柞蚕Halloween家族基因在长光照解除蛹滞育及发育过程中的表达分析

　　

摘要： 【目的】克隆获取柞蚕Antheraea pernyi中参与蜕皮激素合成的Halloween家族基因，并对长光照条件下柞蚕蛹解除滞育过程中Halloween基因的表达模式进行测定，为阐明柞蚕蛹滞育解除过程中蜕皮激素合成的特点奠定基础。【方法】利用RT-PCR从柞蚕中克隆获得5个Halloween家族基因(ApCyp307a1, ApCyp306a1, ApCyp302a1, ApCyp315a1和ApCyp314a1)，并对其进行生物信息学分析；利用半定量RT-PCR检测柞蚕滞育期和发育期蛹脑、前胸腺、血淋巴、中肠、脂肪体、精巢/卵巢、气管和表皮中上述5个Halloween基因的表达量； 利用RT-qPCR检测在室温(19~25 ℃)和低温(6 ℃)下储藏的柞蚕蛹在长光照(光周期17L∶7D)下前胸腺和脂肪体中上述5个Halloween基因及蜕皮激素受体基因ApEcR和ApUSP的表达量；利用RT-qPCR检测柞蚕4龄幼虫和预蛹中Cyp314a1 RNAi 24 h时脂肪体中Cyp314a1, ApEcR和ApUSP的表达量，观测RNAi对幼虫和预蛹发育的影响。【结果】克隆获得柞蚕5个Halloween家族基因，根据同源序列比对分别命名为ApCyp307a1, ApCyp306a1, ApCyp302a1, ApCyp315a1和ApCyp314a1(GenBank登录号分别为MW677192, MW677193, MW677194, MW677195和MW677196)；系统进化树表明， Halloween基因在进化过程中高度保守。组织半定量PCR结果表明， ApCyp307a1, ApCyp306a1, ApCyp302a1和ApCyp315a1在柞蚕蛹前胸腺中表达量高，且ApCyp302a1和ApCyp315a1在柞蚕蛹发育期含量大幅上升； ApCyp314a1在发育期蛹中肠、脂肪体和精巢/卵巢中均有较高表达。低温保存的柞蚕蛹比室温保存蛹在光周期17L∶7D下能更快地羽化；室温储存的柞蚕蛹经光周期17L∶7D处理7 d时ApCyp315a1出现表达量高峰， ApCyp306a1, ApCyp302a1和ApUSP在处理21 d时表达量升高，ApCyp314a1和ApEcR在临近羽化时（处理35 d时）表达量达到高峰。低温保存的柞蚕蛹在光周期17L∶7D处理7 d时ApCyp307a1在羽化前期表达量较大升高，而ApCyp302a1在光周期17L∶7D处理21~35 d时出现高表达量， ApCyp315a1在临近羽化时出现表达量高峰，这与常温滞育蛹解除滞育过程中的表达模式不同； ApCyp314a1在临近羽化时出现表达量高峰， ApEcR和ApUSP与常温组均表现出类似的表达模式。与注射dseGFP的对照组比， ApCyp314a1的RNAi使4龄幼虫和预蛹脂肪体中ApCyp314a1的表达量显著降低，明显抑制柞蚕的幼虫蜕皮和化蛹。【结论】这些结果表明Halloween基因在20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)合成及柞蚕生长发育中作用显著，长光照解除滞育过程中20E合成相关基因表达量高峰期多在7-21 d，而ApCyp314a1在羽化前期大量表达。低温处理后能够加速柞蚕蛹滞育的解除，除ApCyp306a1呈现多个表达量高峰，其他Halloween基因多在处理中后期表达量升高。