纳米多孔电极上的复合电化学适配体传感器：用于生物流体中普鲁卡因、ATP和腺苷的灵敏检测及抗污染功能

《Talanta》：Multiplexed electrochemical aptasensor on a nanoporous electrode: towards sensitive and anti-fouling detection of procaine, ATP and adenosine in biofluids

　　

谢宇|赖金豪|严曦|卡莱·萨尔米宁

江西省特种光电人工晶体材料重点实验室，景岗山大学化学与化学工程学院，吉安，343009，中国

摘要

本研究提出了一种绿色且简单的一步电化学方法，用于制备纳米多孔金电极。该方法通过在含有抗坏血酸（AA）和盐酸（HCl）的水溶液中，利用线性扫描伏安法（LSV）对金电极进行阳极氧化来实现。金电极在盐酸中发生腐蚀形成复合物，由于抗坏血酸的存在，这些复合物同时被还原为金纳米颗粒，从而在电极表面形成多孔结构。与光滑电极相比，该方法制备的纳米多孔金电极具有更大的电活性面积。所制备的电极被用于构建基于电化学适配体的（EAB）传感器，在快速检测包括普鲁卡因、三磷酸腺苷（ATP）和腺苷（ADE）在内的小分子方面表现出高灵敏度和良好的抗污染性能。本研究为纳米多孔金电极的制备提供了一种新的高效方法，有望在生物传感和临床即时检测中得到更广泛的应用和进一步发展。

引言

电化学生物传感器因其高灵敏度、选择性和微型化能力而受到广泛关注，在临床即时检测（POCT）中具有巨大潜力[1]。基于电化学适配体的（EAB）传感器使用DNA或RNA作为目标识别元件，并通过共价连接的氧化还原报告剂提供输出信号[2]。由于适配体与目标的特异性结合导致构象变化，电极表面与报告剂之间的距离发生变化，这会影响电子转移速率（即电流），从而产生的可测量电化学信号与目标浓度呈单调相关[3]。由于适配体的广泛性和特异性，可以在复杂基质中甚至体内快速检测多种分析物，例如无机离子、蛋白质、毒素和小分子[4]（见图1）。

尽管E-AB传感器具有显著优势，但仍存在一些局限性，最明显的是信号输出相对较低[5]。这通常由两个因素引起。首先是绝对电流较低，因为每个与适配体结合的氧化还原报告剂只能与电极交换非常有限的电子，并且氧化还原报告剂通过适配体与电极表面分离[6]。这与利用酶的传感器（如葡萄糖传感器）不同，后者在目标存在下能催化生成可电化学检测的产物，从而可能以牺牲分析时间为代价获得较大的信号增益[7]。另一个原因是电极表面面积有限以及附着在其表面的探针密度有限[8]。因此，体内使用的EAB传感器通常电流响应仅为微安甚至纳安级别，而生物基质中的蛋白质大分子等物质会导致电极污染，干扰目标的准确检测[9]。因此，实现准确检测的关键是增加电极表面的微观面积，同时提高其抗污染性能。

值得注意的是，使用铁氰化物作为氧化还原探针的循环伏安法（CV）已被确立为评估纳米多孔金电极在复杂生物介质中抗污染性能的标准可靠方法。先前的研究表明，纳米多孔金结构可以排除大蛋白质污染物，同时允许小氧化还原分子（如铁氰化物）自由进入电极内部进行高效电子转移[10]。这种独特的筛选效应，结合显著增大的电活性表面面积，使纳米多孔金具有出色的抗生物污染能力，非常适合用于生物流体中的电化学传感。

