《Talanta》：Scout-Triggered MRM from untargeted Data: An R-Based Strategy for Multiplexed Targeted Metabolomics
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雷米·德·博尼（Rémy De Boni）|纪尧姆·罗西尼奥尔（Guillaume Rossignol）|德尔芬·阿尔基耶（Delphine Arquier）|贝努瓦·约瑟夫（Beno?t Joseph）|盖伊·福尔内（Guy Fournet）|杰罗姆·勒穆安（Jér?me Le
雷米·德·博尼（Rémy De Boni）|纪尧姆·罗西尼奥尔（Guillaume Rossignol）|德尔芬·阿尔基耶（Delphine Arquier）|贝努瓦·约瑟夫（Beno?t Joseph）|盖伊·福尔内（Guy Fournet）|杰罗姆·勒穆安（Jér?me Lemoine）|杰罗姆·朗东（Jér?me Randon）|索菲·艾西里克斯（Sophie Ayciriex）|约汉·克莱门特（Yohann Clement）|阿诺德·萨尔瓦多（Arnaud Salvador）
克劳德·贝尔纳·里昂第一大学（Université Claude Bernard Lyon 1）、法国国家科学研究中心（CNRS）、分析科学研究所（Institut des Sciences Analytiques）、UMR 5280项目组，法国维勒乌尔班（Villeurbanne），邮编69100
摘要：
从非靶向发现转向靶向验证是代谢组学中的一个重大挑战，这一过程常常受到方法可转移性差以及液相色谱-质谱（LC-MS）平台间保留时间（RT）变化的阻碍。为了解决这一问题，本文介绍了一个基于R语言的软件包“Scout-MRM Builder”，它能够从非靶向的高分辨率MS2数据自动生成高度多重化的靶向方法。该软件采用了“Scout-Triggered Multiple Reaction Monitoring”（StMRM）策略，使用N-烷基吡啶inium-3-磺酸盐（NAPS）标准物作为动态RT标记物（“scouts”）。通过检测每个标记物来触发特定的离子对转化，从而确保对RT变化的鲁棒性。系统会自动提取离子对、识别标记物，并生成可用的StMRM方法，包括对于缺乏碎片化光谱的特征采用伪MRM（pseudo-MRM）转换的方式。通过对猪肝提取物进行非靶向分析，从558个特征中生成了一个能够监测1,312个转化的StMRM方法。实验结果显示高度的可重复性，其中89.9%的转化的相对标准偏差（RSD）低于20%。当将该方法应用于肝缺血-再灌注损伤模型时，得到的结果与最初的非靶向分析结果高度一致。此外，还识别出一组潜在的生物标志物，其统计性能有所提升。总之，“Scout-MRM Builder”提供了一个强大的框架，通过提高方法的可转移性和可靠性，实现了从非靶向发现到靶向验证的过渡。
引言
代谢组学旨在定量和定性研究生物样本中小分子浓度的变化。这一学科在许多领域都发挥着关键作用，包括识别新的生物标志物，以评估个体在接触有毒物质或疾病后的表型状态。
生物基质（如尿液、胆汁、血浆、肝脏）中同时存在的代谢物种类繁多，数量从几百种到几千种不等[1]。它们的质量范围相对较窄（在60至2,000 Da之间）[2]，但其动态浓度范围却非常广泛，从几毫克/毫升（mg/mL）到几皮克/毫升（pg/mL）不等。此外，代谢物具有多种物理化学性质，特别是在化学功能（酸/碱性质）和极性（logP）方面[3]。
为了解决这种化学多样性，液相色谱与非靶向高分辨率质谱（LC-HRMS）结合的方法成为首选。液相色谱可以根据化合物与固定相（例如HILIC、RPLC）和流动相的亲和力进行分离，而非靶向HRMS则能够同时监测广泛的质谱范围，并通过串联质谱实验（如数据依赖性采集[DDA]或数据独立性采集[DIA]）提供结构信息。然而，这种方法产生的数据集较为复杂，需要稳健可靠的数据处理策略。
为此开发了多种软件工具，包括MS-DIAL [4]、MZmine [5]、XCMS [6]、Compound Discoverer、OpenMS和Progenesis QI。尽管这些平台具有共同的处理步骤（如色谱峰检测和积分、保留时间对齐、跨实验的信号标准化以及缺失峰的重整合），但目前尚无关于最佳工具的共识[7]、[8]，且结果往往严重依赖于所选算法[9]、[10]及其参数设置[12]、[13]、[14]。相比之下，靶向分析（特别是在选择性反应监测[SRM]模式下）产生的数据集更为简单，每个转化都对应一个特定的色谱轨迹。这便于使用Skyline、MassHunter（Agilent）、MultiQuant（Sciex）和Xcalibur（Thermo）等常用软件进行数据处理。然而，设计靶向方法需要事先了解感兴趣的化合物，这通常涉及获取和优化化学标准品或从文献或商业来源调整现有方法，这些方法通常针对特定的代谢途径[15]。
