通过荧光蛋白和Cy5标记的抗Tag单链DNA编码的双色微球，用于多重检测呼吸道病原体

《Talanta》：Dual color microsphere encoded by fluorescent protein and Cy5-labeled anti-Tag ssDNA for multiplex detection of respiratory pathogens

　　刘学勤|程亮亮|郑炳杰|胡申松|魏书雅|胡永刚
中国华中农业大学农业微生物国家重点实验室，武汉，430070

**摘要**
由于病原体多样、症状重叠以及感染率较高，呼吸道疾病的快速准确诊断具有挑战性。本文开发了一种基于磁性微球的悬浮阵列技术，该技术利用蓝色荧光蛋白（mTagBFP）和Cy5标记的抗Tag单链DNA（MB@mTagBFP&anti-Tag-Cy5）来同时检测五种核心呼吸道病原体。通过使用5′-Tag标记的上游引物和5′-生物素化的下游引物进行多重PCR反应，生成双标记产物（Tag和生物素）。所得复合物（MB@mTagBFP&anti-Tag-Cy5-Tag-dsDNA-phycoerythrin）通过流式细胞术进行分析，检测限达到1拷贝/μL（3 SD/K）。对于呼吸道合胞病毒和SARS-CoV-2，线性定量范围为10^1至10^5拷贝/μL；对于流感A、流感B和肺炎支原体，范围为10^1至10^6拷贝/μL。回收率在89.73%至107.25%之间。对100个样本的临床测试显示，该方法具有97%的敏感性和90%的特异性，能够有效区分单一感染和混合感染。这种集成方法实现了呼吸道病原体的快速、高通量和灵敏检测，为早期诊断、治疗指导和流行病学监测提供了重要支持，在感染控制和疾病预防中具有广泛应用前景。

**引言**
呼吸道疾病对全球人类健康构成严重威胁，是导致高发病率和死亡率的主要原因之一。它们给医疗系统带来了沉重负担，对婴儿、老年人和免疫功能低下者等高风险人群的影响尤为显著。流行病学数据显示，在东南亚地区，5岁以下儿童的死亡中有22%是由呼吸道感染（RTIs）引起的[1,2]。同时，在北美，呼吸道感染是肉牛死亡的主要原因，占死亡病例的40%[3]。这些发现共同表明了呼吸道病原体的跨物种影响，它们会对人类和动物健康产生不利影响。2019冠状病毒病（COVID-19）的爆发，由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引发，进一步凸显了快速准确检测呼吸道病原体的迫切需求——此类工具对于及时提供临床护理和实施有效的感染控制措施至关重要。呼吸道感染的诊断和管理面临的核心挑战在于其病因的复杂性。引起呼吸道感染的病原体不仅包括病毒（如流感A/B（Flu A/B）、呼吸道合胞病毒（RSV）和SARS-CoV-2），还包括细菌（如肺炎支原体（M. pneumoniae）和b型流感嗜血杆菌（Hib）[1,2,3]。此外，19.7%至34%的临床病例存在多重感染[2,4,5]。如果病原体鉴定延迟或错误，往往会导致不必要的抗生素使用：大约37%的呼吸道感染儿童患者接受了没有医学依据的抗生素治疗[6]。这不仅削弱了感染控制措施，还加速了耐药细菌的院内传播和病毒疫情的扩散[7,8]。

