莱姆神经伯氏疏螺旋体病的代谢组学研究：通过检测脑脊液寻找诊断线索

《Ticks and Tick-borne Diseases》：Metabolomic insights into Lyme neuroborreliosis: Exploring cerebrospinal fluid for diagnostic clues

　　伊拉里·库库宁（Ilari Kuukkanen）、安努卡·皮耶蒂凯宁（Annukka Pietik?inen）、蒂亚·里萨宁（Tiia Rissanen）、赛雅·胡尔梅（Saija Hurme）、埃莉萨·科尔特拉（Elisa Kortela）、尤卡·希托宁（Jukka Hyt?nen）、玛里特·卡罗宁（Maarit Karonen）
芬兰图尔库大学化学系

**摘要**
莱姆神经伯氏疏螺旋体病（Lyme Neuroborreliosis, LNB）是莱姆伯氏疏螺旋体病（Lyme Borreliosis, LB）的扩散性表现形式，当伯氏疏螺旋体宽谱型（Borrelia burgdorferi sensu lato, Bbsl）在宿主体内扩散并损害周围神经系统及脑膜时发生；在极少数情况下，还会影响中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）的实质组织。虽然早期LB可以通过临床诊断，但LNB的准确诊断需要通过脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）分析来确定，该分析需显示细胞增多症以及Bbsl特异性抗体的鞘内合成。然而，目前的LNB诊断方法存在局限性，例如细胞增多症的非特异性以及治疗后鞘内抗体的持续存在，这促使人们寻找新的生物标志物。

在这项研究中，我们采用了超高效液相色谱与串联质谱联用技术（UHPLC-MS/MS），对确诊为急性LNB的受试者的脑脊液样本中的小分子代谢物（<1500 Da）进行了分析。我们对治疗前受试者样本（n = 63）与以下几组进行了代谢物谱的比较：（A）治疗开始三周后从同一受试者处采集的样本子集（n = 36）；（B）Bbsl抗体阴性的受试者（非LNB，n = 61）；（C）其他中枢神经系统感染的受试者（n = 21）。此外，还比较了有根性神经炎的受试者（n = 40）与无根性神经炎的受试者（n = 23）的代谢物谱（D）。

在检测到的4222个分子特征（Molecular Features, MFs）中，基于统计显著性和变化幅度，选出了131个特征进行进一步的结构表征。发生变化的代谢物类别包括溶血磷脂类（如溶血磷脂酰胆碱（16:0）和溶血磷脂酰乙醇胺（18:0））、鞘磷脂类（如鞘磷脂（d18:1/14:0）和鞘磷脂d16:1/16:0）、鞘氨醇类（如d19:0鞘氨醇和3-酮基鞘氨醇）、脂肪酸酰胺类（如棕榈油酰胺和油酰胺）、环状磷脂酸类（如环状磷脂酸（16:0）和环状磷脂酸（18:2），以及氨基酸代谢物（如DL-谷氨酰胺、5-羟色氨酸和DL-犬尿氨酸）。

这些发现强调了脑脊液代谢组学作为诊断LNB及其与其他中枢神经系统疾病区分的强大辅助工具的潜力。所识别的代谢特征为未来生物标志物的开发奠定了基础，可能提高诊断精度，指导治疗策略，并加深我们对LNB发病机制的理解。

**1. 引言**
莱姆神经伯氏疏螺旋体病（LNB）是莱姆伯氏疏螺旋体病（LB）的扩散性表现形式，是欧洲和北美最常见的蜱传人畜共患病。LB由伯氏疏螺旋体宽谱型（Bbsl）复合体中的螺旋体引起，通过受Bbsl感染的硬蜱叮咬传播（Steere等人，2016年）。在LNB中，Bbsl通常在暴露后几周内就开始影响神经系统（Koedel等人，2015年；Stanek等人，2011年）。早期LB通常表现为红斑疹（erythema migrans），标志着局部感染阶段。相比之下，早期扩散性LNB可能出现淋巴细胞性脑膜炎、颅神经病变和根性神经炎等症状，这些症状统称为Garin-Bujadoux-Bannwarth综合征（Steere等人，2016年）。虽然红斑疹主要通过临床诊断，但扩散性LNB需要实验室确认。血清和脑脊液中Bbsl特异性抗体的血清学检测是LB和LNB诊断的基石（Branda和Steere，2021年；Kullberg等人，2020年）。LNB的确诊需要脑脊液细胞增多症的证据、Bbsl特异性抗体的鞘内合成以及相应的神经系统症状（Branda和Steere，2021年；Kullberg等人，2020年；Mygland等人，2010年）。然而，抗体可能需要几周时间才能在脑脊液中检测到，而且血清学检测在区分活动性感染和既往感染方面效果有限，因为患者可能在疾病痊愈后仍保持血清阳性（Hammers-Berggren等人，1993年；Kalish等人，2001年）。此外，由于其他感染的交叉反应性抗体可能导致假阳性结果（Gr??lewska和Holec-G?sior，2023年；Wojciechowska-Koszko等人，2022年）。因此，需要额外的生物标志物来克服当前LNB实验室方法的诊断和随访限制。

CXCL13（C-X-C基序趋化因子配体13）已被证明是急性、未经治疗的LNB的一个有前景的脑脊液生物标志物（Hyt?nen等人，2014年；Pietik?inen等人，2018年；Wai?等人，2024年）。这种趋化因子可引导B细胞迁移，在早期感染期间迅速升高，先于Bbsl特异性抗体的产生，并在有效抗菌治疗后迅速下降（Cyster等人，2000年；Gunn等人，1998年；Rupprecht等人，2008年；Schmidt等人，2011年）。这些动态特性使CXCL13成为血清学检测不明确时的有价值的早期指标。然而，CXCL13缺乏疾病特异性，应与其他诊断标准结合使用（Smí?ková等人，2023年）。

在这项研究中，我们应用了基于代谢组学的超高效液相色谱（UHPLC）与串联质谱（MS/MS）联用技术。这种高通量分析方法旨在检测和鉴定急性LNB受试者（治疗前及抗生素治疗开始三周后）的脑脊液样本中的小分子代谢物，以及年龄和性别匹配的非LNB对照组受试者的样本，以及其他中枢神经系统感染的受试者的样本。我们的目标是识别LNB特异性的脑脊液代谢特征，以提高诊断精度并便于不同受试者组之间的区分。

**2. 材料与方法**
2.1. 化学试剂
分析级乙醇和甲醇以及LC-MS级甲酸购自VWR International（法国巴黎Fontenay-Sous-Bois）。LC-MS级乙腈由Fisher Scientific（英国莱斯特郡Loughborough）提供。氘代标准品（包括DL-苯基-d5-丙氨酸和l-色氨酸-(吲哚-d5)）来自Cambridge Isotope Laboratories Inc.（美国马萨诸塞州Andover）。参考标准品乙酰-DL-肉碱、LysoPC(15:0)、LysoPC(17:0)、LysoPC(18:1)、DL-犬尿氨酸购自Sigma-Aldrich International GmbH（瑞士Buchs）。此外，(R)-2-羟基-3-(棕榈酰氧)丙基(2-(三甲氨)乙基)磷酸盐和(2S,3R, E)-3-羟基-2-棕榈酰胺-octadec-4-烯-1-yl(2-(三甲氨)乙基)磷酸盐购自BLD Pharmatech GmbH（德国Reinbek）。超纯I型水使用Merck Millipore Synergy UV系统制备。

