Telchinia issoria（鳞翅目：蛱蝶科）发育过程中肠道微生物群的组成与多样性特征

《Ecology and Evolution》：Composition and Diversity Characteristics of Gut Microbiota during the Development of Telchinia issoria (Lepidoptera: Nymphalidae)

　　**摘要**

苎麻（Boehmeria nivea）是一种具有高商业价值的传统经济作物，但其种植受到叶害虫Telchinia issoria的威胁。本研究利用16S rRNA扩增子测序技术，探讨了T. issoria在其幼虫、蛹和成虫阶段的肠道微生物群落的变化情况。研究发现，在所有阶段中，Pseudomonadota和Bacillota类群占主导地位，并且某些关键属在不同发育阶段有特定的富集现象：早期幼虫阶段以Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia为主，中后期幼虫阶段以Acinetobacter和Culicoidibacter为主，晚期幼虫阶段以Serratia为主，蛹阶段以Enterococcus为主，而成虫阶段则以Pseudomonas为主。α多样性在幼虫发育过程中呈现U形变化趋势，最初下降后再次上升，其中蛹阶段的整体多样性最低。β多样性分析证实了蛹和成虫阶段微生物群落的显著差异。从功能角度来看，基于16S rRNA基因测序数据的PICRUSt2分析表明，蛹阶段的碳水化合物代谢相关通路较为丰富，而与氨基酸、辅因子和维生素代谢相关的通路则相对较弱。相关性分析提示，温度升高可能是导致本研究观察到的多样性下降的原因之一，这一结论需要在受控温度条件下进一步验证。本研究为了解T. issoria的阶段特异性微生物共生关系奠定了基础，并为未来研究鳞翅目昆虫肠道微生物生态学及生物控制方法提供了新见解。

**缩写说明**

- L1：第一龄幼虫
- L2：第二龄幼虫
- L3：第三龄幼虫
- L4：第四龄幼虫
- L5：第五龄幼虫
- L6：第六龄幼虫
- L7：第七龄幼虫
- L8：第八龄幼虫
- LDA：线性判别分析
- LEfSe：线性判别分析效应量
- NMDS：非度量多维缩放
- OTU：操作分类单元（Operational Taxonomic Units）
- PICRUSt：通过重建未观察状态进行群落系统发育分析（Phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）

