血管紧张素受体-脑利肽酶抑制剂对多柔比星诱发的心肌病相关心力衰竭大鼠模型中内质网应激的影响

《JOURNAL OF APPLIED TOXICOLOGY》：The Effects of Angiotensin Receptor Neprilysin Inhibitor on Endoplasmic Reticulum Stress in Doxorubicin-Mediated Cardiomyopathy-Associated Heart Failure Model in Rats

　　**摘要**

多柔比星（DOX）作为化疗药物使用时，最严重的并发症之一是心肌病。尽管使用了如血管紧张素受体-脑利肽酶抑制剂（ARNI）等心脏保护药物来预防DOX患者的心肌病，但尚未有研究报道ARNI与DOX诱发的心肌病中的内质网（ER）应激之间的关系。本研究的目的是探讨在DOX诱导的心肌病大鼠模型中，GRP78蛋白可能发生的改变，并评估用于治疗的ARNI（LCZ696）是否对该蛋白有效。雄性Wistar白化大鼠被分为五组：对照组、DOX组、ARNI组、DOX+ARNI组以及DOX后/ARNI组。监测了各组的体重变化。心脏组织切片用苏木精-伊红染色。通过免疫组化标记方法评估GRP78的表达情况。与对照组和ARNI组相比，DOX组及DOX后/ARNI组的大鼠体重显著下降。与DOX组和DOX后/ARNI组相比，DOX+ARNI组的心肌细胞退行性变化较少。在比较GRP78染色强度时，对照组、ARNI组和DOX+ARNI组的染色强度显著低于DOX组和DOX后/ARNI组。这些结果表明，ARNI联合治疗可以减轻DOX诱发的心肌病中的ER应激和心肌损伤。因此，在蒽环类化疗期间，ARNI可能在症状管理和心脏保护方面提供双重益处。