2.2. 脑脊液样本
确诊为急性LNB的受试者的脑脊液样本最初作为我们先前发表的LNB治疗研究的一部分收集，该研究比较了静脉注射头孢曲松和口服多西环素在治疗LNB中的效果（Kortela等人，2021年）。在本研究中，我们分析了根据欧洲神经病学联合会（EFNS）标准（Mygland等人，2010年）被诊断为急性LNB的受试者的脑脊液样本。共有63名受试者的脑脊液样本可供分析。这些样本是在诊断时、抗生素治疗开始前采集的。其中，LNB受试者中19人为女性（30%），44人为男性（70%）。LNB受试者的中位年龄为58岁（范围：18至79岁）。40名受试者患有根性神经炎，23名未患此病。更详细的受试者特征见表1。此外，在一个亚组（n = 36）中，对于治疗前脑脊液样本中白细胞计数≥50/μL的受试者，在治疗开始三周后再次采集了脑脊液样本（根据原始研究方案Kortela等人，2021年）。其中，22名受试者接受了口服多西环素治疗，14名接受了静脉注射头孢曲松治疗。

**表1. 不同受试组脑脊液样本的基线特征**
研究包括四组：确诊为急性LNB的治疗前组；抗生素治疗开始三周后的LNB组（与治疗前组为同一批受试者）；Bbsl抗体阴性的对照组（非LNB），按年龄和性别与LNB受试者匹配；以及其他中枢神经系统（CNS）感染组：蜱传脑炎（TBE）、单纯疱疹病毒（HSV）和水痘-带状疱疹病毒（VZV）。对于LNB亚组，记录了抗生素的给药方式（静脉注射头孢曲松或口服多西环素）。LNB受试者的脑脊液白细胞计数和CXCL13浓度数据齐全。根性神经炎表示治疗前LNB受试者中该症状的存在/缺失情况。所有组的脑脊液均在治疗前采集，除了抗生素治疗开始三周后的LNB亚组。分类变量以n（%）表示，连续变量以中位数（范围）表示。

**表1. 不同受试组的脑脊液样本特征**
| 受试组 | 女性（n） | 男性（n） | 年龄（岁） | 抗生素治疗 | 脑脊液白细胞计数（细胞/μL） | CXCL13浓度（pg/μL） |
|---------------|--------|--------|---------|-----------------|-----------------|
| 治疗前LNB | 19 | 44 | 61 (18 - 75) | **6** | 204 (5 - 530) | 3400 (0 - 42,364) |
| 治疗后LNB | 13 | 24 | 44 | **24** | 17 (0 - 675,000) | 109 (7 - 318) |
| 非LNB对照组 | 13 | 23 | 43 | 61 (31 - 75) | 80 (7 - 985) | 4517 (0 - 675,000) |
| 其他CNS感染 | 4 | 21 | 19 | 4 | 3 (30%) | 3 (30%) |
| 根性神经炎 | 15 | 19 | 25 | 79% | 25 (57%) | |

*抗生素治疗：**头孢曲松**表示静脉注射，***多西环素**表示口服
**注：**在LNB治疗前阶段，患者尚未接受抗生素治疗，因此相关数据缺失。
所有对照组样本均作为常规诊断程序的一部分在治疗开始前采集。非LNB脑脊液样本（n = 61；与LNB受试者年龄和性别匹配）来自临床怀疑患有LNB但脑脊液中未检测到Bbsl特异性抗体的受试者，且这些受试者的血清中也未检测到Bbsl抗体（使用内部全细胞抗原制备的EIA测试，Viljanen和Punnonen，1989年）。另外，还有2名急性LNB受试者没有对应的非LNB对照组进行比较。

还包括其他实验室确诊的中枢神经系统感染受试者的脑脊液样本（n = 21）：蜱传脑炎（TBE，n = 9）、单纯疱疹病毒（HSV，n = 6）和水痘-带状疱疹病毒（VZV，n = 6）。TBE样本的脑脊液IgM阳性，血清IgM和IgG均阳性（n = 6）；TBE仅脑脊液IgM阳性（n = 1）或血清IgM和IgG均阳性（n = 2），通过酶联免疫吸附测定法分析（Reagena，芬兰Toivala）。HSV和VZV脑脊液样本通过PCR检测呈阳性（内部PCR方法）。样本采集后，所有临床脑脊液均储存在-20°C的冷冻柜中。

所有参与LNB治疗的受试者均签署了知情同意书，研究获得了芬兰国家医学研究伦理委员会的批准。本研究遵循了《赫尔辛基宣言》中关于涉及人类材料和数据研究的伦理原则。所有样本均进行了编码处理以确保受试者匿名。研究获得了芬兰西南部卫生区的许可（许可编号T012/004/19）。

2.3. 样本制备与分析流程
样本制备方案参考了我们之前的研究（Kuukkanen等人，2025年）。本研究中使用的脑脊液样本体积为50 μL。由于原始方案针对150 μL血清优化，因此对试剂体积和预处理步骤进行了比例调整，以确保与较低的脑脊液样本体积兼容。所有处理步骤（包括大分子沉淀）均按比例进行，同时保持溶剂和内标的相对比例，以保证样本间的分析一致性。

2.4. UHPLC-QOrbitrap-MS/MS分析、计算机代谢组学、分子特征鉴定及代谢组富集分析
UHPLC-QOrbitrap-MS/MS分析、计算机代谢组学、从原始数据中检测分子特征（MF），以及使用内标进行的数据标准化（基于MS数据中APAP及其代谢物的检测），均按照之前的方法进行（Kuukkanen等人，2025年）。MF分类遵循相同的标准（Kuukkanen等人，2025年），MF鉴定采用五级系统（Schymanski等人，2014年），基于代谢组学标准倡议（MSI）的最低报告标准（Sumner等人，2007年）。在该系统中，一级表示使用参考标准确认的结构鉴定；二级基于MS/MS光谱与文献或数据库的匹配进行临时注释；三级表示由分子式和片段信息支持的临时候选结构；四级仅通过分子式进行鉴定（包括同位素模式、加合物形成和电荷状态）；五级为未分类但具有独特质谱特征的分子。