**1. 背景**

昆虫的肠道是一个由前肠、中肠和后肠组成的管状器官。消化和吸收主要发生在中肠，而后肠则是微生物定植的主要场所（Zhang, Zhang, and Lu 2022）。经过数百万年的进化，昆虫与其肠道微生物群落形成了协调的共生关系，使宿主能够适应多种生态环境（Wang et al. 2024; Dillon and Dillon 2004）。这些常驻微生物在宿主的生长和发育中发挥着不可或缺的作用，参与免疫防御、解毒、营养供给、消化和吸收等功能（Zhang, Feng, et al. 2022; Duplais et al. 2021; Xia et al. 2023; Zheng et al. 2019; Luo et al. 2019; Jing et al. 2020; Cheng et al. 2017）。肠道微生物群落的功能能力取决于其具体组成，其中既包括有益共生菌也包括潜在病原体（Dillon and Dillon 2004）。例如，某些Vibrio物种可以促进其他肠道微生物的生长，并帮助宿主抵御毒素（Satchell 2015）。相反，Bacillus thuringiensis可以诱导某些昆虫（如棉铃象甲Anthonomus grandis）的细胞膜穿孔和细胞死亡（Ribeiro et al. 2024）。影响这种多样性的关键因素包括宿主特异性特征（如物种和母体传播）以及外部环境因素（如饮食和栖息地）（Hasan and Yang 2019; Xie et al. 2024; Shan et al. 2024; Lü et al. 2019）。作为变温动物，昆虫对温度波动和极端气候事件非常敏感。研究表明，温度变化会显著改变多种昆虫物种的肠道微生物群落组成和功能特征（Arango et al. 2021; Singh et al. 2025; Ayyasamy et al. 2021）。宿主的发育过程伴随着显著的形态和生理变化，这也是微生物群落动态变化的另一个重要驱动因素（Lü et al. 2023; Ayayee et al. 2022）。类比人类研究，婴儿的肠道微生物群落多样性会随着年龄的增长而迅速增加，大约在3岁时达到稳定状态（Panda et al. 2014）。而在老年阶段，肠道微生物群落中的有益细菌（如双歧杆菌和乳酸菌）数量显著减少（Kumar et al. 2016）。昆虫通过变态发育为幼虫和成虫阶段创造了不同的生态位，从而减少了种内竞争（Rolff et al. 2019）。这种生命周期策略使宿主能够在不同生命阶段维持有益共生菌，同时分离和重构幼虫与成虫阶段的微生物群落（Kowallik and Mikheyev 2021）。与这种动态变化一致，昆虫在不同发育阶段的肠道微生物群落组成存在显著差异（Chen et al. 2023; Noman et al. 2021; Saraithong et al. 2017）。鳞翅目昆虫（蝴蝶和蛾类）包含约16万种已描述的物种，其中许多是重要的农业害虫，会造成严重的作物损失。鳞翅目昆虫的肠道环境对微生物定植极为不利，其特点是缺氧环境，尤其是幼虫阶段的中肠呈强碱性，pH值范围为7至12（Rousk et al. 2009; Johnson and Barbehenn 2000）。此外，完全变态发育过程（卵、幼虫、蛹和成虫阶段）为细菌的持续定植带来了额外挑战（Wang et al. 2020）。每次发育转变都伴随着肠道上皮的蜕皮和重塑（Romanelli et al. 2016）。尽管环境条件恶劣，但多项研究证实肠道微生物仍能影响鳞翅目的基本生理功能（Xia et al. 2017）。肠道微生物群落本身也会随着宿主发育而动态变化（Chen et al. 2018）。在早期阶段，微生物群落经历生态演替，包括细菌定植、合作互动和空间竞争（Sanaei et al. 2024; Figueiredo and Kramer 2020）。这些动态最终形成了更为稳定的成虫微生物群落，其与幼虫阶段的群落有显著差异（Li et al. 2023; Wang et al. 2023）。例如，在Brithys crini中，虽然Proteobacteria在幼虫和成虫肠道中都占主导地位，但在成虫阶段主要属从Empedobacter转变为Serratia（González-Serrano et al. 2020）。了解鳞翅目昆虫的肠道微生物群落具有重要的应用价值。在害虫管理方面，这类研究为减少化学农药依赖提供了途径，从而降低对人类健康和环境的影响（Zhang et al. 2023）。幼虫阶段是营养积累和快速生长的关键时期，其独特的微生物群落为生物修复提供了可能性（Xu et al. 2025）。最新研究表明，鳞翅目幼虫通过内源性酶和肠道微生物的共同作用能够代谢聚乙烯等物质（Tang, Chen, et al. 2025）。Telchinia issoria（鳞翅目：Nymphalidae）的幼虫是具有重要经济价值的苎麻（Boehmeria nivea, Rosales: Urticaceae）的主要害虫，在幼虫取食阶段会造成严重损害（Espeland et al. 2018）。该物种经历八个幼虫龄期，每年至少繁殖两代，其世代重叠受温度、湿度和降雨等环境因素影响（Hellmann 2002）。目前关于昆虫肠道微生物群落的研究主要集中在Ceratitis capitata和Aedes aegypti等常见昆虫上，且分析通常局限于单一发育时间点（Bel Mokhtar et al. 2022; Harrison et al. 2023）。因此，追踪昆虫生命周期中微生物群落动态的纵向研究以及连续发育阶段间组成和多样性变化的比较分析仍然十分有限。尽管环境因素被认为是影响昆虫生物学的重要因素，但它们对T. issoria肠道微生物群落的具体影响尚不明确。为填补这些知识空白，本研究重点探讨了宿主发育和关键环境因素如何共同塑造T. issoria的肠道微生物组。我们通过高通量16S rRNA基因扩增子测序技术分析了幼虫、蛹和成虫阶段的肠道细菌群落，并评估了它们与三个环境参数的相关性。阐明这些关系对于开发针对该农业害虫的生物控制策略至关重要（Lamichhane et al. 2017）。本研究为未来关于鳞翅目昆虫微生物共生的比较研究奠定了基础，增强了我们对宿主-微生物相互作用生态学的理解，有助于发展更可持续的害虫管理方法。