**1 引言**

心力衰竭（HF）是全球发病率和死亡率的主要原因之一（Hunt等人，2005年）。HF最常见的原因包括心血管疾病、高血压和心脏瓣膜疾病（Kannel等人，1994年）。然而，某些患者的心力衰竭也与使用心脏毒性药物有关（Teerlink等人，1991年）。其中最显著的一类药物是化疗药物，这些药物在延长癌症患者寿命方面具有显著作用。但这些药物也会导致心脏副作用，如血压轻微变化、血栓形成、心电图（ECG）改变、心律失常、心肌炎、心包炎、心肌梗死和心力衰竭（Hunt等人，2005年）。多柔比星（DOX）是一种蒽环类抗癌药物，广泛用于化疗（Von Hoff等人，1979年）。该药物最显著的副作用是慢性心肌病，其严重程度取决于剂量。DOX的使用会导致心动过速、心房和心室心律失常以及不可逆的心力衰竭。据报道，DOX通过内质网（ER）应激途径引起心脏损伤（Yarmohammadi等人，2021年）。通过在治疗中添加其他药物，可以减少DOX治疗期间可能发生的心血管损伤（Von Hoff等人，1979年）。大多数用于治疗的新型药理策略基于调节内源性神经激素系统，但这些系统在心力衰竭进展过程中并不兼容。为了计算心脏风险并优化监测，在进行化疗之前需要详细的临床病史和体格检查。肥胖、糖尿病、代谢综合征、高血压、心肌病家族史以及既往或同时进行的化疗都是心血管并发症的高风险因素。可以使用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEIs）、血管紧张素受体阻滞剂（ARBs）和β-阻滞剂等心脏保护药物来治疗这些患者（Yancy等人，2013年）。Sacubitril-valsartan是一种被批准用于治疗射血分数降低的症状性心力衰竭的分子（McMurray等人，2014年）。它是由Sacubitril（一种脑利肽酶抑制剂）和Valsartan（一种ARB）组成的组合（Gu等人，2010年）。脑利肽酶是一种中性内肽酶，通过促进其分解来降低内源性血管活性肽（如利钠肽（NPs）、缓激肽、胰高血糖素和血管活性肠肽）的水平（D'Elia等人，2017年）。在心力衰竭治疗中抑制脑利肽酶的目的是防止这些物质水平的降低，从而避免导致水分和钠潴留、血管收缩以及不适当的心肌重塑（Vardeny等人，2014年）。血管紧张素受体-脑利肽酶抑制剂（LCZ696）是这类药物的第一个例子。ARNI疗法通过阻断血管紧张素II起作用，这一机制对心力衰竭有负面影响；同时通过Sacubitril激活NP系统，这一机制具有积极效果（Niemiec等人，2025年）。内质网（ER）对蛋白质合成、蛋白质折叠、蛋白质转运、钙稳态和脂质生物合成至关重要。ER腔内的蛋白质浓度和蛋白质合成速率非常高（Stevens和Argon，1999年）。ER腔内的稳态对于正确的蛋白质折叠至关重要。生理或病理刺激破坏这种稳态会导致错误折叠和未折叠蛋白质的积累，这一过程称为ER应激（Oyadomari等人，2002年）。ER应激激活复杂的信号通路来处理错误折叠和未折叠的蛋白质，称为未折叠蛋白质反应（UPR）。UPR激活转录和翻译通路，以降低错误折叠蛋白质的修复速率，并增加ER中蛋白质伴侣蛋白和折叠酶的表达（Lindholm等人，2006年）。ER相关降解（ERAD）也由UPR激活，以清除无法修复的错误折叠蛋白质。然而，如果UPR无法减轻ER应激并恢复稳态，ER应激会导致细胞功能障碍和凋亡。在DOX诱导的心脏毒性中，UPR具有双重作用。一方面，不适应性的UPR会促进各种病理过程，如凋亡，从而加剧DOX引起的心脏损伤（Yarmohammadi等人，2021年）；另一方面，激活适应性UPR则具有保护作用（Maiuolo等人，2021年；Fa等人，2022年）。研究表明，经过DOX处理的心肌细胞会受到损伤，ROS和与ER应激相关的蛋白质水平都会升高。这表明氧化应激和ER应激在DOX诱导的心脏毒性中都起作用（Wang等人，2018年；Kim等人，2022年）。ER应激被认为在许多疾病的发展和进展中起着重要作用，包括心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病和肝脏疾病（Stevens和Argon，1999年；Oyadomari等人，2002年；Lindholm等人，2006年）。先前的研究结果表明，减轻ER应激可以减轻DOX的有害影响，并减少心肌细胞的损失（Bagchi等人，2021年；Malik等人，2022年；Zhao和Zhang，2017年）。尽管有许多关于使用ACE抑制剂（ACEI）、ARBs和ARNI等心脏保护药物来预防接受DOX治疗患者的心肌病的研究，但尚未有研究报道ARNI与DOX诱导的心肌病中的ER应激之间的关系。本研究旨在使用组织化学和免疫组化方法探讨DOX诱导的心力衰竭模型中的ER应激以及ARNI治疗对ER应激的潜在治疗效果。

**2 材料与方法**

**2.1 动物**

本研究得到了梅尔辛大学动物实验地方伦理委员会的批准，批准日期为2019年9月9日，批准号为2019/23。本研究使用了体重在250–280克之间、年龄在8–10周之间的雄性Wistar白化大鼠（n=46只）。动物在实验室中处于标准化条件下饲养，温度范围为23°C–25°C，光照/黑暗周期为12小时。食物和水可自由获取。动物被关在钢制笼子里，喂食新鲜的标准饲料，没有饮食限制。

**2.2 实验设计**

总共46只Wistar白化大鼠被随机分为五组。对照组（n=8）未接受任何处理。DOX组（n=10）每周两次接受2毫克/千克的DOX腹腔注射，持续6周（每次注射1毫克/千克）（Shen等人，2016年；Timm等人，2022年）。ARNI组（n=8）通过灌胃接受60毫克/千克的ARNI，持续8周（Zhao等人，2024年）。DOX+ARNI组（n=10）每周两次接受2毫克/千克的DOX腹腔注射，持续6周（每次注射1毫克/千克），同时通过灌胃接受60毫克/千克的ARNI，持续8周。DOX后/ARNI组（n=10）首先每周两次接受2毫克/千克的DOX腹腔注射，持续6周（每次注射1毫克/千克），随后通过灌胃接受60毫克/千克的ARNI，持续8周。实验前后测量并统计分析了大鼠的体重。实验结束时，通过腹腔注射10毫克/千克的xylazine（Rompun 2%，Bayer）和80毫克/千克的ketamine（Ketalar，Parke-Davis）对动物进行深度镇静，然后取出心脏样本。

