Niacin promotes motor function recovery after spinal cord injury via Hcar2-dependent microglia immunometabolic regulation

《Clinical and Translational Medicine》：Niacin promotes motor function recovery after spinal cord injury via Hcar2-dependent microglia immunometabolic regulation

　　

背景：创伤性脊髓损伤（SCI）会诱发强烈的局部炎症反应，这种反应既可促进修复也会加剧病理改变。虽然已知羟基羧酸受体2（Hcar2）具有免疫调节作用，但其在SCI中的作用以及靶向Hcar2改善运动缺陷的潜力尚不清楚。 方法：研究人员通过分析来自小鼠和食蟹猴的公开单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，分析了SCI后的脊髓转录组，重点关注Hcar2。此外，建立了体内Hcar2基因敲除（KO）的SCI小鼠模型和体外脂多糖（LPS）诱导的BV2小胶质细胞模型，通过批量RNA测序（RNA-seq）、免疫荧光染色、蛋白质印迹（Western blotting）和实时聚合酶链反应（qRT-PCR）评估Hcar2基因和蛋白表达、小胶质细胞活化及炎症反应。为了评估Hcar2激活的保护作用，给小鼠或BV2细胞施用烟酸（niacin，一种已知的Hcar2激动剂），随后评估炎症反应和运动功能。 结果：Hcar2基因表达主要在脊髓小胶质细胞中富集，并在SCI后上调，在第7天达到峰值。遗传学敲除Hcar2减少了受损的抗炎症极化小胶质细胞的百分比并增加了炎症反应。相比之下，在LPS刺激的BV2小胶质细胞模型中，用烟酸激活Hcar2可逆转线粒体功能障碍，增加耗氧率（OCR），并降低细胞因子IL-6和IL-1β的表达。给SCI小鼠施用烟酸上调了抗炎小胶质细胞，降低了多种促炎细胞因子的表达，增加了运动神经元的数量并改善了运动功能恢复。值得注意的是，所有这些保护作用均因Hcar2的基因缺失而被消除。 结论：Hcar2是小胶质细胞极化的关键调节因子，通过免疫代谢重编程促进从促炎表型向抗炎表型的转变。利用烟酸靶向Hcar2可能提供一种可转化的治疗策略，以改善SCI后的功能恢复。 关键点： 1.Hcar2被鉴定为一种保守的、损伤诱导的代谢检查点，在脊髓损伤后特异性富集于小胶质细胞中。 2.Hcar2激活将小胶质细胞代谢从重编程糖酵解转变为氧化磷酸化（OXPHOS），以驱动修复性抗炎极化。 3.药理学靶向Hcar2与烟酸以依赖Hcar2的方式解决神经炎症并促进功能性运动恢复。

论文解读：烟酸通过Hcar2依赖性小胶质细胞免疫代谢调节促进脊髓损伤后运动功能恢复

研究背景与意义

创伤性脊髓损伤（SCI）是一种破坏性的神经系统疾病，会导致长期的功能缺陷，目前缺乏有效的修复疗法。除了初始的机械创伤外，持续的继发性损伤级联反应加剧了组织损伤和功能丧失，其中主要的障碍是失调且持久的神经炎症反应。这种反应主要由常驻小胶质细胞和浸润的巨噬细胞主导，它们表现出显著的可塑性，能够采取加剧组织损伤的促炎（M1样）表型或促进神经修复的抗炎（M2样）表型。免疫代谢重编程是决定这种表型转换的关键因素，代谢向有氧糖酵解的转变支持M1样状态，而依赖氧化磷酸化（OXPHOS）则维持M2样的修复功能。羟基羧酸受体2（Hcar2），也称为GPR109A，是一种G蛋白偶联受体，因其潜在的免疫调节特性而日益受到重视。尽管Hcar2在代谢和免疫功能交叉点的作用已被证实，但其对创伤性SCI病理生理学的贡献尚未阐明。本研究旨在阐明Hcar2在SCI后小胶质细胞代谢和表型重编程中的关键作用，并探讨靶向Hcar2是否能为SCI后的功能恢复提供转化治疗策略。该研究成果已发表于《Clinical and Translational Medicine》。

主要关键技术方法

研究人员整合分析了来自小鼠和食蟹猴的公开单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，以识别SCI后的关键基因表达模式。在体内实验中，构建了Hcar2基因敲除（KO）小鼠模型，并通过T9挫伤建立SCI模型，给予烟酸（Hcar2激动剂）干预。在体外实验中，使用脂多糖（LPS）刺激BV2小胶质细胞系建立炎症模型。主要检测技术包括：利用批量RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析；通过免疫荧光染色、蛋白质印迹（Western blotting）和实时定量PCR（qRT-PCR）验证蛋白和基因表达；采用Seahorse能量代谢分析仪检测耗氧率（OCR）评估线粒体呼吸功能；通过JC-1染色检测线粒体膜电位（ΔΨm）；利用多重流式细胞术检测脊髓组织中IL-6、IL-1β和TNF-α等细胞因子水平；并通过CatWalk步态分析和Basso小鼠量表（BMS）评估运动功能恢复情况。

