《Clinical and Translational Medicine》：Excitatory neurons and astrocytes-specific dysregulation and aberrant interactions are vulnerable to FCDI as suggested by single-cell spatial transcriptomics
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背景：局灶性皮质发育不良(FCD)是一种常见的神经发育障碍，以皮质畸形为特征，是耐药性癫痫的主要原因。FCD I型(FCDI)表现为新皮质结构异常但无细胞学异常。目前，FCDI仍是重大的临床挑战。
方法：研究人员利用单核RNA测序(snRNA-seq)和空间转
背景：局灶性皮质发育不良(FCD)是一种常见的神经发育障碍，以皮质畸形为特征，是耐药性癫痫的主要原因。FCD I型(FCDI)表现为新皮质结构异常但无细胞学异常。目前，FCDI仍是重大的临床挑战。
方法：研究人员利用单核RNA测序(snRNA-seq)和空间转录组学(ST-seq)对三名FCDI患者致痫皮质组织和三名相对正常的新皮质对照组织进行了多组学整合分析。
结果：本研究构建了FCDI患者致痫皮层的单细胞空间转录组图谱。兴奋性神经元(ENs)和星形胶质细胞(Ast)在FCDI中表现出最显著的改变。研究人员在ENs中鉴定了与FCDI相关的枢纽基因(hub genes)，并构建了转录因子(TF)-枢纽基因调控网络。值得注意的是，CBLN2highEx-1被确定为可能参与FCDI神经元过度兴奋性和皮质发育过程的亚群。Western blot和免疫荧光实验在蛋白水平验证了所选关键基因和TFs的异常表达。此外，Ast表现出异质性增加、分化受损以及FCDI中未成熟Ast比例升高，并伴有预测调控该过程的TFs。进一步分析揭示了FCDI中ENs和Ast之间异常的信号通路和配体-受体相互作用，其空间共定位模式可能促进疾病进展。
结论：本研究强调了ENs和Ast的特异性失调以及异常的细胞通讯，这可能在FCDI的发病机制中起关键作用。这些发现为FCDI的分子机制提供了新的见解，并为精准治疗和药物开发提供了潜在靶点。
论文解读
研究背景与意义
局灶性皮质发育不良(Focal Cortical Dysplasia, FCD)是皮质发育畸形(MCD)的一种亚型，也是耐药性癫痫的主要病因。其中，FCD I型(FCDI)以新皮质结构异常为特征，但缺乏明显的细胞学异常，这使得其在影像学上难以检测，临床诊断与治疗极具挑战。与存在mTOR通路基因突变的FCDII型不同，FCDI尚未发现特异性的遗传变异，也缺乏靶向治疗药物。尽管手术切除是主要治疗手段，但由于病灶弥散且常涉及功能区，术后预后往往不佳。近年来，多组学技术的发展使得在单细胞分辨率下解析脑疾病分子图谱成为可能，然而结合空间信息研究FCDI病理机制的报道尚属空白。为此，研究人员开展了本研究，旨在通过整合单核RNA测序(snRNA-seq)与空间转录组学(ST-seq)，深入探究FCDI致痫皮层中细胞类型的多样性变化及其空间分布特征，相关成果发表在《Clinical and Translational Medicine》。
关键技术方法
研究人员纳入了3例FCDI患者致痫颞叶新皮质组织及3例对照组织。核心技术手段包括：利用10× Genomics平台进行单核RNA测序(snRNA-seq)以解析细胞类型组成；利用Visium平台进行空间转录组测序(ST-seq)以获取基因表达的空间位置信息；通过CARD算法整合两种组学数据实现空间去卷积；利用hdWGCNA（高维加权基因共表达网络分析）识别基因模块；利用pySCENIC构建转录因子(TF)-枢纽基因调控网络；利用Monocle2进行拟时序轨迹分析；利用CellChat进行细胞间通讯分析；并通过Western blot和免疫荧光(IF)在蛋白水平进行验证。
研究结果
3.1 多组学分析揭示人类颞叶新皮质细胞的多样性差异
通过对snRNA-seq数据的降维聚类，研究人员注释出8种主要脑细胞类型。结果显示，与对照组相比，FCDI患者中兴奋性神经元(ENs)比例显著增加，星形胶质细胞(Ast)在胶质细胞中占比增加，而少突胶质细胞比例减少。差异表达基因(DEGs)数量及GO富集分析表明，ENs和Ast表现出最显著的转录组改变。ST-seq数据进一步将皮层分为不同层次，发现FCDI患者皮层Layer II-III (L2_3)区域细胞比例增加且转录变化最为显著。多组学整合图谱证实，FCDI患者ENs和Ast的比例及空间分布存在显著异常。
3.2 兴奋性神经元(ENs)特异性基因的调控机制
通过hdWGCNA分析，研究人员在ENs中识别出与FCDI表型呈正相关的Module-9、-11和-12，这些模块富集于突触组织、离子通道活性和神经递质传递等功能。构建的TF-枢纽基因调控网络显示，转录因子MEF2C和RFX3调控多个枢纽基因。进一步研究发现一个名为CBLN2highEx-1的ENs亚群在FCDI中显著扩增。该亚群高表达CBLN2、NTRK2和FGF13等基因，这些基因涉及谷氨酸突触功能、轴突导向和膜电位调节。WB和IF实验证实了CBLN2和NTRK2在mRNA和蛋白水平的表达上调。
3.3 星形胶质细胞(Ast)特异性基因的调控机制
对Ast的二次聚类发现了10个亚群，其中Ast-0、Ast-1、Ast-2、Ast-3和Ast-7在FCDI组中比例增加，显示出异质性增强。拟时序轨迹分析表明，FCDI组Ast分化轨迹受阻，表现为Pre-branch状态细胞增多，而成熟路径Path I细胞减少，提示Ast成熟受损且未成熟Ast比例升高。动态基因表达分析及pySCENIC推断显示，SMAD2/4/5、SOX2/9等TFs可能调控这一异常分化过程，且GPM6A、GPC5等基因在FCDI组中持续高表达。
3.4 ENs与Ast之间细胞通讯的特征
细胞通讯分析显示，尽管FCDI组预测的细胞互作数量减少，但互作强度总体增加。PTN、EGF、PDGF、CCK、SLITRK、WNT等多种信号通路在FCDI中上调，而LIFR等通路下调。聚焦于CBLN2highEx-1亚群，研究发现SEMA3-NRP1、SLITRK3-PTPRD和SLIT2-ROBO2等配体-受体对在FCDI中显著上调，且空间转录组证实这些互作对主要在皮层Layer II-IV区域共定位，提示神经元与胶质细胞间的异常信号传导可能参与疾病进程。
讨论与结论总结
本研究首次通过snRNA-seq与ST-seq的整合分析，绘制了FCDI致痫皮层的单细胞空间转录组图谱，确立了ENs和Ast是FCDI发病机制的关键细胞贡献者。研究发现CBLN2highEx-1亚群可能通过调节皮质发育和神经元兴奋性参与FCDI病理过程；Ast则表现出分化阻滞和异质性增加。异常的配体-受体相互作用（如SEMA3-NRP1等）在空间上的共定位进一步支持了神经胶质细胞串扰受损可能导致皮质重塑和癫痫易感性增加的观点。这些发现不仅加深了对FCDI分子机制的理解，也为精准医疗和药物研发提供了潜在的生物标志物和治疗靶点。