**2.3 组织病理学检查**

取出的心脏样本在10%的中性福尔马林溶液中固定48小时。然后进行常规的光学显微镜组织观察。将组织包埋在石蜡中制成块状。使用旋转切片机（Leica RM2125RT，Leica Microsystems GmbH，维也纳，奥地利）从石蜡块中切割出5微米厚的切片，并放置在涂有粘合剂的载玻片上（Superior Marienfeld-HistoBond，德国）。切片用苏木精-伊红染色。所有样本在Olympus BX50光学显微镜（Olympus Corporation GmbH，德国）下进行观察，并使用Olympus LC30数码相机系统（Olympus Corporation，东京，日本）拍摄图像。

**2.4 免疫组化分析**

使用旋转切片机从组织块中切割出5微米厚的切片，并转移到涂有聚-L-赖氨酸的载玻片上。为了评估组织中的ER应激，根据以下方案用抗GRP78抗体对切片进行适当染色。脱蜡和复水后，将切片转移到蒸馏水中。为了回收抗原，将切片在37°C下用胰蛋白酶（pH：7.6）孵育30分钟。然后将切片在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤三次，每次5分钟。接着在3%过氧化氢（H2O2）中孵育10分钟以抑制内源性过氧化物酶活性。然后再次在PBS中洗涤三次，每次5分钟。为了防止非特异性抗体结合，将组织用蛋白质封闭液孵育8分钟。然后在不洗涤组织的情况下去除组织上的蛋白质封闭液。将抗GRP78兔多克隆一级抗体（ab21685，Abcam）以1:100的比例稀释在0.5%牛血清白蛋白（BSA）中，滴加到切片上。切片在+4°C下孵育过夜。一级孵育后，将切片在PBS中洗涤三次，每次5分钟。然后在室温下用生物素标记的抗兔二级抗体（D01-125，GBI Inc.，Mukilteo，WA，美国）孵育30分钟。接着在PBS中洗涤三次，每次5分钟。然后将切片与链霉亲和素-过氧化物酶酶溶液孵育10分钟，之后在PBS中洗涤三次，每次5分钟。应用二氨基联苯胺（DAB）作为过氧化物酶底物来显示抗体结合。使用苏木精进行复染，并用entellan封片。对于阴性对照，切片在不含一级抗体的0.5% PBS-BSA中孵育。实验结束后，使用ImageJ程序将免疫组化染色强度转换为数值数据。将组织样本的图像上传到程序中，并在0到255的范围内测量染色强度（0表示轻度染色，255表示重度染色）。获得的数据进行了统计分析。

**2.5 统计分析**

统计分析使用SPSS版本11.5进行。数据以平均值±标准误差的形式呈现。使用Shapiro–Wilk检验对连续数据进行正态性检验。采用单因素方差分析（ANOVA）来评估数据。Tukey检验用于确定组间差异的显著性。Student's t检验用于组间配对比较，p值小于0.001（p≤0.001）被认为具有统计学意义。

**3 结果**

**3.1 体重评估**

各组实验前的体重没有统计学上的显著差异（p>0.001）（表1；图1）。当比较实验前后的体重时，对照组和ARNI组的体重显著增加（p<0.001）（表1；图1）。相比之下，DOX组、DOX+ARNI组和DOX后/ARNI组在实验前后的体重没有显著差异（p>0.001）（表1；图1）。然而，对照组和ARNI组的实验后体重显著高于DOX组、DOX+ARNI组和DOX后/ARNI组（p<0.001）（表1；图1）。比较DOX组与DOX+ARNI组和DOX后/ARNI组时，实验后的体重也没有显著差异（p>0.001）（表1；图1）。