**2. 材料与方法**

**2.1 样本收集与肠道解剖**

本研究在中国安徽省黄山市黄山风景区（30.07117235°N, 118.16788854°E）的村庄和农田环境中收集了Telchinia issoria的卵，海拔高度为310–320米。收集到的卵被带回实验室后，幼虫被持续喂食新鲜的苎麻叶片。新孵化的成虫则被喂食10%的蜂蜜溶液以提供营养。我们收集了处于相应发育阶段3天的生长良好的幼虫、蛹和成虫样本。在解剖前，样本先经过饥饿处理，然后用CO2麻醉，再浸泡在75%乙醇中3分钟，最后用无菌水冲洗三次。对于幼虫，使用无菌工具在显微镜下解剖较小个体的幼虫以获取肠道样本；对于成虫，先剪除胸部的翅膀，进行表面消毒后取出肠道；对于蛹，则用镊子在后端切开以暴露并取出肠道，随后将其放入离心管中。所有样本均被立即冷冻在-80°C条件下直至DNA提取。整个肠道样本处理过程均在无菌环境下进行。最终获得了83个样本：67个幼虫样本（第一和第二龄各3个，第三龄6个，第四龄8个，第五、第六和第八龄各12个，第七龄11个），以及8个蛹和成虫样本。所有样本被视为生物学重复而非技术重复。根据龄期特征，幼虫进一步分为三组：早期幼虫阶段（第一至第二龄）、中期幼虫阶段（第三至第六龄）和晚期幼虫阶段（第七至第八龄）。

**2.2 形态指标与环境因素的测量**

使用游标卡尺和电子分析天平测量了实验所需的幼虫体长、体重和头壳宽度。利用环境监测仪每10分钟监测一次环境温度（25°C±5°C）、相对湿度（70%±5%）和光照强度。监测仪放置在饲养箱正上方10厘米处以确保监测数据的准确性。幼虫存活期间的平均环境数据被用作环境数据。

**2.3 DNA提取、PCR扩增和测序**

使用E.Z.N.A. DNA Kit（Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.）提取DNA。随后进行PCR扩增、扩增子文库制备和高通量16S rRNA测序。使用通用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）扩增细菌16S核糖体RNA基因的V4-V5区域。PCR反应条件为95°C预热2分钟，随后进行25个循环：95°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒，最后在72°C下延伸5分钟。PCR反应在含有4μL 5×FastPfu Buffer、2μL 2.5mM dNTPs、0.8μL每种引物（5μM）、0.4μL FastPfu聚合酶和10ng模板DNA的20μL混合液中进行三次重复。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences, Union City, CA, U.S.）进行DNA纯化，Quantus Fluorometer进行定量。测序在Illumina MiSeq平台（PE300; Shanghai Oumeng Biotech Co. Ltd., Shanghai, China）上进行。原始序列结果使用fastp软件（版本0.20.0）进行质量控制，FLASH软件（版本1.2.7）进行双端序列拼接（Bolger et al. 2014; Mago? and Salzberg 2011）。使用UPARSE软件（版本7.1）根据97%相似性阈值将clean reads聚类为操作分类单元（OTU）（Edgar 2013）。RDP分类器（版本2.2）结合Silva 16S rRNA数据库（v138）进行分类注释，置信度阈值为80%（Quast et al. 2013）。

**2.4 生物信息学分析**

使用Mothur（v.1.21.1）对样本的测序深度进行归一化处理，生成稀疏OTU表。基于该数据集计算了α多样性指数（包括Simpson指数和Shannon指数）。使用非参数Kruskal–Wallis（KW）检验对微生物α多样性进行统计分析以评估样本间的显著差异。基于Bray–Curtis距离分析微生物β多样性，比较样本间微生物群落的相似性。使用R vegan包构建非度量多维缩放（NMDS）图谱。使用Linear Discriminant Analysis Effect Size（LEfSe）识别样本间的优势种群（Segata et al. 2011）。使用PICRUSt2（http://picrust.github.io/picrust/tutorials/genome_prediction.html）将16S rRNA V4-V5区域的测序结果与KEGG数据库进行比较，以推断不同样本中微生物群的功能变化（Langille等人，2013年）。获得的OTU数据被用来生成BIOM文件，这些文件格式化为PICRUSt2的输入，可以使用Mothur中的make.biom脚本进行处理。

2.5 统计分析

统计分析使用SPSS 22.0软件包和GraphPad Prism 9进行。通过Spearman相关性分析研究了肠道微生物群与形态指数以及环境因素之间的相关性。多重检验校正使用了FDR校正（Benjamini-Hochberg方法）。(**: FDR < 0.001, *: FDR < 0.05）。