为了更好地理解观察到的代谢组学和分子途径变化之间的联系，使用了MetaboAnalyst平台版本6.0（Pang等人，2024）进行了代谢组富集（MSE）途径分析（Lu等人，2023），结合了代谢组途径关系数据库（RaMP-DB）（Braisted等人，2023），该数据库通过人类代谢组数据库（HMDB，Wishart等人，2022）与京都基因组和基因组百科全书（Kanehisa等人，2025）以及REactome（Jassal等人，2019）和WikiPathways（Slenter等人，2018）集成。RaMP-DB代谢组集至少包含三个条目。MSE分析是针对那些具有阳性HMDB鉴定结果的最显著和特征明确的特征子集进行的。2.5 统计分析统计分析分别针对三个主要比较进行了进行：(A) 治疗前LNB脑脊液样本与治疗开始后三周的LNB脑脊液样本之间的比较，(B) 治疗前LNB脑脊液样本与年龄和性别匹配的非LNB对照样本之间的比较，(C) 治疗前LNB脑脊液样本与其他中枢神经系统(CNS)感染的脑脊液样本之间的比较。比较A和B涉及配对观测，因此使用Wilcoxon符号秩检验进行。比较C基于独立样本，使用Wilcoxon秩和检验进行评估。由于分布的非正态性，采用了非参数方法。所有代谢物特征(MFs)都进行了差异检验。在两个数据集中都统计显著（显著性水平为0.001）的MFs被进一步仔细检查，并通过火山图进行了可视化。对于这些最显著的MFs，进行了多变量模型分析以评估患者特征的影响。在比较A和B中，使用复合对称协方差结构进行了重复测量的线性混合模型分析。为了满足MFs的正态分布假设，使用了对数转换。在比较A中，模型包括一个within-factor（时间点：治疗前、治疗后三周）和几个between-factor（年龄、性别、脑脊液白细胞计数、APAP的使用、CFS CXCL13浓度）。在比较B中，模型包括一个within-factor（匹配对：治疗前样本和年龄及性别匹配的对照）和三个between-factor（年龄、性别、APAP的使用）。在比较C中，使用了线性回归模型，模型包括三个解释变量（年龄、性别、APAP的使用）。此外，还进行了亚组分析，以比较有和没有神经根炎的LNB患者的脑脊液样本（比较D）。使用与比较C相同的分析方法研究了有和没有神经根炎的LNB患者在所有MFs中的差异。变量的正态性通过视觉检查并用Shapiro-Wilk检验进行了验证。检验为双侧检验，显著性水平设定为0.05。分析是使用RStudio（版本2024.09.1 Build 394）基于R（版本4.4.3；RStudio，PBC，波士顿，MA，美国）进行的。3. 结果在脑脊液样本中检测到了总共4222个MFs。在比较A、B和C中，选择了统计上最显著的MFs（p < 0.001）进行进一步评估。在比较D中，应用了p < 0.05的显著性阈值。线性混合模型被用来评估患者特征对个别MFs的影响（p < 0.05），包括患者组、年龄、性别、治疗中心、脑脊液白细胞计数、脑脊液CXCL13浓度以及基于MS数据中APAP及其代谢物的检测结果。并非所有特定于患者的变量在所有四个比较A-D中都可用。图1展示了集成工作流程的概览。下载：下载高分辨率图像（517KB）下载：下载全尺寸图像图1. 脑脊液(CSF)样本处理和分子特征(MF)分析的集成工作流程，包括样本预处理、超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)分析、基于MF检测的计算机代谢组学、统计比较A-D、随后的MF识别和分类以及代谢物集富集(MSE)分析，详见图（图2、图3、图4、图5）和表格（表2和补充信息表S1-S2）。主要的统计比较包括：(A) 治疗前的莱姆神经伯氏疏螺旋体病(LNB)样本与抗生素治疗开始后三周收集的样本；(B) 治疗前的LNB样本与年龄和性别匹配的伯氏疏螺旋体广义抗体阴性(非LNB)对照样本；(C) 治疗前的LNB样本与其他中枢神经系统(CNS)感染的脑脊液样本，包括蜱传脑炎(TBE)、单纯疱疹病毒(HSV)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)；(D) 有和没有神经根炎的LNB患者的脑脊液样本。根据效应大小进一步筛选了选定的MFs，阈值设为五倍的中位数变化和峰面积中位数差异超过5 × 10?（计数×秒）。在比较D中，使用了更宽松的阈值（p < 0.05），以及三倍的中位数变化和最小的峰面积差异3 × 10?（计数×秒）。应用这些标准后，有131个MFs被优先用于结构表征（补充表S1）。补充表S2详细列出了各比较中显著MFs的分布。3.1. 比较A：治疗前和治疗开始后三周收集的脑脊液样本成对统计比较（n = 36）发现977个MFs在比较治疗前急性LNB患者的脑脊液样本与其治疗开始后三周收集的相应样本之间存在统计显著差异（p < 0.001）。在这些MFs中，根据调整相关患者特征（包括患者组、年龄、性别、脑脊液白细胞计数、CXCL13浓度和APAP的使用）后，有60个MFs被选为进一步评估。经过计算机代谢组学分析后的结构表征和去除分子重复后，剩下52个MFs，其中包括7个来自药物的MFs。这些特征显示了上调和下调的代谢物，在火山图（图2A）和热图（图3A）中展示。详细的MF注释可在补充表S1中找到。下载：下载高分辨率图像（487KB）下载：下载全尺寸图像图2. 四个主要比较A-D中显著分子特征(MF)中位数峰面积的火山图。红色表示MF峰面积显著减少（反映MF浓度降低），而蓝色表示显著增加（反映MF浓度升高）。(A) 比较A：在抗生素治疗前的急性莱姆神经伯氏疏螺旋体病(LNB)患者的脑脊液样本（参考）与治疗开始后三周的样本之间，共有977个MFs发生了显著变化（p < 0.001）；其中最显著的52个MFs被突出显示。(B) 比较B：治疗前LNB患者的脑脊液样本（参考）与年龄和性别匹配的伯氏疏螺旋体广义抗体阴性(非LNB)对照样本之间，共有1421个MFs发生了显著变化（p < 0.001）；其中最显著的87个MFs被突出显示。(C) 比较C：治疗前LNB患者的脑脊液样本（参考）与其他中枢神经系统(CNS)感染（包括蜱传脑炎(TBE)、单纯疱疹病毒(HSV)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)患者的脑脊液样本之间，共有596个MFs发生了显著变化（p < 0.001）；其中最显著的21个MFs被突出显示。(D) 比较D：有和没有神经根炎的LNB患者的脑脊液样本之间，共有97个MFs发生了显著变化（p < 0.05）；其中最显著的3个MFs被突出显示。下载：下载高分辨率图像（3MB）下载：下载全尺寸图像图3. 主要比较中各个患者个体之间显著分子特征(MF)峰面积的热图面板：(A) 治疗前的莱姆神经伯氏疏螺旋体病(LNB)样本与抗生素治疗开始后三周收集的样本；(B) 治疗前的LNB样本与年龄和性别匹配的伯氏疏螺旋体广义抗体阴性(非LNB)对照样本；(C) 治疗前的LNB样本与其他中枢神经系统(CNS)感染（包括蜱传脑炎(TBE)、单纯疱疹病毒(HSV)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)患者的脑脊液样本；(D) 有和没有神经根炎的LNB患者的脑脊液样本。在每个热图中，x轴代表单个脑脊液样本，顶部根据患者组分布指示了特定的比较类别。y轴代表特定于比较的MFs。使用颜色渐变来可视化标准化峰面积，红色表示较高的MF峰面积，蓝色表示较低的峰面积。没有一个MF受到所有选定变量的影响。通过比较治疗前LNB患者和使用口服多西环素或静脉注射头孢曲松的患者，分析了估计的患者组效应，发现15个MFs存在显著差异。多西环素（MF2938）、多西环素的来源MS片段离子（MF2978）和多西环素的代谢产物（MF2235）被排除在分析之外，因为多西环素在治疗开始后三周的样本中显著上调。除了这些被排除的MFs外，在比较A中未观察到多西环素的总体统计显著效应。头孢曲松不在显著MFs之列。在包括的特征中，估计的患者组效应的中位数为71.03%（范围：1.01%至92.44%），在治疗前LNB患者样本中更高。值得注意的是，患者组本身并不能独立解释任何MF的变化。患者年龄显著影响了40个MFs，中位数估计效应为5.66%（范围：1.59%至14.75%）。年龄本身解释了其中14个特征的变化。最明显的年龄相关效应出现在在较晚保留时间洗脱的亲脂性化合物中。患者性别对五个MFs有统计学上的显著影响，男性相比女性的中位数估计效应为-51.53%（范围：-51.53%至-85.56%）。这一发现表明这些特征的调节或表达可能存在性别特异性影响。在这些特征中，年龄本身解释了一个MF（MF3545）的变化，其估计效应为-85.56%。CXCL13是LNB的脑脊液生物标志物，也是已建立的诊断标志物（Hyt?nen等人，2014年；Wai?等人，2024年），作为连续变量建模，显著影响了19个MFs。其中一个特征（MF1437），被鉴定为APAP-葡萄糖醛酸的钠加合物离子，被从该组中排除。然而，模型中的中位数估计效应为CXCL13每单位增加1%导致MF变化0.0064%（95%置信区间范围：0.0053%至0.0071%）。此外，CXCL13并不能独立解释任何单个MF的变化。大多数受影响的特征被归类为亲脂性化合物。与非使用者相比，APAP使用者（从UHPLC-MS/MS数据中识别）在六个MFs中显示出显著变化，其中中位数估计效应增加了99.35%（范围：45.11%至99.91%）。其中五个MFs直接被鉴定为APAP相关的代谢物（MF1437、MF1441、MF1442、MF1456）。一个未鉴定的MF显示出45.11%的效应。3.2. 比较B：治疗前LNB患者的脑脊液样本与Bbsl抗体阴性的非LNB对照样本共有1421个MFs在统计分析的61个成对比较中显示出与年龄和性别匹配的非LNB对照样本之间的统计显著差异（p < 0.001）。在这些MFs中，根据相关患者特征（患者组、性别和APAP使用）的评估后，有94个MFs被选为进一步评估。经过计算机代谢组学分析后的结构表征和去除分子重复后，剩下87个MFs。没有一个MF受到所有包含变量的影响。这些特征在火山图（图2B）和热图（图3B）中展示。详细注释和特征描述在补充表S1中提供。基于成对统计比较（n = 61），非LNB患者与治疗前LNB患者的中位数估计患者组效应为-89.13%（范围：92.44%至400.17%）。值得注意的是，在非LNB患者中有两个特征显著上调：MF749，暂时鉴定为DL-谷氨酰胺（估计效应：306.87%）；MF1690，一种潜在的次黄嘌呤衍生物（估计效应：400.17%）。患者组本身解释了55个MF的变化。患者年龄是27个MF的统计显著因素，中位数估计效应为2.96%（范围：0.95%至6.73%）。患者性别与四个MF显著相关，所有这些MF都被归类为脂质，并且在男性中显示出中位数估计效应为-67.44%（范围：-72.87%至-61.36%）。APAP的使用也被评估，并发现显著影响了七个MFs，中位数估计效应为-36.64%（范围：50.92%至-30.03%），在非LNB患者与治疗前LNB患者之间。这些七个MF中没有一个是APAP、其已知代谢物或相关质谱片段或加合物离子。此外，这些MF还受到患者组和患者年龄的影响。这种重叠很可能反映了代谢组谱中的疾病相关改变以及像APAP这样的常见药物的潜在调节作用。3.3. 比较C：治疗前LNB患者的脑脊液样本与其他中枢神经系统(CNS)感染患者的脑脊液样本独立统计比较（n = 84）对治疗前急性LNB患者（n = 63）和其他实验室确认的CNS感染患者（n = 21）的脑脊液样本进行了比较，发现了596个具有统计显著差异的MFs（p < 0.001）。为了进一步评估个体变异性，分析了MFs与患者特征（组、年龄、性别和APAP使用）之间的关联。在35个MFs中，有21个MFs根据统计显著性以及它们的中位数倍数变化和峰面积变化被选为详细研究。没有一个MF受到所有选定研究变量的影响。这些特征在火山图（图2C）和热图（图3C）中呈现。关于这些代谢物的更详细信息可以在补充表S1中找到。不同受试者组之间的比较仅显示了四个代谢物的显著差异，所有这些差异都仅受受试者组的影响。其他中枢神经系统（CNS）感染的受试者与治疗前LNB受试者相比，中位估计的组效应为-76.40%（范围：77.86%至716.34%）。其中三个特征在结构上相关，可能来源于一个共同的前体离子，即MF894（估计效应：77.86%）、其假定的产物离子MF896（估计效应：75.76%）和MF895（估计效应：77.04%）。第四个代谢物MF977通过参考标准乙酰肉碱得到确认，在其他CNS感染受试者中的估计效应高出715.34%。受试者年龄显著影响了两个代谢物（排除了五个与急性酒精性胰腺炎（APAP）直接相关的代谢物），中位估计效应为-5.70%（范围：6.07%至-5.34%）。这些特征仅受年龄影响。受试者性别与选定的任何代谢物均无显著关联。相比之下，APAP的使用与15个代谢物的变化相关，所有这些代谢物都被确定为与APAP直接相关的代谢物。在非使用者中，与APAP使用者相比，中位估计效应显著降低了99.63%（范围：99.95%至-93.51%）。在这项比较中，六个代谢物仍然是突出的生物标志物，其中没有一个与药物有关。