**表1. 实验前后大鼠的体重（克）**
| 组别 | 实验前 | 实验后 |
|-----------|-------------|-------------|
| 对照组 | 285.63±22.27 | 366.75±22.69* |
| DOX组 | 261.11±14.31 | 261.78±48.32 |
| ARNI组 | 272.13±23.63 | 277.22±30.53 |
| DOX+ARNI组 | 282.30±21.20 | |
| DOX后/ARNI组 | 306.50±22.74 | |

* 表示平均值±标准偏差。
p<0.001表示有显著差异。图1：在图示查看器或PowerPoint中打开

研究前后体重的变化。X轴：体重；Y轴：对照组（n=8），DOX组（n=10），ARNI组（n=8），DOX+ARNI组（n=10），以及DOX/ARNI后组（n=10）。

3.2 组织病理学发现

对照组和ARNI组的心肌细胞观察到的形态特征正常（分别见图2A和图2C）。两组的心肌细胞均具有位于中心的细胞核。心肌细胞胞质中的肌纤维排列整齐有序。此外，心肌细胞之间的血管结构保持正常（分别见图2A和图2C）。

图2：在图示查看器或PowerPoint中打开

心肌细胞的形态图像。(A) 对照组。(B) DOX组（×200）。(C) ARNI组（×200）。(D) DOX+ARNI组（×200）。(E) DOX/ARNI后组（×200）。(F) DOX/ARNI后组（×200）。正常形态的心肌细胞（白色箭头所示），退化的心肌细胞（黑色箭头所示），凋亡的心肌细胞（细箭头所示），以及扩张的血管（粗箭头所示）。采用H&E染色方法。在DOX组中，心肌细胞具有位于中心的细胞核和排列整齐的肌纤维，表明其形态特征基本正常（见图2B）。然而，在某些区域也观察到细胞质膨胀、边界模糊的淡染色心肌细胞。这些细胞的肌纤维在胞质中呈现扩张且排列松散的状态。心脏组织中存在受损区域，表现为细胞碎片和间质空隙。这些区域还观察到凋亡细胞，其特征是异染色质浓缩。此外，一些心肌细胞之间的血管明显扩张，管腔内积聚了大量红细胞（见图2B）。DOX+ARNI组的心肌细胞表现出正常的形态特征（见图2D）。这些细胞具有清晰的边界、位于中心的细胞核以及胞质中排列整齐的肌纤维。心肌细胞之间的血管也保持了正常的结构（见图2D）。在DOX/ARNI后组中，大多数心肌细胞形态正常，包括位于中心的细胞核和排列整齐的肌纤维（见图2E）。尽管如此，在某些区域仍观察到细胞质膨胀、边界模糊的淡染色心肌细胞。这些细胞的肌纤维在胞质中呈现扩张且排列较为松散的状态（见图2E）。此外，还观察到具有凋亡特征的细胞（见图2E）。心肌细胞之间的血管明显扩张，许多区域的管腔内积聚了大量红细胞（见图2F）。

3.3 免疫组织化学发现

在对照组和ARNI组中，尽管GRP78的染色强度较低，但未观察到统计学上的显著差异（p>0.001）（见图3A和图3B）。在DOX组中，GRP78的染色强度与对照组和ARNI组相比显著增加（p<0.001）（见图3A-C）。在DOX+ARNI组中，GRP78的染色强度与对照组和ARNI组相似（p>0.001），但低于DOX组的染色强度（p<0.001）（见图3A,C,D）。在DOX/ARNI后组中，GRP78的染色强度与对照组和ARNI组相比显著增加（p<0.001），但与DOX组相比没有显著差异（p>0.001）（见图3A,C,E）。使用PBS代替一抗作为阴性对照（见图3F）。与DOX+ARNI组相比，DOX/ARNI组的GRP78染色强度显著增加（p<0.001）（见图4）。

图3：在图示查看器或PowerPoint中打开

心肌细胞中的GRP78染色强度。(A) 对照组。(B) DOX组。(C) ARNI组.(D) DOX+ARNI组.(E) DOX/ARNI后组.(F) 阴性对照. ×400

