《Molecular & Cellular Proteomics》：Innovative CRISPR/Cas9-Based Strategy for Allele-Specific HLA Peptidome Analysis Using a Pan-HLA Antibody
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人类白细胞抗原（HLA）免疫肽组学受限于等位基因特异性抗体的稀缺性以及HLA过表达系统可能引入的潜在假象。为解决这些挑战，研究人员开发了一种基于CRISPR/Cas9的策略，该策略选择性删除不需要的经典I类等位基因，同时保留单个内源性等位基因，从而能够利用泛H
人类白细胞抗原（HLA）免疫肽组学受限于等位基因特异性抗体的稀缺性以及HLA过表达系统可能引入的潜在假象。为解决这些挑战，研究人员开发了一种基于CRISPR/Cas9的策略，该策略选择性删除不需要的经典I类等位基因，同时保留单个内源性等位基因，从而能够利用泛HLA I类抗体进行等位基因分辨的肽组谱分析。作为概念验证，研究人员编辑了JY细胞，消除了HLA-B07:02和HLA-C07:02，同时保留了HLA-A02:01（ΔBC克隆）。使用泛HLA I类抗体W6/32或A02:01特异性抗体PA2.1从野生型（WT）和ΔBC克隆中免疫沉淀肽-HLA复合物，随后进行纳米液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）分析和计算HLA分配。HLA-B和HLA-C等位基因的删除导致总I类表面表达预期减少约55%。尽管如此，从ΔBC克隆中使用W6/32免疫沉淀回收的肽产量与WT细胞中PA2.1的回收量相当。结合力预测显示，使用W6/32在ΔBC克隆中鉴定出的大多数肽被分配给HLA-A02:01，且HLA-B07:02和HLA-C07:02来源的肽几乎完全丢失。序列标志（Sequence logo）分析证实了各条件下典型的A02:01基序。ΔBC W6/32免疫肽组与WT PA2.1库显示出高度的重叠（约88%），支持了该方法学的特异性和保真度。这些发现确立了基于CRISPR的HLA等位基因编辑作为一种使用泛HLA抗体进行等位基因特异性免疫肽组分析的可行策略，支持其在该概念验证系统之外的潜在应用，减少了对等位基因特异性试剂的依赖，并促进了对代表性不足HLA等位基因的研究。
该研究针对人类白细胞抗原（HLA）免疫肽组学分析中存在的抗体稀缺及过表达系统引入偏差的问题，开发并验证了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑策略，实现了在不依赖等位基因特异性抗体的情况下对内源性HLA等位基因呈递肽组的精准解析。此项研究成果已发表于《Molecular Therapy》。
在研究方法上，研究人员利用了表达HLA-A02:01、HLA-B07:02和HLA-C07:02的JY细胞系及其经CRISPR/Cas9编辑缺失HLA-B和HLA-C的ΔBC克隆作为模型。关键技术手段包括利用泛HLA I类抗体W6/32和HLA-A02:01特异性抗体PA2.1进行免疫沉淀（IP）以分离肽-HLA复合物，随后采用纳米液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）进行肽段鉴定，并利用NetMHCpan 4.1算法进行HLA结合力预测及肽段分配。此外，研究还结合了流式细胞术检测表面表达水平以及生物信息学分析（如序列标志分析和韦恩图）来评估肽组的重叠度和特异性。
研究结果部分显示：
在“WT和ΔBC克隆使用PA2.1和W6/32抗体产生相似数量的鉴定肽”部分，研究人员通过流式细胞术证实ΔBC克隆总HLA I类表达降低约55%，但HLA-A*02:01表达未受影响。尽管总表达量下降，但ΔBC克隆经W6/32免疫沉淀获得的肽段数量（2821条）与WT克隆经PA2.1获得的数量（2519条）相当，表明该策略的可行性。
在“ΔBC克隆的泛特异性抗体免疫沉淀检索到HLA-A02:01的HLA I类肽”部分，利用NetMHCpan 4.1的预测分析表明，在ΔBC克隆中，W6/32免疫沉淀的肽段约84%被分配至HLA-A02:01，而HLA-B和HLA-C来源的肽段降至约0-0.5%。相比之下，WT克隆使用W6/32时仅有约45%的肽段属于HLA-A*02:01。此外，未分配的肽段主要长度超过9个氨基酸，提示长度可能影响算法分配准确度。
在“W6/32 ΔBC克隆免疫沉淀揭示HLA-A02:01特异性肽特征”部分，热图分析显示ΔBC克隆在不同免疫沉淀条件下呈现出强烈的HLA-A02:01特异性肽段带。序列标志分析进一步证实，在ΔBC克隆中无论使用W6/32还是PA2.1，所鉴定出的9聚体肽段均呈现出典型的HLA-A02:01结合基序（P2位亮氨酸，P9位缬氨酸/亮氨酸），而HLA-B07:02的特征基序仅在WT_W6/32组中消失的肽段中被发现。
在“PA2.1免疫沉淀的WT克隆与W6/32免疫沉淀的ΔBC克隆具有高免疫肽组相似性”部分，研究人员通过对共享肽段的成对比较发现，ΔBC_W6/32与WT_PA2.1之间有528条重叠肽段，覆盖了WT_PA2.1库中88%的肽段，是所有比较中重叠率最高的。质谱强度分析显示，重叠肽段通常具有更高的信号强度，而非重叠肽段可能因丰度较低导致检测不稳定。
讨论部分总结指出，通过选择性删除HLA-B和HLA-C等位基因同时保留HLA-A*02:01，研究人员成功利用泛HLA I类抗体（W6/32）免疫沉淀获得了与等位基因特异性抗体（PA2.1）高度一致（88%重叠）的肽组。该方法的显著优势在于排除了非目标等位基因肽段的干扰，且避免了传统转染或过表达系统中因人为提高HLA分子水平而可能导致的抗原呈递失真。虽然该策略在JY细胞系（纯合子）中进行了概念验证，但其原理可推广至更复杂的杂合遗传背景及其他缺乏特异性抗体的HLA等位基因研究中。此外，研究也指出了当前HLA结合预测算法在处理较长或未分类肽段时的局限性，强调了利用此类高质量生理数据优化算法的必要性。总体而言，该研究确立了一种高特异性、生理学相关性强的免疫肽组学分析新范式，为研究罕见HLA等位基因及个性化免疫治疗提供了重要的工具基础。