3.4. 比较D：治疗前LNB脑脊液样本与有无神经根炎的样本
独立统计比较（n = 63）在有无报告神经根炎的LNB受试者（n = 40）之间进行（n = 23）。对于这项分析，应用了0.05的显著性水平，确定了97个具有统计显著性的代谢物。进一步结合相关受试者特征（受试者组、年龄、性别、脑脊液白细胞计数、CXCL13浓度和估计的APAP使用情况），以及额外的筛选标准（中位数变化≥三倍和峰面积中位数变化超过3 × 10?（计数×秒）后，候选代谢物的数量减少到三个。这些选定的代谢物在火山图（图2D）和热图（图3D）中呈现。详细的代谢物特征在补充表S1中提供。比较D显示，与有无神经根炎的受试者相比，所有三个代谢物都存在显著关联，显示强烈的受试者组中位估计效应为117.63%（范围：102.85%至329.05%）。然而，这些特征并非仅由受试者组驱动。受试者年龄与MF3600显著相关，该代谢物暂时被鉴定为异丙醇胺肉豆蔻酸酯，估计效应为-4.37%。脑脊液白细胞计数（连续变量）也与MF617（估计效应：0.33%）和MF622（估计效应：0.30%）显著相关。受试者性别与CXCL13浓度或APAP使用情况无显著关联。

3.5. 在比较A-D中识别出的共有和独特的代谢物
为了总结所有四个比较的结果，我们评估了每个分析中识别出的重叠和独特的代谢物。这种综合交叉比较使得能够检测到在分析数据集中表现出一致且稳健变化的代谢物，同时也突出了各个比较中的独特特征。在4222个检测到的代谢物中，有141个显著的与非药物相关的代谢物在比较A-D中被识别。经过去重后，剩下112个非药物代谢物（83个独特和29个共有），如图4所示。此外，还识别出19个与药物直接相关的代谢物。在详细表征和统计评估之前，当同时考虑药物相关和非药物代谢物时，组合集包含131个代谢物，其中87个是独特的，44个在比较A-D中共有。

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图4. 脑脊液（CSF）中统计显著的非药物分子特征（MFs）在比较A-D中的交叉比较。比较定义如下：(A) 治疗前莱姆神经伯氏疏螺旋体病（LNB）脑脊液与开始抗生素治疗三周后收集的脑脊液；(B) 治疗前LNB脑脊液与年龄和性别匹配的伯氏疏螺旋体广谱抗体阴性（非LNB）对照脑脊液；(C) 治疗前LNB脑脊液与其他中枢神经系统（CNS）感染的脑脊液；(D) 有神经根炎的LNB受试者的脑脊液与无神经根炎的LNB受试者的脑脊液。在4222个检测到的代谢物中，最初优先考虑了141个显著的非药物候选代谢物（A: 45；B: 87；C: 6；D: 3）。经过跨比较去重后，剩下112个非药物代谢物（83个独特和29个共有）。直接与药物相关的代谢物从图中排除。面板区分了共有代谢物（在两个或更多比较中出现）、独特代谢物（在单个比较中出现）以及在统计显著代谢物中最突出的代谢物。

在所有四个比较中，没有一个代谢物（19个直接与药物相关的代谢物和112个非药物代谢物）在所有四个比较中都存在。比较A与比较B共有27个代谢物，与比较C共有1个代谢物，与比较D共有1个代谢物。在排除了与药物使用直接相关的特征（一个与APAP相关的和三个与多西环素相关的代谢物）后，比较A保留了45个相关代谢物，包括16个独特的和29个共有的特征。比较B与比较C和D没有共有任何代谢物，且不包括任何直接归因于药物使用的特征。因此，有60个代谢物被认为是特定于比较B的。然而，如前所述，其中八个代谢物受到估计的APAP使用的显著影响。对于比较C，在排除了与比较A共有的一个代谢物和17个被鉴定为直接APAP代谢物的特征后，剩下五个代谢物是特定于该比较的。比较D与比较A有一个重叠的代谢物，剩下两个代谢物是该比较特有的。

