《Synthetic and Systems Biotechnology》：The PreKit platform: Cryptic gene clusters activation and high-titer compound production
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通过生物合成基因簇（BGCs）的基因组挖掘发现新型支架化合物或酶是药物开发的基石。然而，一个主要障碍是大多数编码次级代谢物的微生物BGC在标准实验室条件下保持沉默。虽然启动子工程结合异源表达已成为激活这些沉默BGC的主流策略，但其效率往往受到宿主选择、启动子强
通过生物合成基因簇（BGCs）的基因组挖掘发现新型支架化合物或酶是药物开发的基石。然而，一个主要障碍是大多数编码次级代谢物的微生物BGC在标准实验室条件下保持沉默。虽然启动子工程结合异源表达已成为激活这些沉默BGC的主流策略，但其效率往往受到宿主选择、启动子强度和培养基等关键因子之间固有不兼容性的限制。为克服这一问题，研究人员开发了一个整合了启动子文库与基于indC的报告系统的简化平台。该平台实现了跨不同培养基条件和不同异源宿主的组合筛选，系统解决了多因子不兼容问题。基于此策略，研究人员进一步开发了即插即用启动子工具包，成功应用于激活一个沉默的II型聚酮合酶（PKS）基因簇（spa），从而产生了一种新的芳香聚酮化合物strepanthene A（1a）和streptoketide C（1b）。此外，通过将非羧化丙二酰辅酶A（NCM）途径整合到含有attPTG1位点特异性整合系统的S. lividans LJ1018中，实现了化合物1a和1b滴度的分别3.6倍和3.3倍增长。总之，这项工作提供了一种通用且高效的策略用于激活沉默BGC并提高代谢产物产量。生物活性评估显示，新化合物1a对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和粪肠球菌（E. faecalis）表现出抗菌活性，对两种菌株的最小抑菌浓度（MIC）值均为4 μg mL?1。
论文解读：PreKit平台实现隐秘基因簇激活与高滴度天然产物合成
研究背景与意义
微生物天然产物因其广泛的生物活性在药物开发中占据重要地位。随着全基因组测序技术的发展，研究人员通过生物信息学平台（如antiSMASH）能够精确识别微生物基因组中编码非核糖体肽合成酶（NRPS）、聚酮合酶（PKS）等的生物合成基因簇（BGC）。然而，绝大多数微生物BGC在常规实验室条件下处于转录沉默状态，这构成了天然产物发现的主要瓶颈。尽管异源表达被认为是激活沉默BGC的有效手段，但其成功率受到宿主遗传背景、启动子强度及培养基配方等多因子间固有不相容性的严重制约，导致代谢物产量低下甚至表达失败。因此，开发一种能够系统性解决这些兼容性问题的标准化平台具有重要的科学意义和应用价值。该研究由上海交通大学等单位的研究人员完成，成果发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》。
关键技术方法
研究人员构建了PreKit（启动子和报告基因引导的异源宿主发酵培养基试剂盒）平台，其核心是利用基于indC的报告基因系统量化评估启动子在不同宿主和培养基中的活性。在此基础上，开发了模块化的即插即用单向/双向启动子盒工具包，用于重构目标BGC。研究选取海绵共生菌Streptomyces sp. S52B中的沉默II型PKS基因簇spa作为模型靶点。为了提升产物滴度，研究人员利用attPTG1位点特异性整合系统，将非羧化丙二酰辅酶A（NCM）途径引入底盘菌株S. lividans LJ1018中，以增加关键前体供应。最终，通过高效液相色谱（HPLC）和液质联用（LC-MS）分析代谢产物，并结合核磁共振（NMR）鉴定化合物结构。
研究结果
3.1. 启动子和报告基因引导的异源宿主发酵培养基试剂盒（PreKit）
研究人员建立了PreKit平台以解决宿主、启动子和培养基之间的兼容性难题。利用indC报告系统，研究人员在四种不同的链霉菌宿主（S. albidoflavus J1074, S. coelicolor M1154, S. lividans GX28, S. lividans LJ1018）和超过20种优化培养基中进行组合筛选。结果显示，宿主-stnY/sp44启动子-CM1培养基的组合能产生最深且干扰最小的靛蓝色素，表明该组合具有最佳的转录活性，被确立为后续异源表达的首选条件。
3.2. 模块化、即插即用的单向和双向启动子盒
基于PreKit筛选出的最优启动子（stnY和sp44），研究人员构建了一系列带有不同抗性标记（红霉素、庆大霉素、壮观霉素）的模块化启动子盒。这些启动子盒可以通过PCR靶向技术插入BGC的双向或单向转录单元中，并通过FLP重组酶介导的切除或SwaI酶切去除抗性标记，形成最终的BAC+Bid（双向）或BAC+Uni（单向）构建体。这种设计允许在未来应用中灵活迭代引入更强或替代性启动子。
3.3. 从计算机预测到实验激活尝试：靶向Streptomyces sp. S52B中的天然产物BGC
研究人员对海洋来源的Streptomyces sp. S52B进行了全基因组分析，预测了多个BGC。尽管尝试了OSMAC策略、过表达PPT酶、过表达正调控基因以及异源表达等多种传统方法，均未能有效激活除已知amm基因簇以外的沉默BGC，凸显了开发PreKit平台的必要性。
3.4. PreKit平台证明能够激活沉默的spa基因簇
利用PreKit平台和即插即用启动子工具包，研究人员成功重构并激活了S52B中的沉默spa BGC。在最优组合LJ1018宿主和CM1培养基中，检测到了两种新的芳香聚酮类化合物strepanthene A（1a）和streptoketide C（1b）。进一步的培养基筛选发现，CM4培养基仅产1a，而CM5仅产1b，表明培养基成分能严格调控分支点的代谢流向。通过大规模发酵（45L）分离纯化并结合核磁分析确证了结构。生物活性测试表明，化合物1a对革兰氏阳性菌S. aureus和E. faecalis具有中等强度的抗菌活性（MIC = 4 μg mL?1）。
3.5. 非羧化丙二酰辅酶A（NCM）底盘宿主工程提高产物滴度
针对芳香聚酮生物合成受限于前体丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）供应的问题，研究人员在LJ1018底盘菌株中引入了NCM途径。通过比较不同启动子驱动的NCM途径（NCMzy1含kasOp*/SPL42，NCMzy2含stnY/sp44），发现NCMzy2能显著提高细胞内malonyl-CoA的积累量。相应地，该工程菌株使得化合物1a和1b的滴度分别提高了3.6倍和3.3倍，证明了增强前体供应与优化BGC表达之间存在显著的协同效应。
结论与讨论
该研究首次提出了一种系统性的PreKit平台，用于筛选和优化异源宿主、启动子和培养基的组合。通过该平台，研究人员成功激活了Streptomyces sp. S52B中沉默的spa BGC，并鉴定了两种具有抗菌活性的新芳香聚酮。随后，通过NCM途径重构底盘宿主，显著提升了目标产物的产量。与传统试错法相比，PreKit平台通过整合启动子、宿主和培养基三个维度的组合筛选，大幅降低了因选择次优条件导致的表达失败风险，简化了工作流程。这项研究不仅为激活沉默生物合成基因簇提供了强有力的工具包，也为其他类型天然产物（如NRPS、生物碱等）的挖掘与高产奠定了技术基础。