**呼吸道疾病的临床诊断长期以来受到多个重大挑战的阻碍。**
一个主要问题是不同病原体引起的临床症状高度相似：许多呼吸道感染都有咳嗽、发热和呼吸困难等共同表现，仅凭临床症状很难确定具体病原体。另一个关键挑战是呼吸道疾病中的多重感染现象普遍，估计30%至50%的住院患者同时感染两种或更多病原体。呼吸道感染的异质性以及混合感染的频繁发生，给有效的临床管理带来了巨大障碍。传统的单一病原体检测方法常常无法检测到次要病原体，从而影响诊断的准确性和治疗策略的有效性。临床实践的第三个关键要求是检测的及时性，特别是对于流感病毒和SARS-CoV-2等高度传染性的病原体。通常需要在24小时内确诊，以便立即进行隔离和治疗，防止疫情进一步扩散[3]。不幸的是，传统的呼吸道病原体检测方法在上述挑战面前显得不足。例如，病毒分离和培养虽然是传统的“金标准”，但耗时较长（通常需要2-5天），且受样本质量和培养条件等因素限制，导致灵敏度较低[3]。免疫层析检测虽然快速，但对低滴度感染的灵敏度不足，也无法区分密切相关的病毒（如不同冠状病毒），从而导致较高的假阴性率[9]。单重PCR提高了灵敏度，但无法实现多重检测，需要为每个目标设置单独的反应体系，不适用于筛查8-20种常见的呼吸道病原体[10,11]。抗原检测方法虽然快速，但其灵敏度仅为PCR的60%-80%，容易出现假阴性结果和漏诊[9]。因此，开发一种能够同时检测多种病原体的技术——满足高通量、高灵敏度和快速分析要求的技术——仍然是临床诊断和流行病学监测中未解决的关键问题。

**用于呼吸道病原体的多重检测技术**
通过核酸扩增或创新检测组合来识别病毒和细菌病原体的技术，在快速、高灵敏度诊断方面具有显著优势。这些技术已成为实现快速病原体鉴定和全面呼吸道疾病监测的可行解决方案[12]。目前有许多平台正在进行深入研究和临床验证，包括多重PCR结合毛细管电泳（CE）[13,14]、质谱（MS）[15]、全基因组测序（WGS）[16,17]、悬浮阵列[18,19]、多重定量实时PCR（multiplex qPCR）[20,21]、多重数字PCR（multiplex dPCR）[22,23]、多重重组酶聚合酶扩增（RPA）结合侧向流动免疫检测（LFA）[24,25]以及环介导等温扩增（LAMP）结合微流控[26,27]。其中，基于多重PCR的病原体检测技术在快速筛查呼吸道感染方面具有明显优势，能够在单次反应中实现高多重检测能力，试剂消耗少，污染风险低，成本降低[28]。此外，该技术不需要不同波长的荧光团或TaqMan探针（这些试剂可能抑制PCR扩增），从而避免了光学拥挤、引物二聚体引起的信号抑制以及短扩增子优先扩增等问题，也无需复杂的引物平衡算法[29,30]。多重PCR-悬浮阵列技术结合了多重PCR和悬浮阵列的优点，保持了多重PCR的高特异性，同时利用了悬浮阵列的快速检测和高通量能力。凭借基于激光的检测技术的高灵敏度，其操作流程简化，适用于同时筛查多种呼吸道感染病原体[31,32]。鉴于涉及多种呼吸道病原体的感染常常导致治疗失败和疫情扩散，迫切需要一种经济实惠的多重PCR耦合悬浮阵列技术，能够同时识别多种呼吸道病原体。这样的工具将有助于精准医疗和临床及公共卫生环境中的实时感染控制[33]。