研究结果

3.1 SCI增加了小鼠和非人灵长类动物小胶质细胞中Hcar2的基因表达

通过对公共scRNA-seq数据集的生物信息学分析，研究人员确定了10个不同的基因元程序（MPs），其中MP3与神经炎症和免疫反应通路密切相关，且主要在脊髓小胶质细胞群中富集。进一步分析显示，SCI后显著上调的差异表达基因（DEGs）与MP3特征基因的交集包含8个共享基因，其中Hcar2显示出最高的富集评分。单细胞分辨率下的时空动态表达分析表明，损伤诱导的Hcar2上调主要局限于常驻小胶质细胞簇，特别是在活化的小胶质细胞亚型（AM3）中特异性富集。伪时间轨迹分析揭示了从稳态小胶质细胞（HM）向AM3亚型的明确分化路径，并伴有Hcar2表达的逐渐增加。此外，对食蟹猴scRNA-seq数据的整合分析证实了SCI后活化小胶质细胞中Hcar2表达模式的进化保守性。

3.2 SCI在体内和体外增加了小胶质细胞中Hcar2蛋白的表达

在T9挫伤SCI小鼠模型中，蛋白质印迹分析显示Hcar2蛋白表达呈时间依赖性增加，在第7天达到峰值。免疫荧光分析进一步证实，在病灶周围区域，Iba-1阳性的小胶质细胞中Hcar2蛋白表达增加。在体外，利用LPS刺激BV2小胶质细胞也导致Hcar2蛋白表达上调，这证实了炎症刺激是Hcar2上调的直接原因。

3.3 删除Hcar2逆转了SCI后小胶质细胞的分化和代谢

利用Hcar2基因敲除小鼠模型，研究人员发现Hcar2的缺失诱导了996个差异表达基因，KEGG和Reactome分析显示氧化磷酸化及相关代谢通路发生显著改变。qRT-PCR分析显示，与野生型SCI小鼠相比，Hcar2敲除小鼠脊髓中经典的M2（抗炎）标志物Arg-1和CD206的mRNA表达显著降低。免疫荧光染色和多重流式细胞术进一步证实，Hcar2缺失导致病灶核心区Arg-1阳性小胶质细胞数量减少，同时促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平显著升高。Western blotting结果也显示，M2样标志物Arg-1、CD206和免疫调节细胞因子TGF-β的蛋白水平在Hcar2敲除小鼠中下降。

3.4 烟酸在体外诱导小胶质细胞代谢重编程和抗炎极化

在LPS激活的BV2小胶质细胞模型中，烟酸处理促进了剂量依赖性的抗炎极化，表现为Arg-1阳性细胞数量增加。机制研究表明，LPS抑制了线粒体呼吸（表现为OCR降低），而烟酸处理以剂量依赖性方式恢复了OCR。同时，烟酸逆转了LPS诱导的线粒体膜电位（ΔΨm）下降，并提高了细胞内ATP水平。此外，烟酸剂量依赖性地逆转了LPS诱导的促炎细胞因子IL-6和IL-1β mRNA转录水平的升高。重要的是，在利用shRNA敲低Hcar2的BV2细胞中，烟酸诱导的OCR恢复、ΔΨm升高、ATP产生增加以及对IL-6和IL-1β表达的抑制作用均被显著削弱，证实了烟酸的这些效应主要通过Hcar2依赖性机制实现。

3.5 烟酸改善了SCI后小鼠的运动缺陷恢复

在体内实验中，烟酸治疗增加了SCI小鼠Iba-1/Arg-1双阳性细胞的数量，降低了促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达，并上调了Arg-1、CD206和TGF-β等抗炎标志物的蛋白水平。代谢验证显示，烟酸治疗降低了病灶周围小胶质细胞中糖酵解酶HK2的表达，但这种代谢挽救作用在Hcar2敲除小鼠中被消除。在功能层面，SCI导致腹角胆碱能（ChAT阳性）运动神经元丢失，而烟酸治疗保护了这些神经元的数量。CatWalk步态分析和BMS评分均表明，烟酸治疗显著改善了SCI小鼠的运动功能恢复，表现为平均跑步速度、爪接触强度和最大接触强度的恢复，以及BMS评分的显著提高。然而，这些神经保护和功能获益在Hcar2敲除小鼠中均被废除。

讨论与结论总结

讨论

本研究发现Hcar2是SCI后神经炎症反应的关键调节因子。Hcar2的缺失损害了适应性极化，导致抗炎表型减弱和促炎环境加剧。核心发现揭示了Hcar2信号传导、代谢重编程与小胶质细胞功能极化之间的关键联系。Hcar2可能通过Gi/o-cAMP-PKA/AMPK轴或其他信号通路协调小胶质细胞的代谢重编程，促进其向依赖氧化磷酸化（OXPHOS）的抗炎表型转变。作为一种FDA批准的药物且具有穿越血脑屏障的能力，烟酸是极具吸引力的“老药新用”靶点。本研究证实，SCI后系统给予烟酸可提供显著的神经保护并促进运动功能恢复，这一过程依赖于Hcar2。尽管研究证实了烟酸通过小胶质细胞Hcar2间接促进神经元存活，但直接神经保护作用仍有待确定。研究的局限性在于缺乏体内小胶质细胞特异性的条件性敲除模型，以及对慢性病理和长期感觉缺陷影响的评估不足。

结论

本研究确定Hcar2是促进SCI后小胶质细胞修复性抗炎表型的关键调节因子，其机制可能通过重编程免疫代谢实现。此外，研究人员验证了烟酸作为一种FDA批准的Hcar2激动剂，是一种可转化的治疗策略，可增强神经保护并改善运动功能恢复。这些发现不仅揭示了SCI病理生理学中的一个新机制，也为SCI后的临床干预提供了Hcar2这一有前景的靶点证据。