图4：在图示查看器或PowerPoint中打开

不同组别心肌细胞中GRP78的表达强度。X轴：GRP78表达强度；Y轴：对照组（n=8），DOX组（n=10），ARNI组（n=8），DOX+ARNI组（n=10），以及DOX/ARNI后组（n=10）。尽管对照组和ARNI组的GRP78染色强度似乎降低，但未观察到统计学上的显著差异（分别见图3A,C）。在DOX组中，GRP78的染色强度与对照组和ARNI组相比显著增加（p<0.001）（见图3B）。在DOX+ARNI组中，GRP78的染色强度与对照组和ARNI组相似（p>0.001），但低于DOX组的染色强度（p<0.001）（见图3D）。在DOX/ARNI后组中，GRP78的染色强度与对照组和ARNI组相比显著升高（p<0.001），但与DOX组相比没有显著差异（p>0.001）（见图3E）。将DOX/ARNI组与DOX+ARNI组进行比较时，发现GRP78的染色强度显著增加（p<0.001）（见图4）。

4 讨论

蒽环类药物是高效抗肿瘤药物，用于治疗多种类型的癌症。多柔比星（Daunorubicin）和DOX是最常用的蒽环类药物之一。蒽环类药物通过抑制拓扑异构酶II发挥抗肿瘤作用，该酶参与RNA和DNA的合成，并通过与铁形成复合物产生自由氧基团（ROS）。这些ROS会损害细胞膜并干扰线粒体能量代谢，导致细胞内钙离子过度流入。最终，这会导致细胞功能丧失（Shi等人，2011年）。然而，化疗引起的心脏副作用的确切机制尚未完全阐明。多项研究表明，化疗药物会对左心室功能产生负面影响（Mizia-Stec等人，2013年；Santin等人，2007年；Akam-Venkata等人，2019年），另有研究报道这些药物在细胞水平上会引起心脏和肝脏的病理变化（Cruz-Chan等人，2021年；Yamamoto等人，2013年；Jeudy等人，2012年）。有研究表明，长期使用DOX会降低抗氧化水平，同时增加脂质过氧化，从而促进心肌病的发展。在本研究中，我们旨在基于DOX的心力衰竭（HF）模型探讨DOX引起的内质网（ER）应激，并利用组织化学和免疫组织化学技术评估ARNI治疗对ER应激的潜在治疗效果。氧化损伤通过两种关键机制导致DOX引起的心肌细胞损伤：增加凋亡和加剧炎症。DOX还因胃肠道副作用（如食欲减退和呕吐）导致体重下降。据报道，急性期的体重下降可能是由于血管内液体丢失（Shaker等人，2018年）。Cowgill等人的研究表明，DOX的使用会导致体重减轻。这种体重下降与氧化应激、凋亡增加、生长失衡和血管生成失调有关（Cowgill等人，2019年）。与先前的研究一致，接受DOX治疗的大鼠体重显著下降。与DOX组相比，ARNI组和DOX+ARNI组的体重显著增加，而DOX/ARNI组则出现显著体重下降。自20世纪60年代以来，人们就观察到了DOX的心脏毒性作用，已知2.2%的DOX使用者会发展成心力衰竭（Mizia-Stec等人，2013年）。可能导致癌症患者发生DOX相关心脏毒性的风险因素包括年龄、DOX的累积剂量、已知的心脏疾病、接受过胸部放疗以及使用已知具有心脏毒性的化疗药物（Henriksen，2018年）。大量实验研究表明，DOX会对心脏组织造成损伤。Matsui等人的研究表明，DOX通过引起心肌细胞肥大和纤维化导致心力衰竭（Matsui等人，1999年）。Fadillioglu等人（2004年）从生化和显微镜角度评估了DOX引起的心脏组织损伤，发现DOX导致蛋白质氧化和脂质过氧化。电子显微镜显示DOX组的心脏组织线粒体嵴结构受损。相比之下，治疗组的线粒体嵴结构正常。Sacco等人（2001年）的研究表明，氧化损伤在细胞水平上的两个重要后果是脂质过氧化和蛋白质氧化。