**流式细胞术基悬浮阵列的核心在于编码荧光微球的性能。**
通常采用“预编码”策略制备编码微球，如“膨胀”法（Luminex技术）[34]、可聚合封装[35]和逐层自组装[36]等方法将多种荧光物质嵌入微球中。然而，“预编码”策略存在一些问题，包括染料加载精度不足、使用有毒化学试剂、Luminex技术的专利限制、对微球基质的有限选择性、严格的技术要求以及检测成本显著增加[37,38]。为解决这些问题，我们团队[31]和黄氏团队[39]最近提出了“后编码”策略来制备荧光编码微球。此外，用荧光蛋白编码的荧光微球表现出优异的分析性能，尤其是通过降低背景信号提高了信噪比和检测灵敏度[40]。遗憾的是，目前尚无关于使用后编码策略制备实际样本检测用荧光微球的研究报告。在本研究中，我们构建了一种使用mTagBFP和Cy5标记的抗Tag单链DNA编码的悬浮阵列。然后，将该平台与多重PCR结合，用于同时检测人体中的多种呼吸道病原体（图1），包括RSV、流感A、流感B、肺炎支原体和SARS-CoV-2等5种不同目标。具体步骤如下：首先，纯化mTagBFP以提供光学信号，并合成一系列3′-氨基修饰的Cy5标记的单链抗Tag DNA（表S1）；这些寡核苷酸同时具有编码Cy5信号和特异性识别携带互补Tag序列的目标分子的作用[41]（图1-A）。随后，通过EDC-NHS偶联反应将mTagBFP和3′-氨基修饰的Cy5标记的抗Tag DNA序列分别组装到10.0 μm羧基修饰的无色磁性微球上。通过改变Cy5标记的抗Tag DNA的类型和浓度以及mTagBFP的浓度，成功生成了一系列编码微球。与传统依赖膨胀[34]、嵌入[42]或逐层自组装[36]的预编码方法不同，我们的方法采用后编码方式生成编码微球。其次，合成一系列引物用于5种不同目标的多重PCR扩增反应，每个特定的上游引物在其5′端具有独特的Tag序列，而下游引物具有生物素化的5′端（表S2）。同时进行多重PCR扩增，以扩增所有5种目标DNA片段。带有特定Tag序列的PCR产物与mTagBFP和Cy5标记的抗Tag单链DNA编码的磁性微球（MB@mTagBFP&anti-Tag-Cy5）基于碱基配对互补原理杂交（图1-B）。最后，在MB@mTagBFP&anti-Tag-Cy5-Tag-dsDNA-生物素复合物中加入链霉亲和素–R-藻红蛋白（SAPE），进一步形成MB@mTagBFP&anti-Tag-Cy5-Tag-dsDNA-PE复合物（图1-C）。流式细胞仪的两束激光同时解码微球身份（mTagBFP的蓝色荧光和抗Tag DNA的Cy5荧光），并量化捕获的目标分析物，实现双重编码悬浮阵列检测呼吸道病原体。我们系统优化了多重PCR反应条件和双重编码微球的耦合参数，随后评估了该检测方法的灵敏度、特异性、重复性和临床实用性。本研究开发的平台为呼吸道感染的快速全面诊断提供了新的技术工具，并为未来高通量病原体检测平台的发展提供了参考。

**材料与设备**
10.0 μm粒径的羧基修饰磁性微球购自苏州知益球科技有限公司（中国苏州）。磷酸盐缓冲盐水（PBS）由实验室自制，用作生物分子实验中的溶剂和缓冲剂。链霉亲和素–藻红蛋白（SAPE）购自北京索尔柏科技有限公司（中国北京）。多重PCR检测试剂盒购自Takara Bio（大连）/Biori。

**基于mTagBFP和抗Tag单链DNA的悬浮阵列构建**
DS-PAGE分析（图S1-a）显示26 kDa处有一个对应mTagBFP的单一条带，其荧光谱（图S1-b）在457 nm处显示主要发射峰，证实了蛋白质的成功克隆和表达。纯化的mTagBFP和合成的抗Tag-Cy5单链DNA通过EDC/NHS偶联将其氨基与微球表面的羧基结合，共同固定在相同大小的羧基修饰磁性微球上。

**讨论**
在本研究中，mTagBFP和抗Tag-Cy5单链DNA通过EDC/NHS偶联成功固定在磁性微球上。编码微球在两个荧光通道中的CV值均低于1.3%，显示出比传统预编码方法更高的荧光均匀性。这种高均匀性归因于mTagBFP的光学稳定性、可控的共价偶联过程和优化的反应条件。加速稳定性测试显示信号强度超过90%。

**结论**
本研究建立了一种基于双色编码磁性微球（mTagBFP和Cy5标记的抗Tag单链DNA）与多重PCR结合的悬浮阵列平台，用于同时检测五种主要呼吸道病原体。与现有的多重检测技术相比，该方法具有多个不可替代的优势。首先，这里采用的后编码策略避免了有毒有机溶剂的使用、复杂的预编码程序和专有技术。勇刚·胡：概念构思、资金获取、项目管理、资源调配、监督以及论文的撰写、审稿与编辑工作。
利益冲突声明：作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
致谢：本项工作得到了国家自然科学基金（项目编号22274060）、国家重点研发计划（项目编号2022YFD1800701）、湖北省教育厅科研项目（项目编号B2016581）以及中央政府支持地方科技发展专项（项目编号2024ZY01013）的资助。流式细胞术数据采集工作是在国家农业微生物学重点实验室的核心设施中完成的。