于g-C3N4的新型ECL传感器，以实现唾液样本中3-NT的超灵敏定量。
传统的g-C3N4合成方法通常涉及在高温下对富含氮的前体（如三聚氰胺、二氰胺或硫脲）进行热缩聚[27,28]。然而，这种方法存在几个关键限制：煅烧过程会产生氰化物和一氧化氮等有害副产物，带来环境和安全风险。此外，所得的g-C3N4通常溶解度低且导电性有限。为解决这些问题，通常需要复杂的后处理步骤（如溶剂剥离、酸处理和二次煅烧）来提高水溶性和电荷传输性能——这些改进对于实现满意的ECL性能是不可或缺的[27,29,30]。鉴于这些挑战，我们开发了一种创新的一步合成策略，利用水辅助热缩聚直接制备类似天鹅绒的石墨碳氮化物（V-g-C3N4），如图1(A)所示。

**基于g-C3N4的ECL传感器构建**
基于g-C3N4构建ECL传感器需要对工作电极表面进行修饰。直接用g-C3N4修饰玻璃碳电极（GCE）可能在检测过程中导致电极脱落，从而产生不稳定的ECL信号。为解决这一问题，通常使用壳聚糖（CS）因其粘附性能而确保g-C3N4在电极表面的稳定附着。然而，CS的水溶性较差，因此在水溶液中的分散性有限。因此，采用CS将材料固定在电极表面并不是一种理想的策略。因此，开发一种更有效的将g-C3N4固定在电极表面的方法对于稳定ECL传感器性能至关重要。尽管这个问题很重要，但在之前的研究中并未得到充分讨论。
羟乙基纤维素（HEC）是一种纤维素衍生物，其聚合物链上含有丰富的极性羟基，使其具有优异的水溶性和电解质亲和力。溶解在水介质中时，HEC形成透明粘稠溶液，表现出显著的粘附性和成膜性能[31]。由于其固有的生物降解性和生物相容性，HEC在光降解应用中具有巨大潜力[32]。在电化学研究中，HEC已被成功用作锌电极的保护涂层[33]和锂离子电池的电解质修饰剂，以提高循环稳定性[34]。因此，我们提出将HEC引入ECL系统中，利用其独特性质来提升性能。
基于这些发现，我们开发了一种使用羟乙基纤维素功能化的V-g-C3N4（HEC/V-g-C3N4）的新型电极修饰策略。ECL表征显示，HEC/V-g-C3N4的ECL强度比壳聚糖修饰的V-g-C3N4（CS/V-g-C3N4）提高了4.35倍。在此基础上，我们开发了一种用于超灵敏检测3-NT的生物传感器（见图1(B)）。检测机制依赖于HEC/V-g-C3N4与3-NT之间的特定ECL共振能量转移（ECL-RET），导致信号强度随浓度变化而变化。该生物传感器表现出优异的重复性和稳定性，并成功应用于人体唾液中3-NT的高灵敏度检测。这项工作为ECL材料的功能化提供了一种新范式，为3-NT检测提供了一个稳健的平台，并具有潜在的即时疾病监测潜力。

**试剂和实验装置**
详见补充材料。

**V-g-C3N4的制备**
V-g-C3N4采用一步水辅助热缩聚方法合成，具体方法见参考文献[35]。简而言之，将15.0000 g尿素溶解在20 mL去离子水中，室温下超声处理直至完全溶解。然后将其转移到带盖的氧化铝坩埚中，并放置在箱式电阻炉的中心。以10°C/min的速率将温度升至400°C并保持该温度。

**V-g-C3N4和HEC/V-g-C3N4的表征**
图S1A展示了HEC、V-g-C3N4和HEC/V-g-C3N4的X射线衍射（XRD）图谱。在V-g-C3N4的XRD图谱中，约2θ=13.56°处的弱衍射峰对应于（100）晶面，这与层间堆叠程度和厚度有关。接近2θ=27.32°的明显衍射峰对应于（002）晶面，与芳香族共轭系统的堆叠有关。这些特征与文献中报道的V-g-C3N4的特性一致[35,38,39]。

**结论**
本研究成功开发了一种基于HEC功能化的V-g-C3N4的高性能ECL传感器，该传感器通过简单的一步水热法合成。HEC的修饰不仅提高了电极稳定性，还显著增强了ECL强度。系统研究表明，HEC/V-g-C3N4–K2S2O8系统与CS/V-g-C3N4系统相比具有不同的ECL生成机制，实现了宽线性范围内的超灵敏3-NT检测（1×10^-10至……）。

**作者贡献声明**
张华昌：概念构思、数据管理、方法论、初稿撰写。
徐睿：数据管理、方法论、初稿撰写。
魏晓峰：实验研究、方法论。
江俊才：实验研究、方法论。
张瑞忠：方法论。
宋大谦：方法论。
丁兰：审稿与编辑。
陈彦华：资金获取、审稿与编辑。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

**致谢**
本研究得到了吉林省科技发展计划项目（20230402022 GH）的支持。