迄今为止，已经设计了多种制备纳米结构金电极的策略。非共晶化方法（也称为化学腐蚀法）通过适当的腐蚀作用选择性地溶解二元固溶体合金中的更活泼金属[11]。剩余的惰性金属原子聚集并生长形成连续的多孔结构。例如，在20°C至35°C之间，将金-银合金置于浓硝酸中自由腐蚀20至40分钟，可以制备出纳米多孔金[12],[13],[14]。阳极氧化是一种绿色且温和的替代方法[15]。通过在氯化电解质中施加阳极电位步骤来阳极氧化金电极，可以避免使用有机化学物质、高温和模板[16]。氯化电解质的性质和浓度、电位步骤、时间和温度都决定了纳米多孔金的孔径和结构[17]。电化学蚀刻利用电化学手段在特定电解质中蚀刻金合金或其前体，构建多孔结构[18]。例如，在ZnCl₂/苯甲醇电解质中的光滑金电极上进行循环扫描时，初始的阴极电位扫描会在电极表面沉积锌，形成Au–Zn合金[19]。随后，阳极电位扫描去除锌成分，生成纳米多孔金膜。通过调节CV参数和循环次数，可以获得具有三维纳米孔结构的金电极[20]。这些纳米多孔金结构已成功应用于基于电化学适配体的（E-AB）传感器中，用于多种应用，包括实时体内药物监测[21]、超灵敏检测癌症生物标志物（如血管内皮生长因子[22]）以及通过心脏肌钙蛋白I检测快速诊断急性心肌梗死[23]，体现了纳米多孔电极在临床诊断中的多功能性。

在这项工作中，开发了一种绿色合成方法，可以在含有HCl和AA的溶液中通过LSV扫描在几十秒内制备出纳米多孔电极。与未经处理的电极相比，粗糙电极的电化学活性面积提高了20倍。多孔电极被用于构建用于检测普鲁卡因、ATP和ADE的EAB传感器，显示出更高的检测灵敏度和更低的检测限。为了探索纳米多孔电极在体内检测中的潜力，将构建的EAB传感器放入流动液体中检测普鲁卡因、ATP和ADE，以准确模拟体内的复杂流动液体环境。与光滑电极相比，纳米多孔电极表现出优异的抗污染性能，这使它们在生物医学测试等体内应用中具有独特优势。本研究为进一步探索纳米多孔电极平台在检测多种生物标志物方面的应用奠定了基础，有望扩展其在复杂疾病早期诊断中的实用性，从而推动精准医疗策略的发展。

部分摘录

化学试剂和仪器

HCl、AA、普鲁卡因、ATP、ADE、氯化钠、氯化镁、6-巯基-1-己醇（MCH）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和硝酸钾均购自Sigma-Aldrich。用亚甲蓝（MB）标记的适配体序列来自Sangon Biotech（上海，中国）。普鲁卡因适配体[24]：5′–HS–HS-AGA CAA GGA AAA TCC TTC AAT GAA GTG GGT CT-MB-3′，组装缓冲液：pH=7.0，10 mM PBS，1.0 mM NaCl，1.0 mM MgCl₂，工作缓冲液：pH=7.4，10 mM Tris，

粗糙金电极的制备

在金电极的电化学粗糙化过程中，电极表面会发生一系列阳极和阴极反应。在本研究中，粗糙化是在含有0.5 M AA和0.07 M HCl的水溶液中进行的。Cl^?的存在促进了通过形成稳定的AuCl₄^?复合物来促进金的阳极溶解[30]，而AA作为温和的还原剂有助于将AuCl₄^?还原为金属金[31]。整个过程可以描述为

结论

本文开发了一种绿色的电极修饰方法，可以快速简便地制备出经过适配体修饰的多孔金电极，从而构建出用于小分子检测的灵敏EAB传感器。与光滑电极相比，粗糙金电极具有更大的电活性面积、更高效的电子转移以及更好的抗污染性能和稳定性。利用这些优势，该传感器能够实现快速、高特异性和灵敏的检测

CRediT作者贡献声明

谢宇：概念构思、数据整理、形式分析、研究、资源获取、初稿撰写。赖金豪：数据整理、验证、撰写——审阅与编辑。严曦：形式分析、方法学设计、撰写——审阅与编辑。卡莱·萨尔米宁：概念构思、方法学设计、可视化、撰写——审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国际青年科学家研究基金（国家自然科学基金，资助编号：22050410273）、江西省早期职业青年科技人才培养项目（资助编号：20244BCE52244）、江西省教育厅的科学技术研究项目（资助编号：GJJ2501510）、江西省生物入侵与生物安全重点实验室（资助编号：2023SSY02111）的支持