中华按蚊法尼酸甲基转移酶基因 AsFAMeT的克隆、分子特征与表达模式分析

　　

摘要： 【目的】本研究旨在克隆中华按蚊Anopheles sinensis法尼酸甲基转移酶(famesoic acid O-methyltransferase， FAMeT)基因AsFAMeT，分析其分子特性并探究其在发育不同阶段及成蚊不同组织中的表达模式，为阐明FAMeT的生物学功能及保幼激素合成通路作用提供理论依据。【方法】基于中华按蚊基因组数据克隆中华按蚊AsFAMeT的cDNA全长序列，对其编码蛋白质进行生物信息学分析。构建pCold-TF-AsFAMeT重组质粒，转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达重组蛋白；镍柱纯化AsFAMeT重组蛋白并制备多克隆抗体，通过Western blotting检测抗体的特异性。利用RT-qPCR检测AsFAMeT在中华按蚊不同发育阶段(卵、1-4龄幼虫、雌雄蛹和雌雄成蚊)以及3日龄雌雄成蚊不同组织(头、胸、腹、马氏管、脂肪体、中肠、卵巢、精巢和体壁)中的表达量。【结果】克隆获得中华按蚊AsFAMeT cDNA全长序列(GenBank登录号: PV368360)，开放阅读框长1 050 bp，编码349个氨基酸残基，预测AsFAMeT分子量为37.02 kD，等电点为4.64，无信号肽序列和跨膜结构域；中华按蚊AsFAMeT与冈比亚按蚊An. gambiae和达林按蚊An. darlingi FAMeTs高度同源，氨基酸序列一致性分别为77.71%和69.43%；制备的多克隆抗体能够特异识别AsFAMeT蛋白。AsFAMeT在中华按蚊发育不同阶段以及3日龄雌雄成蚊的各组织中均有表达，在4龄幼虫和雌雄蛹中均表达量较高。AsFAMeT在3日龄成蚊体壁、卵巢和精巢中的表达量显著高于在其他组织中，在马氏管和中肠中的表达量低。Western blotting蛋白定量结果与RT-qPCR结果基本一致。【结论】本研究成功克隆并原核表达中华按蚊AsFAMeT，制备的特异性多克隆抗体能够特异识别中华按蚊的天然AsFAMeT蛋白，探究了中华按蚊不同发育阶段和雌雄成蚊不同组织中AsFAMeT的表达谱，为深入了解AsFAMeT在中华按蚊生长发育和生殖调控中的分子机制提供了重要依据。