3 结果

3.1 Telchinia issoria生命周期中的肠道细菌组成

经过质量过滤和预处理后，过滤掉了古菌、线粒体和叶绿体序列。从83个样本中获得了2,953,203个有效标签，平均每个样本约35,000个有效序列，平均序列长度为419 bp。Shannon–Wiener曲线和物种积累曲线反映了样本的物种丰富度和饱和采样深度，表明测序数据样本是充分的（图S1A,B）。Good's覆盖率用于显示测序的完整性，每个样本的覆盖率均高于99%，表明本研究检测到了样本中的大多数有效物种（表S1）。在门水平上的分类分析显示，在T. issoria的发育阶段，优势门为假单胞菌门（以前称为变形菌门）、杆菌门（以前称为厚壁菌门），其次是放线菌门和拟杆菌门。在蛹阶段，杆菌门的相对丰度最高；而在幼虫和成虫阶段，变形菌门的相对丰度较高（图1A）。在科水平上，莫拉克斯菌科（Moraxellaceae）和红斑菌科（Erysipelotrichaceae）在幼虫阶段占主导地位；而在蛹阶段，肠球菌科（Enterococcaceae）占主导地位，而在成虫阶段，假单胞菌科（Pseudomonadaceae）较为常见（图1B）。在属水平上，不动杆菌属（Acinetobacter）在幼虫阶段较为丰富，但在蛹和成虫阶段相对较少。伯克霍尔德菌-卡巴列罗尼亚菌-副伯克霍尔德菌（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）在第一龄幼虫中较为常见，而在第四、五、六龄幼虫中，库利科伊迪巴克菌（Culicoidibacter）成为主要属。克雷伯菌属（Klebsiella）和沙雷菌属（Serratia）在第八龄幼虫中富集。蛹阶段主要由肠球菌属（Enterococcus）定植，而成虫阶段则主要由假单胞菌属（Pseudomonas）和窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）主导（图1C）。

3.2 Telchinia issoria发育阶段中微生物群落组成的变化

alpha多样性指数在各个生命阶段都有波动（图2A–D和表S1）。从幼虫到成虫的转变过程中，肠道微生物群的多样性最初下降，然后增加。第一龄幼虫的多样性最高；从第二龄到第四龄逐渐下降，而从第五龄到第八龄总体上有所增加。alpha多样性指数的组间差异检验显示，蛹阶段的Simpson多样性指数显著低于幼虫阶段和成虫阶段（p < 0.05，Kruskal–Wallis检验）。第四龄幼虫的微生物群多样性显著低于第一龄幼虫和第七、八龄幼虫（p < 0.05，表S2）。

3.3 Telchinia issoria发育阶段中肠道相关微生物群的beta多样性分布

基于Bray–Curtis方法，蛹和成虫拥有各自独特的微生物群落，尽管与其他发育阶段的群落有轻微重叠（图3A）（NMDS，应力=0.144；PERMANOVA：F=13.339；p=0.001；排列次数=999）。整个幼虫期间的微生物结构显示出重叠的相似性，但也存在差异（图3B；NMDS，应力=0.144；PERMANOVA：F=5.166；p=0.001；排列次数=999）。根据Adonis成对比较，早期和晚期幼虫的细菌群落有所不同。值得注意的是，相邻的幼虫龄期倾向于聚集在一起，这表明群落结构是逐步、逐阶段演变的，而不是突然变化的（表S3）。这表明T. issoria的肠道微生物群落结构在发育阶段是不同的。

3.4 Telchinia issoria发育过程中显著不同的细菌群落

通过LEfSe分析（线性判别分析效应大小）识别了在T. issoria发育阶段中显著富集的类群，从门到属水平（图4，图S2）。在幼虫阶段，识别出几个特定阶段的生物标志物类群。在第一龄幼虫中，有三个跨越多个分类等级的类群富集；在第三龄幼虫中，有一个门级别的类群富集；在第四龄幼虫中，有七个类群富集；在第六龄幼虫中，有三个类群富集；在第八龄幼虫中，有一个类群富集。在幼虫阶段之后，蛹和成虫阶段分别富集了五个和两个类群。在属水平上，伯克霍尔德菌-卡巴列罗尼亚菌-副伯克霍尔德菌（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）在第一龄幼虫中显著富集；不动杆菌属（Acinetobacter）和库利科伊迪巴克菌（Culicoidibacter）在第四龄幼虫中高度富集；肠球菌属（Enterococcus）在蛹阶段占主导地位，而假单胞菌属（Pseudomonas）在成虫阶段占主导地位（图4）。