3.6. 代谢物谱型、结构阐明和富集途径变化
在基于精确质量和MS/MS光谱数据的体内代谢组学分析过程中，对4222个代谢物进行了自动预表征。这导致了1753个代谢物的初步识别，同时成功为3897个代谢物分配了分子式。经过统计评估和结构鉴定后，最终131个代谢物根据其精确质量、分子式（从精确质量推导）、MS/MS光谱模式、保留时间、数据库匹配、统计特性和行为进行了手动检查，并在可能的情况下与参考标准进行了比较。131个代谢物的分类分为五个主要类别：(I类) 脂质和脂质类型化合物代谢物（76个代谢物）；(II类) 其他已鉴定的内源性或外源性代谢物代谢物（27个代谢物）；(III类) 目前未鉴定的可能作为LNB潜在生物标志物的代谢物（6个代谢物）；(IV类) 与药物使用统计相关的代谢物或与药物使用相关的代谢物，同时这些变化也与感染过程有关（8个代谢物）；(V类) 直接来源于药物的代谢物（19个代谢物）。II类和III类中有五个代谢物在两个类别中都有。IV类中的两个代谢物和V类中的四个代谢物无法根据其精确质量分配分子式。

在最终的131个代谢物中，注释的信心根据评估的MSI水平而有所不同。共有七个代谢物被分配到MSI级别1，代表使用真实参考标准确认的结构鉴定。级别2包括52个代谢物，对应于基于MS/MS光谱与文献或数据库匹配的初步注释。级别3包括42个代谢物，其候选结构得到了分子式和MS/MS光谱信息的支持。级别4包括27个代谢物，对应于具有匹配分子式、同位素模式、可能的加成物形成和电荷状态的特征。最后，级别5包括3个代谢物，代表未分类但具有独特质量光谱特征的代谢物。所有131个代谢物的全面特征及其分类类别和MSI级别在补充表S1中呈现，而表2总结了49个特征的示例子集。

表2. 在脑脊液（CSF）中检测到的统计显著分子特征（MFs）的代表性子集。列表示代谢物、离子质量及相应的离子、分子式、初步鉴定、代谢组学标准倡议（MSI）鉴定级别以及基于鉴定的代谢物类别。
分子特征
离子质量
离子
分子式
初步鉴定
MSI*类别
MF3825
496.33968
[M + H]+C??H??NO?
PLysoPC(16:0)
1
IMF39
1052
2.35571
[M + H]+C??H??NO?
PLysoPC(18:1)
1
IMF42
1570
3.57445
[M + H]+C??H??N?O?
PSM(d18:1/16:0)
1
IMF157
1209.0921
8[M + H]+C??H??N?O?
DL-犬尿氨酸
1
IMF977
204.1231
7[M + H]+C?H??NO?
乙酰肉碱
1
II / IV
MF35
13288.28946
[M + H]+C??H??NO?
鞘氨醇C17异构体
2
IMF3680
316.32092
[M + H]+C??H??NO?
d19:0 鞘氨醇
2
IMF3705
468.30853
[M + H]+C??H??NO?
PLysoPC(14:0)
2
IMF3760
280.26334
[M + H]+C??H??NO?
亚油酰胺
2
IMF3785
520.33990
[M + H]+C??H??NO?
PLysoPC(18:2)
2
IMF3813
568.33972
[M + H]+C??H??NO?
PLysoPC(22:6)
2
IMF3874
482.36057
[M + H]+C??H??NO?
PLysoPC(O-16:0)
2
IMF3890
546.35547
[M + H]+C??H??NO?
PLysoPC(20:3)
2
IMF3896
480.34500
[M + H]+C??H??NO?
PLysoPC(P-16:0)
2
IMF3935
508.37635
[M + H]+C??H??NO?
PLysoPC(P-18:0)
2
IMF3942
228.23218
[M + H]+C??H??NO
肉豆蔻酰胺
2
IMF3948
572.37097
[M + H]+C??H??NO?
PLysoPC(22:4)
2
IMF3966
548.37110
[M + H]+C??H??NO?
PLysoPC(20:2)
2
IMF4019
550.38665
[M + H]+C??H??NO?
PLysoPC(20:1)
2
IMF4092
282.27902
[M + H]+C??H??NO
油酰胺
2
IMF410
3417.24002
[M + H]+C??H??O?
PcPA(18:2)
2
IMF4138
393.23975
[M + H]+C??H??O?
PcPA(16:0)
2
IMF4208
299.25800
[M + H]+C??H??O?
氧代十八烷酸
3
IMF91
2280.13882
[M + H]+C??H??NO?
果糖基缬氨酸
2
IMF1110
305.09775
[M + H]+C??H??N?O?
N-乙酰天冬氨酸
2
II / IV
IMF1325
221.09201
[M + H]+C??H??N?O?
5-羟色氨酸
2
II / IV
IMF3600
304.28445
[M + H]+C??H??NO?
异丙醇胺肉豆蔻酸酯
3
IMF3773
429.29990
[M + H]+C??H??O?
螺甾烷-3,6-二酮
3
IMF4000
237.22133
[M-NH3]+C??H??O
棕榈油酰胺片段
3
IMF4001
254.24773
[M + H]+C??H??NOpalmitoleamide
3
IMF4158
592.46985
[M + H]+C??H??NO?
PCerP(d14:0/18:0)
3
IMF4184
701.55886
[M + H]+C??H??N?O?
PSM(d18:1/16:1)
3
IMF41956
89.55860
[M + H]+C??H??N?O?
PSM(d18:1/15:0)
3
IMF1260
276.14404
[M + H]+C??H??NO?
谷氨酰肉碱
3
I
IMF1314
233.09191
[M + H]+C??H??N?O?
吲哚-3-乙酰甘氨酸
3
I
IMF1690
207.08774
[M + H]+C?H??N?O?
次黄嘌呤衍生物
3
I
IMF3276
254.13862
[M + H]+C??H??NO?
L-DOPA N-丁基酯
3
I
IMF6172
53.02943
[M + H]+C??H??Cl?N?
3,3-二氯苯肼
3
I
IMF7491
47.07629
[M + H]+C?H??N?O?
DL-谷氨酰胺
3
I
IMF9051
68.02919
[M + H]+C?H?NO?
喹啉酸
3
II / IV
MF4021
548.37958
[M + H]+C??H??N?O?
未分类的磷脂
4
IMF1088
312.11102
[M + H]+C??H??NO?
SN-(1-脱氧-1-果糖基)甲硫氨酸
4
I
IMF894
339.14096
[M + H]+C??H??N?O?
嘌呤核苷
4
I
IMF6222
31.04753
[M + H]+C??H??SO?
未鉴定
4
II
IMF742437.97220
[M + H]+C??H?N?O??
Sun鉴定
4
II
IMF8952
48.06425
[M + H]+C?H?N?O?
未鉴定
4
II
IMF2294这类代谢物（MFs）包括溶血磷脂（LysoPLs）、鞘脂、初级脂肪酸酰胺、环状磷脂酸（cPAs）以及其他与脂质相关的代谢物（见表2和补充表S1）。溶血磷脂是磷脂的单酰基衍生物，常见于脑脊液（CSF）中，参与膜重塑和细胞内信号传导途径（Choi和Chun，2013；Wepy等人，2019）。在本研究中，溶血磷脂被进一步分为溶血磷脂酰胆碱（LysoPCs）和溶血磷脂酰乙醇胺（LysoPEs）。?uczaj等人（2025）先前报告称，淋巴神经节病（LNB）患者的血浆中溶血磷脂酰胆碱水平显著改变，这种变化与磷脂酶A2活性和膜重塑有关，提示中枢神经系统（CNS）感染期间炎症反应增强。在本研究中，我们鉴定出相同的溶血磷脂酰胆碱分子MF3825和MF3781，它们是[LysoPC(16:0)]的异构体（Jiang等人，2023；Park等人，2020），以及MF3813，它是[LysoPC(22:6)]的异构体（Wu等人，2020b；Zhang等人，2023a），证实了它们在LNB相关代谢变化中的重要性。更广泛地说，溶血磷脂酰胆碱种类的紊乱已在多发性硬化症等神经炎症性疾病中得到报道，这也表明磷脂酶A2活性参与了膜重塑和炎症过程（Stoessel等人，2018）。在本研究中，我们鉴定出几种相同的溶血磷脂酰胆碱代谢物，包括MF3896 [LysoPC(P-16:0)]（Mohsenian Kouchaksaraee等人，2020）、MF3935 [LysoPC(P-18:0)]（Mohsenian Kouchaksaraee等人，2020）、MF3892 / MF3910 [LysoPC(18:1)]（Jiang等人，2023）、MF3933 [(2R)-2,8-二甲基-2-(4,8,12-三甲基十三-3,7,11-三烯基)-3,4-二氢色烯-6-醇]（Beretta等人，2018）、MF4011 [LysoPC(O-18:0)]（Mohsenian Kouchaksaraee等人，2020）、MF4013 [LysoPE(P-18:0)]（Wu等人，2020a）、MF4019 [LysoPC(20:1)]（Fu等人，2024）和MF3890 [LysoPC(20:3)]（Jiang等人，2023）。此外，Ren等人（2025）证明，在周围神经损伤后，血清、背根神经节和脑脊液中的溶血磷脂酰胆碱(18:1)水平升高。尽管针对LNB的直接脑脊液研究有限，但我们的发现表明溶血磷脂酰胆碱谱型的改变与LNB有关。这支持进一步研究其他已表征的溶血磷脂，如MF3705 [LysoPC(14:0)]（Jiang等人，2023）、MF3745 [LysoPC(16:1)]（Wu等人，2020b）、MF3757 [LysoPC(15:0)]（Jiang等人，2023）、MF3785 [LysoPC(18:2)]（Jiang等人，2023）、MF3799 [LysoPC(20:4)]（Jiang等人，2023）、MF3874 [LysoPC(O-16:0)]（Mohsenian Kouchaksaraee等人，2020）、MF3884 [LysoPC(22:5)]（Yan等人，2025）、MF3888 [LysoPE(16:0)]（Jiang等人，2022）、MF3928 / MF3906 [LysoPC(17:0)]（Ji等人，2022；Li等人，2014）、MF3948 [LysoPC(22:4)]（Zhang等人，2023b）、MF3966 [LysoPC(20:2)]（Ji等人，2022）、MF3981 [LysoPE(18:0)]（Fang等人，2003）和MF3987 [LysoPC(18:0)]（Park等人，2020）。