为了克服这一限制，并为已知和未知化合物开发靶向方法，出现了“混合”或“伪靶向”策略。这些方法基于使用DDA或DIA实验从混合生物基质中获得的高分辨率光谱[16]、[17]。例如，Chen等人[18]使用Q-TOF仪器对肝细胞癌患者和健康对照组的血清样本进行了分析，从而开发了一种基于三重四极杆（QqQ）的定时MRM方法，能够监测518个离子对并识别出几个与疾病相关的生物标志物。同样，Zha等人[16]使用DIA-SWATH方法创建了一种高度多重化的定时MRM方法，可以监测多达2091种代谢物，并突出了某些结直肠癌诊断中的生物标志物。
正如Shao等人[19]所强调的，要在非靶向分析和靶向分析之间实现可比的色谱分离效果，必须保持相同的LC设置。这是因为在定时MRM方法中增加转化数量需要缩小采集窗口，以保持与峰宽兼容的循环时间。因此，该方法对色谱变化（如pH值变化、流动相制备、延迟体积和死体积变化）非常敏感，这阻碍了其在不同系统间的转移。
为了解决对色谱变化的敏感性问题，开发了一种称为Scout-Triggered MRM（StMRM）的替代采集策略[20]、[21]。这种方法的原则是用动态触发器替代固定的保留时间窗口。具体来说，在每个样本中加入少量“scout”化合物，这些化合物在色谱梯度上战略性地分布。当质谱仪检测到其中一个标记物时，会触发预定义的目标转化列表的采集，直到检测到下一个标记物（见图1）。因此，分析结果取决于化合物的相对洗脱顺序，而不是它们的绝对保留时间，从而提高了高度多重化方法的鲁棒性和可转移性[22]。此外，这些化合物可以在高分辨率质谱之前添加到样本中，用于快速创建适用于低分辨率质谱的StMRM方法。
本研究介绍了一种自动化工作流程，以填补非靶向发现和靶向验证之间的空白。我们展示了如何利用高分辨率DDA光谱快速构建基于StMRM策略的高度多重化靶向方法。为了简化这一过程，我们开发了一个R语言包，该包可以自动生成可观测转化列表、识别合适的标记物转化，并生成可直接使用的分析方法。最后，我们通过使用猪肝移植缺血-再灌注损伤模型组织样本，将我们的方法与传统非靶向方法进行了比较，从而比较了缺血-再灌注损伤前后肝脏的代谢组学特征。
部分摘录
化学物质和材料
水、乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）（Optima? LC/MS级）均购自Fisher Scientific（法国斯特拉斯堡）。1-甲基吡啶inium-3-磺酸盐、3-吡啶磺酸钠盐和甲酸铵（97%，试剂级）购自Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特，Merck KGaA）。C2（1-溴乙烷）到C20（1-溴二十烷）的线性1-溴烷烃以及亮氨酸购自Enamine Ltd.（乌克兰基辅）。
CK14软组织匀浆试剂盒
标记物选择
如引言中所述，从高分辨率数据生成MRM方法面临色谱系统固有差异的挑战。即使在同一实验室的不同液相色谱系统上进行非靶向和靶向分析，这一问题依然存在。正如Schwaiger-Haber等人[29]所指出的，使用狭窄的定时MRM窗口的方法对由物理因素引起的保留时间变化特别敏感。
结论
StMRM方法的实用性得到了验证，它能够在最少的数据处理下生成稳健可靠的靶向方法，仅需使用非靶向采集的质控重复实验和溶剂空白样本——无需任何额外的优化步骤。重要的是，监测每个化合物的多个转化至关重要，因为DDA光谱中最强烈的碎片并不一定能产生最敏感的MRM转化。
StMRM的性能与传统非靶向方法相当
CRediT作者贡献声明
雷米·德·博尼（Rémy De Boni）：撰写原始稿件、软件开发、方法论设计、实验实施、数据分析。纪尧姆·罗西尼奥尔（Guillaume Rossignol）：资源调配、实验支持、资金获取。阿诺德·萨尔瓦多（Arnaud Salvador）：撰写原始稿件、项目监督、项目管理、方法论设计、资金获取、概念构思。索菲·艾西里克斯（Sophie Ayciriex）：撰写内容审核与编辑。约汉·克莱门特（Yohann Clement）：方法验证、软件应用、数据分析。杰罗姆·勒穆安（Jér?me Lemoine）：资源协调。杰罗姆·朗东（Jér?me Randon）：撰写内容审核与编辑。贝努瓦·约瑟夫（Beno?t Joseph）：资源支持。
手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了Gemini pro（Google?）工具来辅助语言编辑、句子重构以及提高手稿的整体清晰度。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审查和修改，并对发表文章的内容负全责。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢法国高等教育、研究与创新部（Ministère de l’Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l’Innovation）为雷米·德·博尼提供的博士学位奖学金。本研究得到了法国国家环境与职业健康研究计划（Anses，项目编号2023-EST-077）的支持。作者还衷心感谢ICBMS – UMR CNRS 5246团队中的贝努瓦·约瑟夫教授（Beno?t Joseph）和盖伊·福尔内博士（Guy Fournet）在项目中的宝贵帮助。