3.5 Telchinia issoria发育过程中肠道微生物群的功能预测

PICRUSt2基于16S rRNA基因序列预测了KEGG途径的相对丰度。其中，代谢、遗传信息处理、环境信息处理、人类疾病、细胞过程和有机体系统所占比例最高（表S4）。其中，代谢所占比例最高，其次是遗传信息处理和环境信息处理（图6A）。关键的次级代谢功能包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢、辅因子和维生素代谢、能量代谢等（图6B）。

3.4 肠道微生物群在T. issoria发育过程中的功能预测

KEGG途径的功能预测由PICRUSt2基于16S rRNA基因序列进行。其中，代谢、遗传信息处理、环境信息处理、人类疾病、细胞过程和有机体系统所占比例最高（表S4）。在这些功能中，代谢功能在第一龄幼虫和成虫中最为丰富。此外，与能量代谢和辅因子及维生素代谢相关的功能在第四龄幼虫中更为丰富。碳水化合物代谢的功能在蛹的肠道中更为丰富。其他氨基酸代谢、氨基酸代谢以及辅因子和维生素代谢的功能在蛹中的丰度显著低于其他阶段（图7）。

3.5 肠道微生物群与各种因素的相关性

相关性分析可能揭示肠道微生物群多样性、宿主形态指数和环境因素之间的显著关系（图8A–H）。具体来说，第五至第七龄幼虫的Shannon多样性指数可能与体长呈正相关，而第六至第八龄幼虫的alpha多样性可能与温度呈负相关。在属水平上，第三龄幼虫中不动杆菌属（Acinetobacter）的丰度可能与温度呈正相关（图8）。