在LNB患者治疗前的脑脊液样本中，五种鞘氨醇碱（构成鞘脂结构骨架的长链氨基醇）的含量显著增加，而与治疗开始三周后收集的样本及非LNB对照组样本相比则有所下降。这些代谢物包括d19:0鞘氨醇（Huang等人，2018；Quehenberger等人，2010）（MF3680）和3-酮鞘氨醇（Zhang等人，2024）（MF3921），这表明鞘脂代谢发生了紊乱（Alaamery等人，2021；Podbielska等人，2022；Wang等人，2024）。这些长链碱是髓鞘中复杂鞘脂的前体，并被认为是具有生物活性的信号分子。例如，在多发性硬化症等神经炎症和脱髓鞘疾病中，这些鞘氨醇碱的水平升高已有报道（Podbielska等人，2022；Shi等人，2025）。然而，在对比D中，鞘脂代谢物并未显示出统计学上的显著差异，但应在弥漫性LB的背景下进一步研究。此外，还鉴定出了鞘氨醇C17的异构体（MF3513、MF3545和MF3571）（Othman等人，2012）。这些代谢物通常与合成鞘氨醇碱相关，但也有报道指出它们是由肠道微生物群产生的代谢物（Johnson等人，2020；Stoffel等人，1975）。

在对比A和对比B中检测到几种鞘磷脂代谢物，包括MF4165 [SM(d18:1/14:0)]（Qu等人，2018）、MF4184 [SM(d18:1/16:1)]（Fonteh等人，2015）、MF4195 [SM(d18:1/15:0]（Jakobsson等人，2025）和MF4215 [SM(d18:1/16:0)]（Fonteh等人，2015）。这些鞘磷脂是髓鞘和细胞膜的关键成分。在吉兰-巴雷综合征和慢性炎症性多发性神经根病（CIDP）等疾病中，鞘磷脂水平的升高已被证实是活跃脱髓鞘和疾病分期的可靠生物标志物（Capodivento等人，2021）。此外，LNB患者的血浆中鞘脂种类水平也升高[例如，CerPCho(d18:1/24:1)]，这表明感染期间可能存在全身性鞘脂代谢紊乱（?uczaj等人，2017）。在对比A中，统计分析仅鉴定出一种磷脂酰ceramide鞘脂代谢物MF4158 [CerP(d14:0/18:0)]。这些发现突显了鞘磷脂作为LNB中神经系统受累生物标志物的潜在效用。值得注意的是，几种基于鞘磷脂的代谢物在对比A中与脑脊液中CXCL13浓度存在统计学上的显著关联，进一步支持了它们在LNB神经炎症过程中的相关性。

多种被归类为脂肪酸酰胺的代谢物在统计上显示出显著性，包括亚油酰胺（André等人，2021；Huang等人，2025）（MF3760）、肉豆蔻酰胺（El-Kashak等人，2025）（MF3942）、棕榈油酰胺（Barupal和Fiehn，2019；Lohani等人，2024；Oka等人，2024）（MF4001）和油酰胺（Han等人，2022；Oka等人，2024）（MF4092），以及它们的特征性质谱/质谱（MS/MS）碎片离子。初级脂肪酸酰胺被认为是调节炎症、神经元信号传导和胶质细胞功能的神经活性脂质（Castillo-Peinado等人，2019；Divito和Cascio，2013；Ezzili等人，2010；Groth等人，2023；Kim等人，2019）。值得注意的是，油酰胺（油酸的酰胺）通过嘌呤能P2Y受体激活具有抗炎作用（Kita等人，2019），并且已知会阻断胶质细胞间的间隙连接（Guan等人，1997）。此外，油酰胺在睡眠剥夺后会在脑脊液中积累，并表现出多受体相互作用，包括与γ-氨基丁酸、血清素和大麻素受体的相互作用（Akanmu等人，2007；Fedorova等人，2001）。这些发现强调了油酰胺的神经调节和免疫调节作用。

两种环状磷脂酸（cPAs），MF4138 [cPA(16:0)]（Shimizu等人，2018；Tokumura等人，1982）和MF4103 [cPA(18:2)]（Shimizu等人，2018），在对比A和对比B中均被鉴定出来。从结构上看，cPAs是与溶血磷脂酸不同的生物活性脂质，其sn-2和sn-3位置含有环状磷酸基团。研究表明，它们可以抑制细胞增殖、迁移和神经炎症反应（Gotoh等人，2012；Uchiyama等人，2007）。例如，cPA(16:0)和cPA(18:1)在缺血性脑损伤和缺氧诱导的神经元死亡模型中表现出神经保护作用，通过调节与溶血磷脂酸受体相关的通路（Gotoh等人，2012）。值得注意的是，这两种cPA都与CXCL13浓度存在统计学上的关联，表明cPA信号传导可能与趋化因子介导的免疫激活有关。这些发现强调了cPAs作为神经炎症内源性调节剂的重要性，并支持进一步将其作为LNB潜在生物标志物的研究。

其他与脂质相关的代谢物也被检测到，包括螺甾烷-3,6-二酮（Mesa等人，2023）的异构体（MF3773和MF3883）、valenciaxanthin（M?rki-Fischer和Eugster，1990）（MF4069）、甲基-12-氧代十八烷酸（Mizota等人，2016）（MF4119）以及磷酸胆碱的碎片离子（Guerra等人，2023）（MF4212）和氧代十八烷酸（Márquez-Ruiz等人，2011）（MF4208）。这些化合物在LNB背景下的生物学相关性目前尚不清楚，需要进一步研究以阐明它们在中枢神经系统感染和LNB中的潜在作用。

