单细胞成像分析、治疗建模及Ib期临床试验验证BCL-2作为异质性去势抵抗性前列腺癌的治疗靶点

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Single-cell imaging analysis, therapeutic modeling and a Phase Ib trial validate BCL-2 as a target across heterogeneous castration-resistant prostate cancer

　　

摘要：BCL-2已被证实与前列腺癌(PCa)的进展及去势抵抗性疾病(CRPC)的发生有关；然而，BCL-2及雄激素受体(AR)表达的PCa细胞群体在PCa病程连续体中的演化规律、AR如何分子调控BCL-2，以及BCL-2是否可作为异质性CRPC的通用治疗靶点，目前仍不明确。本研究首先展示了AR通路抑制剂(ARPIs)对BCL-2的选择性诱导作用。基于Vectra的定量多重免疫荧光(qmIF)及图像流式细胞术(IMC)分析显示，在患者PCa及异种移植模型中，CRPC阶段BCL-2+（AR+或AR-）PCa细胞显著增加。机制研究表明，AR通过多个AR结合位点(ARBS)抑制BCL-2转录，而ARPIs可解除这一抑制。细胞、类器官及异种移植模型的治疗研究证实，BCL-2是多种CRPC亚型共有的脆弱性靶点。一项结合恩杂鲁胺(Enza)与BCL-2抑制剂Venetoclax的Ib期临床试验(NCT03751436)表明，应答患者的循环肿瘤细胞减少。综上所述，通过整合高内涵单细胞水平成像分析、机制研究、广泛的临床前治疗实验及Ib期临床试验，本研究阐明了AR+/-BCL-2+/-PCa细胞亚群的动态变化，确立了BCL-2作为异质性CRPC的重要治疗靶点。

论文解读：BCL-2在异质性去势抵抗性前列腺癌中的靶向治疗价值验证

研究背景与立论依据

前列腺癌(PCa)是男性高发恶性肿瘤，去势抵抗性前列腺癌(CRPC)尤其是转移性CRPC(mCRPC)预后极差。尽管雄激素剥夺疗法(ADT)联合AR通路抑制剂(ARPIs)如恩杂鲁胺(Enza)是一线治疗方案，但肿瘤异质性与谱系可塑性导致的治疗抵抗仍是临床难题。既往研究表明，BCL-2作为促存活因子与PCa进展相关，但其在AR异质性背景下（如AR^+/hi、AR^cyto、AR^-/lo亚型）的动态调控机制、跨亚型治疗潜力及临床转化证据尚不明确。为此，研究人员通过多组学技术整合、临床前模型构建及Ib期临床试验，系统解析BCL-2在CRPC演进中的关键作用。

关键技术方法

研究采用Vectra定量多重免疫荧光(qmIF)和成像质谱流式(IMC)进行单细胞分辨率的空间表型分析；利用转录组测序(RNA-seq)和染色质免疫共沉淀(ChIP)技术解析AR对BCL-2的转录调控；构建LNCaP、LAPC9、VCaP、LAPC4四种AD/AI异种移植模型及类器官模型评估治疗敏感性；纳入25例CRPC患者样本及NCT03751436临床试验数据验证靶点临床相关性。

研究结果解析

BCL-2在去势过程中被选择性且一致地诱导

通过对正常前列腺上皮细胞亚群、422例未经治疗的原发性PCa(TCGA-PRAD)及4个经治患者数据集的分析发现，BCL-2mRNA在正常前列腺管腔祖细胞(LP)和基底细胞中高表达，且在高级别PCa中随Gleason评分升高呈上升趋势。在三个新辅助ADT(nADT)数据集和一个Enza耐药mCRPC数据集中，BCL-2是唯一被共同且持续诱导的BCL-2家族成员。单细胞RNA测序(scRNA-seq)进一步显示，CRPC样本中BCL-2mRNA水平显著高于原发性PCa。在4种CRPC异种移植模型中，Western blot定量证实BCL-2蛋白在3/4模型中上调，而其他家族成员（BCL-xL、MCL-1等）呈现模型依赖性变化。