4 讨论

肠道微生物群在昆虫的生理、行为和生态适应中起着关键作用（Jang和Kikuchi，2020年）。通过使用高通量16S rRNA基因测序，本研究表征了T. issoria的幼虫、蛹和成虫阶段的肠道微生物组。一些研究发现，昆虫的肠道中含有大量的微生物，且大多数昆虫在发育和成熟过程中微生物群的丰度会增加（Caccia等人，2019年；Kim等人，2017年）。我们的研究揭示了一种动态的演替模式：微生物的alpha多样性在早期幼虫阶段达到峰值，在蛹阶段下降，然后在成虫阶段再次回升。这一观察结果与全变态发育过程中的深刻生理转变一致。早期幼虫的高初始多样性可能反映了多样化的微生物群可以增强代谢能力，有助于消化多种植物化合物并提高环境适应性（Jones等人，2019年）。随着幼虫的发育，多样性呈现U形趋势，先下降后再次上升。这种模式可能源于一种调节过程，即幼虫肠道免疫系统的成熟积极地清除不兼容的微生物，形成更加精简和功能专化的核心群落，而后期幼虫增强的咀嚼能力和更大的食物摄入量则需要更丰富和复杂的微生物群落来辅助消化（Guo等人，2023年）。最显著的变化发生在蛹阶段，此时多样性降至最低。这一瓶颈可能是由于蛹前期的肠道清除、进食完全停止以及变态过程中广泛的组织溶解和组织重组所致（Shao等人，2024年）。这个脆弱的非进食期对微生物的持续存在构成了严格的筛选。最后，大多数鳞翅目成虫开始进食后，预计微生物组成会发生变化，例如多样性和丰度会增加（Nijhout和Williams，1974年）。beta多样性分析显示，T. issoria不同发育阶段的肠道微生物群组成发生了显著变化。成虫和幼虫具有独立的微生物群落，这可能是因为消化系统的形态和生化特性从幼虫到成虫发生了变化，它们的饮食也完全不同（Yang等人，2022年；Dong等人，2020年；Chen等人，2016年）。其他鳞翅目昆虫的研究也发现，不同的饮食在肠道中创造了不同的生化条件，从而促进了不同微生物群的定植（Jordan等人，2023年）。一些特定的微生物类群可以通过提供与消化、解毒和营养补充相关的功能来帮助宿主利用生命阶段特有的资源（Acevedo等人，2017年；Anand等人，2010年）。与其他许多鳞翅目昆虫的研究结果一致，T. issoria的肠道微生物群在整个生命周期中始终以假单胞菌门（以前称为变形菌门）和杆菌门（以前称为厚壁菌门）为主，拟杆菌门和放线菌门也构成了重要组成部分（Shao等人，2024年；Gohl等人，2022年；Yang等人，2022年）。假单胞菌门和杆菌门的持续主导可能具有功能性意义。这些门含有编码多种植物细胞壁降解酶的基因（例如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶），这些酶对于食草昆虫的消化至关重要（Li等人，2022年）。在我们的研究中，特别是在蛹阶段观察到了杆菌门相对丰度的显著增加。鉴于蛹阶段是一个脆弱的非进食期，其特征是发育重组，杆菌门的增强存在可能有助于支持宿主的防御。该门类的成员经常参与调节宿主的先天免疫系统并增强抗病能力，可能形成一种互利关系，有助于保护休眠中的蛹免受外部病原体的侵害（Jordan等人，2023年）。放线菌在幼虫阶段相对丰度最高，以其强大的抗菌特性和抗生素抗性而闻名（Fatahi-Bafghi，2019年）。由于幼虫阶段是营养吸收的主要时期，放线菌的存在可能增强幼虫消化食物和抵抗宿主植物防御化合物的能力。在属的水平上，有研究表明某些鳞翅目物种可能包含核心微生物组，例如不动杆菌（Acinetobacter）和沙雷氏菌（Sarratia，变形菌门）以及肠球菌（Enterococcus）和库利科伊迪巴菌（Culicoidibacter，厚壁菌门）（González-Serrano等人，2020年）。不动杆菌在幼虫阶段广泛存在，可能参与代谢植物次生代谢物（如多酚）并调节昆虫的免疫反应（Mason等人，2016年；Li等人，2021年）。沙雷氏菌在第八龄幼虫中富集，可能降解芳香化合物（如嘌呤生物碱）（Lawrence，1998年）。尽管在高丰度时通常是机会性病原体，但其适度存在可能有助于解毒（Rojas-Avelizapa等人，2002年）。通过改造沙雷氏菌AS1菌株，研究人员成功实现了对多种蚊媒病原体的精准靶向，证明了肠道微生物群介导的控制策略在昆虫媒介中的有效性（Hu等人，2025年）。沙雷氏菌昆虫病原体（Serratia entomophila）是一种商业上可获得的细菌，曾广泛用于新西兰牧场中草地螟（Costelytra zealandica）的生物防治（Pritam和Sukanta，2013年）。针对或调节这一阶段的沙雷氏菌种群可能抑制幼虫发育，从而实现生物防治效果。库利科伊迪巴菌在中后期幼虫中广泛存在，首次从库利科伊迪斯蚊（Culicoides sonorensis）中分离出来，是一个值得进一步研究的属（Neupane等人，2020年）。肠球菌是鳞翅目中最常见的肠道细菌，在蛹中占据主导地位（Chen等人，2016年；Broderick等人，2004年；Shao等人，2014年；Xiang等人，2006年）。先前的研究表明，肠球菌主要参与编码消化酶和碳水化合物代谢的基因，从而影响消化和生长（Xia等人，2020年）。此外，肠球菌菌株可以产生抗氧化剂（如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶），可能减轻氧化应激（Mazumdar等人，2021年）。