几种内源性和外源性代谢物（第二类）通过统计分析被突出显示，值得进一步研究。内源性神经活性中间体的存在，包括DL-犬尿氨酸（MF1571）和5-羟色氨酸（Di Matteo和Petrucci，2025；Liang等人，2023）（MF1325）、乙酰肉碱（Chung等人，2019；Cowan等人，2016；Ferreira和McKenna，2017；Nasca等人，2018）（MF977）、谷氨酸肉碱（Mohamed等人，2015；Sun等人，2020）（MF1260）和DL-谷氨酰胺（Guo等人，2021；Welbourne，1979；Wilmore和Shabert，1998）（MF749），表明氨基酸代谢可能发生了改变。此外，乙酰肉碱在脑损伤模型中表现出神经保护作用，改善线粒体能量代谢并减少氧化应激（Ferreira和McKenna，2017）。糖基化相关代谢物N-(1-脱氧-1-果糖基)甲硫氨酸（Yang等人，2023）（MF1088）可能反映了蛋白质周转率升高或氧化蛋白损伤（Ahmed等人，2005）。还检测到了内源性柠檬酰-L-谷氨酸（Miyake等人，1978）（MF1046）和嘌呤核苷（Huang等人，2025）（MF894）。最后，外源性或异生物质，如可能的5-羟甲基-3,4-哌啶二醇（Barupal和Fiehn，2019；Imahori等人，2008；Rives等人，2009）（MF613）、3,3-二氯苯肼（Barupal和Fiehn，2019；Ning等人，2015）（MF617）、5-羟基-2-呋喃酸（Barupal和Fiehn，2019）（MF735）、果糖基缬氨酸（Barupal和Fiehn，2019）（MF912）和吲哚-3-乙酰甘氨酸（Feung等人，1975）（MF1314）以及l-DOPA n-丁基酯（Barupal和Fiehn，2019）（MF3276），可能来源于环境。在我们的脑脊液代谢组学分析中，有八种代谢物未被鉴定（第三类）。这些未知化合物在较宽的质谱区域洗脱，表明它们具有不同的物理化学性质。尽管使用精确的质量测量、质谱/质谱（MS/MS）技术和全面的谱库及数据库，仍难以准确鉴定这些代谢物（Guo等人，2022）。它们的分类和注释可以从更先进的数据处理技术和预测工具中受益，如分子网络和基于人工智能的工具（Harris等人，2022；Kuukkanen等人，2026；Nothias等人，2020；Petrick和Shomron，2022）。

在对比A和对比B中，有八种代谢物（MF400、MF730、MF905、MF1110、MF1325、MF1363、MF1566和MF1769）被归类为第四类代谢物，但未被鉴定为药物化合物。然而，它们与APAP的使用存在显著的统计关联，表明可能存在药物引起的代谢效应。MF400和MF1769未被鉴定，其分子式仍未知。MF1769在对比A和对比B中均存在。这些结果表明，在生物标志物鉴定过程中应考虑药物作为潜在的混杂因素。在上述提到的代谢物中，MF730被鉴定为氧代戊二酸（Harrison和Pierzynowski，2008；Hounguè等人，2022；Wu等人，2016），MF905被鉴定为喹啉酸（Zhao等人，2020），这是一种属于色氨酸代谢途径的神经活性代谢物。它作为神经炎症和兴奋毒性的生物标志物，因为其在N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体上的激动剂活性，且Bbsl相关神经系统炎症患者的脑脊液中喹啉酸浓度升高（Ahlberg Weidenfors等人，2025；Guillemin，2012；Halperin和Heyes，1992；Obrenovitch，2001；Schwarcz等人，2012），这与细胞因子水平升高相关。在对比A中，受试组与CXCL13细胞因子浓度也是统计显著变量。在对比B中，受试组的统计权重最大，但受试者年龄和APAP的使用也具有统计学意义。虽然喹啉酸不是APAP的代谢产物，但APAP（和乙酰水杨酸）在动物模型中被证明可以抑制喹啉酸诱导的脂质过氧化和神经元损伤（Maharaj等人，2006）。这表明APAP可能对大脑中的喹啉酸积累具有间接的神经保护作用。在我们的研究中，喹啉酸被归类为与APAP使用相关的代谢物（第四类），并在另一类（第二类）内源性代谢物中被鉴定出来，突显了其作为药物反应和疾病相关通用生物标志物的双重重要性。

MF1110被鉴定为二肽N-乙酰天冬氨酰谷氨酸（Sun等人，2025；Xue等人，2025），它是中枢神经系统中最丰富的神经肽之一（Guarda等人，1988；Vallianatou等人，2021），并且已知可以与代谢型谷氨酸受体3结合，调节突触谷氨酸释放并防止兴奋毒性（Neale和Yamamoto，2020）。在LNB等神经系统感染的情况下，兴奋毒性和神经炎症是常见的病理特征。尽管N-乙酰天冬氨酰谷氨酸不是APAP的直接代谢物，但APAP在体外和动物模型中已被证明具有抗兴奋毒性损伤的神经保护作用（Maharaj等人，2006；Tripathy和Grammas，2009）。在这里，N-乙酰天冬氨酰谷氨酸与APAP的使用在统计上相关（对比B），表明APAP的神经保护作用可能涉及调节内源性谷氨酸的释放。这些发现表明N-乙酰天冬氨酰谷氨酸可能作为第二类生物标志物，指示神经系统感染中的神经炎症状态和可能的治疗反应。然而，其特异性和临床实用性需要进一步作为内源性神经化学标记物（第二类）和药物相关特征（第四类），这突显了在解释神经系统感染中的代谢组学特征时考虑药理影响的重要性。类似地，MF1566和MF1563被鉴定为DL-犬尿氨酸的碎片产物（Barré等人，2019年；Duarte等人，2019年）（MF1571，C10H12N2O3）在MS/MS分析过程中。MF1566（C10H9NO3）是由于失去一个氨基（–NH3）而形成的，而MF1563（C9H7NO）则是通过NH3–COOH部分的裂解形成的（MF1571，C10H12N2O3）。DL-犬尿氨酸的鉴定是通过参考标准物来确认的。与它的碎片离子不同，犬尿氨酸本身并未显示出与药物使用有统计学上的显著关联。尽管如此，色氨酸途径的激活是中枢神经系统感染的一个已知特征，并且已被认为与神经炎症的发病机制有关。在细菌性脑膜炎和其他中枢神经系统感染患者的脑脊液中，犬尿氨酸及其下游代谢物（包括神经活性化合物如犬尿氨酸酸和喹啉酸）的水平升高已有报道。Coutinho等人（2014年）证明了这些代谢物在细菌性脑膜炎中的显著增加，强调了该途径在中枢神经系统炎症反应中的作用。此外，在Sühs等人（2019年）的研究中，脑脊液中犬尿氨酸的水平以及犬尿氨酸/色氨酸比率能够有效区分非感染性和感染性神经系统疾病，包括莱姆病（LNB）、细菌性脑膜炎和病毒性中枢神经系统感染。这可能解释了为什么犬尿氨酸及其MS/MS碎片产物在比较A和B中显示出统计学上的显著性，但在比较C中却没有，后者关注的是其他中枢神经系统感染（TBE、HSV和VZV）。在比较A中，MF1563和MF1571与APAP的使用没有显示出统计学上的显著关联（被归类为第二类MF），而比较本身是主要的解释因素。在比较B中，MF1566受到APAP使用的影响（被归类为第四类MF）；然而，受试者群体仍然是最显著的变量。这些发现支持犬尿氨酸途径代谢物作为中枢神经系统免疫激活的生物标志物的作用，并突显了它们在区分LNB与其他神经系统疾病方面的潜在诊断价值。

共有26个特征明确的MF被鉴定为直接来源于药物或与其使用有强烈关联。具体来说，19个MF被归类为第五类，代表来自药物的化合物。其中，16个MF归因于镇痛药APAP（MF1713）（Dargue等人，2020年；David等人，2021年）及其已知的I期和II期代谢衍生物以及其他次要代谢物，包括反映典型质量变化、碎片离子或加合物离子的特征（Dargue等人，2020年；David等人，2021年；Hairin等人，2013年；Rousar等人，2023年；Zhang等人，2018年）。有关这些MF的更详细信息，请参见补充表S1。有五个与APAP相关的MF无法精确注释，例如，由于缺乏高置信度的MS/MS光谱数据。然而，这些未鉴定的APAP衍生的MF（MF1456、MF1707、MF1708、MF1716、MF1717和MF1721）显示出相似的分子式、MS/MS光谱（MF1456、MF1707和MF1716除外）以及与已充分表征的APAP衍生MF（MF1437、MF1441（David等人，2021年），MF1442（Dargue等人，2020年；Noda等人，2022年；Zhang等人，2018年），MF1518（Dargue等人，2020年；David等人，2021年；Rousar等人，2023年），MF1658（Dargue等人，2020年），MF2017（David等人，2021年）和MF2484）有很强的统计学相似行为，支持它们被分类为直接来源于APAP的代谢物。