他们得出结论，DOX引起的心脏毒性中自由氧基团和超氧阴离子的增加可能导致细胞损伤。Balli等人（2004年）的研究显示，电子显微镜观察到DOX处理的大鼠心肌细胞中线粒体损伤、肌纤维退化和紊乱，Z线区电子密度增加。Alhazzani等人（2021年）发现DOX使用与心脏毒性有关。组织学检查显示DOX处理组存在血管周围纤维化和轻度慢性炎症。研究还报告DOX处理的大鼠心肌细胞中存在大量空泡，表明细胞发生退化。许多研究报道DOX处理动物的心肌细胞出现肌纤维丢失、胞质空泡化、凋亡和凋亡细胞核（Fadillioglu等人，2004年；Kang等人，2000年；Sacco等人，2001年）。在我们的研究中，DOX组的心肌细胞表现出膜完整性丧失、肌纤维扩张以及凋亡细胞核的存在。此外，在某些区域，心肌细胞之间的血管明显扩张，管腔内积聚了大量红细胞。ARNI是一种批准用于治疗射血分数降低的症状性心力衰竭的药物（McMurray等人，2014年）。Neprilysin是一种中性内肽酶，通过促进内源性血管活性肽（如NP、缓激肽、胰高血糖素、肾上腺髓质素和血管活性肠肽）的降解来降低其水平（Aimo等人，2021年）。一项研究探讨了ARNI在预防化疗引起的大鼠睾丸功能障碍方面的潜在益处。在化疗处理组中，睾丸组织观察到毛细血管阻塞和出血区域。生精小管中的精子生成细胞出现形状不规则的浓缩细胞核和胞质内空泡。同样，一些莱迪希细胞（Leydig cells）也显示出浓缩的细胞核。在ARNI处理组中，睾丸组织中的毛细血管、精子生成细胞和莱迪希细胞的退化程度较低（Salama等人，2020年）。Zhao等人（2024年）的研究表明，ARNI在缺血/再灌注大鼠中对心肌肥大和纤维化的保护作用优于肾脏去神经化组，从而减少了心脏重塑并提供了更好的心脏保护。文献回顾未发现关于ARNI对抗化疗引起的心脏损伤疗效的研究。在我们的研究中，ARNI组的形态变化显著少于DOX组。心肌细胞表现出正常的形态特征。心肌细胞之间的血管结构正常。DOX+ARNI组的心肌细胞退化程度低于DOX/ARNI组。许多用于癌症治疗的药物会导致ER应激，进而引发氧化应激和凋亡。DOX会导致人类心脏内质网的显著扩张。研究表明，Dox治疗后心脏组织中ER应激相关蛋白（如PERK、ATF6和CHOP）的表达水平增加（Hu等人，2019年；Gao等人，2022年；Wang等人，2022年）。研究显示，ER应激通过PERK/eIF2α/ATF4通路促进DOX引起的心脏毒性中的凋亡，调节该通路可能是一种新的干预方法（Kim等人，2022年；Zhu等人，2021年）。DOX已知会导致细胞质中GRP78（一种ER应激标志物）的积累（Chen等人，2017年）。GRP78的表达在激活导致细胞凋亡的多种通路中起作用（Hecht等人，2021年）。一项研究探讨了化疗药物的心脏副作用与GRP78激活和ER应激之间的关系，发现DOX处理组的心脏组织中有出血区域和凋亡细胞及浓缩的细胞核。免疫组织化学研究还显示DOX组心肌细胞胞质中GRP78的表达增加（Lee等人，2019年）。在本研究中，我们探讨了DOX对GRP78蛋白的潜在影响，该蛋白参与凋亡相关通路（包括IRE1、PERK和ATF6）。我们还使用化疗药物DOX诱导的心肌病模型，评估了ARNI对这些通路的治疗效果。我们发现DOX组心肌细胞胞质中的GRP78染色强度显著高于ARNI治疗组。此外，DOX+ARNI组的GRP78染色强度低于DOX/ARNI组。氧化应激在多种疾病中都起着重要作用，包括动脉粥样硬化、阿尔茨海默病和慢性阻塞性肺疾病。它还参与了DOX引起的心肌损伤（Forman和Zhang，2021年；Rawat等人，2021年）。