最近的研究表明，肠球菌可以与苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）协同作用，增强杀虫效果，表明非致病性功能微生物可以作为精准害虫管理的特定生物控制剂（Chen等人，2024年）。线性判别分析效应量（LEfSe）确定了特定发育阶段的生物标志物分类群。伯克霍尔德菌-卡巴列罗尼亚菌-副伯克霍尔德菌复合体在第一龄幼虫中显著富集；最新证据表明这一群体可能影响宿主的蜕皮和发育（Wang等人，2025年）。肠杆菌在第八龄幼虫中富集，可能与幼虫体型和适应性的提高有关（Hamden等人，2013年）。在成虫中，假单胞菌（Pseudomonas）和葡萄球菌（Staphylococcus）占主导地位。这些属可能作为共生生物参与营养循环，同时也被认为是潜在的病原体，尤其是在免疫系统受损的宿主体内（Ma等人，2021年；Morales-Jiménez等人，2013年；Sommer等人，2025年）。它们在健康成虫肠道中的生态作用，如营养循环，值得进一步研究。这些动态的、特定发育阶段的微生物组成变化可能对宿主生理有重要生物学意义。为了推断潜在的功能能力，我们使用了PICRUSt2工具。预测结果显示，T. issoria的肠道微生物群广泛参与关键代谢途径，包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢以及辅因子和维生素的代谢。这表明从叶片中获得的营养可能无法完全满足幼虫的代谢需求，因此需要肠道微生物的补充作用（Chen等人，2020年）。值得注意的是，与碳水化合物代谢相关的预测功能显著较高，而氨基酸、辅因子和维生素的代谢在蛹阶段明显较低。这可能反映了蛹阶段的独特生理特性：全变态昆虫在变态前积累了足够的营养储备（以糖原或海藻糖的形式储存）。蛹期血淋巴中海藻糖的下降与报道的碳水化合物代谢活动增加一致（Suzuki等人，2023年）。虽然与氨基酸、辅因子和维生素代谢相关的途径在其他阶段显著减少，但我们推测这种微生物功能潜力的降低可能归因于两个生物学因素。首先，蛹在变态期间停止进食，导致外部营养输入急剧减少。因此，微生物生长受到限制，许多微生物赖以生存的营养物质耗尽（Dittmer和Brucker，2021年）。其次，蛹期发生了广泛的肠道组织重塑，涉及肠上皮的组织溶解和重建。这一过程改变了肠道微环境条件，可能限制了肠道微生物群的定植、丰度和代谢活性（Zhang等人，2018年）。因此，观察到的代谢途径下调可能是进食停止和宿主生理适应的共同结果。这项研究表明，温度可能影响昆虫肠道微生物群的多样性。随着温度的升高，微生物多样性趋于下降。高温可能降低微生物多样性，改变细菌组成，并对昆虫的生存和适应性产生负面影响（El-Shesheny等人，2016年；Gerber等人，2021年；Mason和Shikano，2023年）。先前的研究表明，肠道微生物群可以帮助宿主适应外部压力，如昆虫病原体和除草剂带来的双重压力（Zhang等人，2024年）。同时，肠道微生物群在昆虫的体温适应中也起着重要作用，通过结构重组和与宿主的代谢合作来响应温度波动（Hafsi等人，2024年；Tang、Li等人，2025年）。温度介导的肠道微生物群变化对宿主生理的影响及其对生物控制的意义值得进一步研究。总之，这是首次描述T. issoria整个生命周期中肠道微生物群的整体结构。在这项研究中，我们发现了T. issoria不同发育阶段微生物群的动态变化、群落组成和潜在功能，丰富了鳞翅目昆虫的肠道微生物资源。这项研究的几个方面为未来的研究指明了有价值的方向。首先，虽然基于PICRUSt2的功能预测提供了有用的见解，但需要实验验证。尽管采用了稀释法来最小化由于样本测序深度不均造成的偏差，但这种标准化过程可能导致信息丢失。未来结合宏基因组测序、转录组学或代谢组学的研究可以直接确认肠道微生物群的功能基因库。其次，应在实验室条件下（25°C±5°C）扩展与温度相关的观察。未来采用受控温度梯度实验的研究可以建立温度与肠道微生物多样性、结构和功能之间的直接因果关系，从而阐明肠道微生物群在热应力下的适应机制。更全面地理解这些相互作用可能为开发创新的生物控制策略铺平道路，利用功能性细菌提高生物控制剂的效果。

作者贡献：
杨欣：数据整理（平等）、正式分析（平等）、研究（平等）、验证（平等）、可视化（平等）、撰写——初稿（主导）、撰写——审阅和编辑（主导）。
刘刘东：数据整理（支持）、研究（支持）。
金晓晓：项目管理（平等）、可视化（平等）。
刘杰：方法学（平等）、监督（平等）。
高敏：研究（平等）、资源（平等）。
方杰：资金获取（主导）、项目管理（平等）、资源（平等）、监督（主导）。

致谢：
作者感谢审稿人的宝贵意见以及所有为这项工作做出贡献的人士。

资金：
本研究由全球环境基金资助：黄山风景区生态环境地面监测（项目编号：K160138311）。

利益冲突：
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明：
支持本研究结果的数据可在基因组序列档案（GSA）中获取，网址为：https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/s/7B8bqVT5。