治疗初治原发性前列腺肿瘤主要由AR⁺BCL-2^-PCa细胞构成

qmIF分析显示，良性前列腺组织中BCL-2⁺细胞主要位于基底细胞层，AR⁺细胞位于管腔层，两者呈显著负相关(R=-0.74)。未经治疗的原发性PCa中，AR⁺BCL-2^-细胞成为优势群体，而BCL-2⁺细胞比例显著降低，BCL-2mRNA水平低于良性组织。细胞亚型分析表明，原发性PCa中AR⁺BCL-2^-细胞占比最高，其次是AR^-BCL-2^-细胞。

去势驱动PCa细胞异质性并在患者CRPC中上调BCL-2⁺PCa细胞

对25例CRPC样本的分析显示，原发性PCa中AR与BCL-2的负相关关系在CRPC中消失。与原发性PCa相比，CRPC中AR^-BCL-2⁺细胞比例显著增加至约50%，同时AR⁺BCL-2⁺细胞也明显增多。空间分布上，CRPC中出现类似LAPC4-AI的AR^cytoBCL-2⁺细胞和类似VCaP-AI的AR^cytoBCL-2^-细胞，提示肿瘤微环境异质性。

异种移植瘤中AR^+/-BCL-2^+/-PCa细胞亚群的去势诱导动态变化重现患者CRPC特征

通过qmIF和IMC对4种AD/AI异种移植模型分析发现：LNCaP-AI（1°/2° CRPC）以AR^+/hiBCL-2^+/hi为主；LAPC9-AI以AR^-/loBCL-2^+/hi为特征；LAPC4-AI表现为AR^cytoBCL-2⁺表型；VCaP-AI则主要为AR^cytoBCL-2^-/lo。这些亚型分布与患者CRPC样本高度吻合，验证了模型系统的临床代表性。

构建去势/恩杂鲁胺耐药LAPC4培养模型以模拟AR^cytoBCL-2⁺表型

通过在CDSS培养基中长期培养LAPC4细胞并逐步增加Enza浓度，成功建立LAPC4-CR和LAPC4-Enza-R耐药模型。耐药亚系呈现间质样形态，增殖速率减慢，且对Enza敏感性降低。Western blot和IF分析显示，耐药细胞中AR从核内重新分布至胞质，BCL-2蛋白表达上调并与线粒体共定位，形成AR^cytoBCL-2⁺表型。

BCL-2mRNA水平与AR活性持续负相关

多队列临床数据分析表明，在3个nADT队列和1个Enza耐药mCRPC队列中，BCL-2mRNA水平与AR活性(AR-A)呈显著负相关，而其他BCL-2家族成员无此一致性关联。体外实验中，LNCaP细胞经CDSS去势处理后，AR信号（PSA、FKBP5）下调伴随BCL-2蛋白及mRNA上调；外源性DHT(1 nM)处理可剂量依赖性地抑制BCL-2转录。

AR直接结合BCL-2基因组位点抑制其转录

生物信息学预测结合ChIP-qPCR验证发现，AR可直接结合BCL-2基因座的7个AR结合位点(ARBS)，其中ARBS1-3在LNCaP-AI模型中结合显著减弱。在LNCaP、LAPC9、VCaP三种AI模型中，AR结合能力下降与BCL-2mRNA上调呈正相关，证实AR通过占据转录抑制位点直接调控BCL-2表达。

讨论与结论

该研究通过单细胞空间组学技术首次系统描绘了CRPC演进过程中AR与BCL-2表达谱的动态互作规律，阐明AR通过直接结合BCL-2基因座抑制其转录的分子机制。临床前模型证实BCL-2是跨越AR^+/hi、AR^cyto、AR^-/lo等多种CRPC亚型共有的治疗脆弱点。Ib期临床试验(NCT03751436)数据显示，Enza联合Venetoclax可降低应答患者循环肿瘤细胞计数，为克服ARPI耐药提供了新型联合策略。研究成果发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，为异质性CRPC的精准靶向治疗提供了重要理论依据与临床转化路径。