氧化应激会触发ER应激，进一步促进ROS的形成。研究人员发现，激活蛋白精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）或抑制瞬时受体电位锚蛋白1（TRPA1）通道可以减少ROS的产生，从而减轻DOX处理的心肌细胞的损伤（Wang等人，2018年；Kim等人，2022年）。一项研究发现，血清和糖皮质激素调节激酶1（SGK1）表达的增加可以减少多西他赛（DOX）在大鼠中的心脏毒性，并且还能抑制活性氧（ROS）的产生以及内质网应激相关蛋白（如GRP78）的生成。然而，过度表达的GRP78会逆转这种对ROS和心脏毒性的抑制作用（Wang和Han 2022）。这表明内质网应激通过增加氧化应激来加剧DOX对心肌细胞的影响。Zile等人（2019年）的研究探讨了ARNI（血管紧张素受体神经肽酶抑制剂）对与心脏纤维化相关机制的生物标志物的影响，并将其效果与ACE抑制剂依那普利进行了比较。经过8个月的治疗后，研究发现ARNI降低了多种参与凋亡途径的酶的水平，包括sST2、MMP-9、TIMP-1和PINP，并且比依那普利更有效地降低了醛固酮水平。MMP-9和sST2水平的降低与住院次数减少和心力衰竭（HF）相关死亡率下降有关，而TIMP-1水平的降低则与HF相关死亡率降低有关（McMurray等人2014年）。许多研究表明，降低MMP水平可以减轻内质网应激（Ryppa等人2008年；Zaki等人2020年；Quagliariello等人2021年）。Dindas等人（2021年）报告称，通过抑制血管紧张素受体-神经肽酶通路（使用沙库比替利/缬沙坦），可以通过干扰氧化应激（TAS和TOS）、炎症（TNF-α、IL-1β、IL-6和NT-proBNP）以及caspase 3凋亡途径来缓解DOX引起的心脏毒性。在我们的研究中，我们旨在探讨ARNI对DOX引起的内质网应激的影响，结果发现，在DOX引起的心力衰竭模型中，ARNI治疗组的内质网应激显著低于DOX组。组织学评估显示，DOX会导致心脏组织发生退行性变化，而ARNI与DOX联合使用时可以显著减轻这些变化。我们推测，这种治疗效果可能是由于ARNI降低了IRE-1通路中的MMP酶水平，而IRE-1通路与内质网应激机制有关。更好地理解ARNI的作用机制及其在凋亡途径中的作用，将有助于我们更全面地认识其在心力衰竭治疗中的地位。

4.1 研究局限性
我们的研究存在一些局限性。首先，没有进行超声心动图和血流动力学检查；其次，我们没有研究凋亡途径；第三，我们没有评估心肌细胞中的线粒体功能。

5 结论
总之，本研究结果表明，同时使用ARNI和DOX可以显著减轻心肌细胞的退行性和内质网应激。与DOX/ARNI治疗后GRP78染色水平升高相比，DOX+ARNI组中GRP78染色水平的降低强调了给药时机的关键性。这些结果与先前强调氧化应激和内质网功能障碍在DOX引起的心脏毒性中起作用的研究一致。这些研究还提出，早期使用ARNI可以在细胞损伤不可逆之前减轻这些效应。因此，ARNI不仅是一种针对心力衰竭的症状治疗方法，而且可能是预防蒽环类药物引起的心肌病的潜在策略。建议进行二期和三期研究，以评估ARNI在临床管理心力衰竭中的疗效，特别是评估其在接受DOX治疗的癌症患者中减少DOX潜在心脏毒性副作用的作用，以及评估其心脏保护效果。

资金支持
本研究得到了梅尔辛大学科学研究项目组（2019-3-TP2-3718）的资助。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究结果的数据可在合理请求下从通讯作者处获得。