多西环素（Gajda等人，2014年；Sapon等人，2017年）及其相关MF（MF2235和MF2978）在比较A中显示出统计学上的显著性，MS信号仅在预治疗LNB亚组接受多西环素的三周时间点观察到（Kortela等人，2021年）。这一观察结果支持了所应用方法的灵敏度和分析准确性。相比之下，没有与头孢曲松或其代谢物相关的MF达到统计学显著性。然而，在比较A中，接受该药物的患者（n=14）的脑脊液样本中的MS峰面积低于多西环素组（n=22），这可以通过药代动力学和分析因素来解释。头孢曲松与蛋白质高度结合，限制了可进入中枢神经系统的游离部分，因为只有未结合的药物才能穿过血脑屏障（Nau等人，2010年）。而多西环素更具亲脂性，能够更一致地进入脑脊液，通常达到血清浓度的约10-30%（Haddad等人，2022年）。从分析角度来看，头孢曲松的极性及其与蛋白质和Ca2+离子的相互作用会降低提取效率并增加MS分析中的基质效应，而多西环素的亲脂性有利于回收（Krishna等人，2012年；Sun等人，2022年；Wongchang等人，2022年）。此外，不同化合物的ESI效率也可能不同（Kamel等人，1999年；Wongchang等人，2022年）。从药代动力学的角度来看，头孢曲松的进入脑脊液的过程延迟且依赖于炎症，个体间存在显著差异（Buke，2003年；Haddad等人，2022年；Kumta等人，2025年），而多西环素由于半衰期较长且进入脑脊液的预测性更强，因此暴露更稳定（Haddad等人，2022年）。

MSE分析识别出许多受影响的代谢途径。甘油磷脂分解代谢和磷脂酰肌醇代谢的改变与先前的磷脂组学研究一致，这些研究表明LNB患者的血浆中溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂种类存在紊乱（?uczaj等人，2017年）。氨基酸相关途径的富集，包括色氨酸、丙氨酸和天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺以及天冬氨酸和天冬酰胺的代谢，与报告显示的急性LNB和其他蜱传感染中色氨酸通过犬尿氨酸途径的降解增加相一致（Ahlberg Weidenfors等人，2025年；Coutinho等人，2014年；Gasse等人，1994年；Halperin和Heyes，1992年；Sühs等人，2019年）。此外，犬尿氨酸途径在LNB和TBE儿童中的激活也有所不同（Wickstr?m等人，2021年）。支链脂肪酸氧化的富集表明线粒体能量代谢发生了改变，这与脂肪酸氧化紊乱导致线粒体压力和酰基肉碱积累的证据一致（Guerra等人，2022年），类似的代谢变化也在早期LB患者的血清中观察到（Fitzgerald等人，2020年）。最后，与脑有机酸尿症相关的途径可能反映了代谢中间体的积累，并与炎症脑脊液中的神经毒性机制重叠。

这项研究存在某些局限性。由于样本来自临床来源，它们没有在最佳的-80°C条件下储存，这可能影响了受试者的代谢组学特征。非LNB和其他中枢神经系统感染病例的对照样本的详细临床信息不可用（例如，多形核细胞增多状态）。此外，脑脊液脂质组的复杂性和丰富性，特别是在炎症状态下，表明可以使用替代的样本预处理策略和针对更疏水代谢物的UHPLC–MS/MS方法来提供额外的见解。还应注意，一些脂质亚类可能由于其较长的RT（保留时间）而未能被充分代表。此外，尽管使用了高分辨率的MS/MS和光谱数据库，一些MF仍未被鉴定，这突显了当前化学注释能力的不足，特别是对于新型或微量水平的代谢物。这些迄今为止未知的化合物在整个色谱区域内洗脱，未来也可能作为潜在的LNB生物标志物。

5. 结论

我们对LNB患者脑脊液样本的非靶向代谢组学分析揭示了与神经炎症、免疫激活和中枢神经系统病理生理学相关的多种代谢改变。不同的代谢物类别，如溶血磷脂（LysoPLs）、鞘脂（SMs）、鞘磷脂碱基、脂肪酸酰胺和环磷脂酸（cPAs）发生了显著变化，表明它们在膜重塑、髓鞘更新和神经免疫调节中的作用。涉及色氨酸分解（例如，DL-犬尿氨酸）、神经递质前体（例如，5-羟色氨酸）和线粒体功能（例如，乙酰肉碱）的途径也受到了影响。虽然研究揭示了特定代谢物与临床标志物（如脑脊液CXCL13浓度）之间的有力关联，但其横断面设计限制了我们得出因果关系的能力。尽管如此，这些发现为未来的研究提供了有价值的基础。该研究确定了几个有前景的生物标志物候选物，并为理解LNB的代谢谱提供了新的见解。更大的受试者队列对于确认和验证这些生物标志物的诊断和预后潜力至关重要。重要的是，我们的结果表明，脑脊液代谢组学可能是LNB诊断中有用的补充工具。

缩写：
APAP：对乙酰氨基酚
CNS：中枢神经系统
CS：脑脊液
CerP：磷脂酰ceramide
cPA：环磷脂酸
CXCL13：趋化因子（C-X-C基序）配体13
EFN：欧洲神经病学协会联合会
HMDB：人类代谢组数据库
HSV：单纯疱疹病毒
LBL：莱姆病
LNB：莱姆神经伯氏疏螺旋体病
LysoPC：溶血磷脂酰胆碱
LysoPE：溶血磷脂酰乙醇胺
LysoPL：溶血磷脂
MF：分子特征
MS：质谱
MSE：代谢物集富集
MSI：代谢组学标准倡议
MS/M：标准质谱
non-LNB：伯氏疏螺旋体阴性对照受试者
RaMP-DB：代谢组学途径关联数据库
SM：鞘磷脂
TBE：蜱传脑炎
UHPLC：超高效液相色谱
VZV：水痘-带状疱疹病毒

资助和额外信息：
该研究由图尔库大学资助，图尔库大学基金会向IK提供了资助（081451），Sakari Alhopuro基金会向AP提供了两次资助（20230181和20200177），以及芬兰研究委员会的学术项目资助（362569）。

在撰写过程中使用了AI辅助技术：
在准备手稿期间，使用了Microsoft Copilot来帮助改写和改进语法。使用该工具生成的所有内容随后都由作者进行了审查、编辑和批准，作者对最终版本的内容负全责。在科学内容的生成、分析或解释过程中没有使用AI辅助。

数据可用性：
本研究使用的UHPLC-MS/MS原始数据和Compound Discoverer?分析的处理数据可应要求从相应作者处获得。

支持信息：
本文包含支持信息。

作者贡献声明：
Ilari Kuukkanen：写作 - 审稿与编辑、写作 - 原始草稿、可视化、验证、软件、方法学、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。
Annukka Pietik?inen：写作 - 审稿与编辑、资源管理、项目管理、资金获取、数据管理、概念化。
Tiia Rissanen：写作 - 审稿与编辑、可视化、软件、调查、正式分析。
Saija Hurme：写作 - 审稿与编辑、监督。
Elisa Kortela：写作 - 审稿与编辑、概念化。
Jukka Hyt?nen：写作 - 审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、资金获取、概念化。
Maarit Karonen：写作 - 审稿与编辑、监督、资源管理、方法学、资金获取、概念化。