与启动子相关的lncRNA pancEIF4G3调控猪早期胚胎中的基因组激活

《Theriogenology》：Promoter-associated lncRNA pancEIF4G3 regulates embryonic genome activation in porcine early embryos

　　**田耀河|卢慧琴|张晨源|张善龙|李涵|张世超|刘东松|朱彦龙|孙景涛|王家强|刘中华|金俊学**
**黑龙江省动物细胞与遗传工程重点实验室，东北农业大学生命科学学院，哈尔滨，150030，中国**

**摘要**
在猪早期胚胎发育过程中，长链非编码RNA（lncRNA）在胚胎基因组激活（EGA）中发挥着重要的调控作用。然而，启动子相关lncRNA是否在EGA中发挥关键功能及其潜在的调控机制在猪中仍很大程度上不清楚。在本研究中，我们鉴定了一种在猪胚胎4细胞阶段高表达的启动子相关长链非编码RNA，并将其命名为pancEIF4G3。pancEIF4G3是一种核定位的lncRNA，缺乏蛋白质编码能力，其表达模式与其邻近基因EIF4G3相似。研究发现，干扰pancEIF4G3或EIF4G3会导致猪胚胎在4细胞阶段发育停滞，表明它们在早期胚胎发生中起着关键作用。进一步的研究表明，pancEIF4G3位于EIF4G3的上游，通过结合OGG1来调节其RNA和蛋白质的表达水平。下调pancEIF4G3和EIF4G3会导致染色质可及性降低、新生RNA合成减少以及多个EGA标志基因和核心转录因子的显著下调。总之，本研究首次揭示了在猪早期胚胎中，启动子相关lncRNA pancEIF4G3通过调节翻译起始因子EIF4G3的表达来影响胚胎基因组激活的过程。这一发现丰富了猪早期胚胎发育的调控网络，并为优化体外胚胎培养和繁殖技术提供了潜在的分子靶点。

**引言**
猪体外胚胎生产（IVP）技术对于提高繁殖效率、推进遗传育种和生成转基因猪至关重要。然而，其应用受到体外胚胎培养（IVC）效率低下的限制，而IVC是这一过程的核心步骤。研究IVC的调控因素不仅可以提高养猪业的生产力，还可以为农业育种和创建用于器官捐献猪的转基因猪模型提供重要支持[1]。在这些因素中，胚胎基因组激活（EGA）的失败往往是导致IVC胚胎发育效率低下的关键因素。EGA是早期胚胎发育中的一个关键事件，标志着从母体控制向合子控制的转变，它是进一步胚胎发育的基础。越来越多的证据表明，长链非编码RNA（lncRNA）是早期胚胎发育中的重要调控因子。通过复杂的调控机制，如转录（MERVL、LINE1）[2]、[3]、[4]、表观遗传（XIST、Airn）[5]、[6]、[7]和RNA干扰（GAS5、CircRNA1572）[8,9]，lncRNA在胚胎分裂[10]、[11]、[12]、多能性获得[13,14]、细胞命运决定[15]和分化[10,16,17]等过程中发挥关键作用，并且在调节EGA中至关重要[18,19]。

lncRNA通过多种方式调节EGA过程。研究表明，lncRNA可以直接调节EGA基因的转录。例如，内源性逆转录病毒（MuERV-L）和猪相关lncRNA（lncFKBPL）通过启动子或增强子机制激活相邻基因，从而驱动EGA和胚胎发育[20]、[21]、[22]。敲低lncR-3363会导致核小体组装相关基因下调和多个EGA基因（如Dux和Zscan4家族）的异常表达[22]。此外，lncRNA通过调节染色质开放性来调节EGA过程[23,24]。在小鼠早期胚胎中，抑制LINE-1的激活会导致胚胎发育率降低，伴随全局染色质可及性下降和EGA效率降低[4]。进一步地，lncRNA通过细胞周期蛋白来调节EGA[25,26]。小鼠中的miR-290家族负调控细胞周期抑制剂p21，协同作用以促进EGA的及时激活并维持胚胎发育潜力[27]。猪精子来源的circRNA通过miRNA海绵机制调节CCNB2的表达，从而影响早期胚胎发育和EGA[9]。此外，lncRNA还可以通过信号通路调节EGA。LincGET和SAWPA通过调节JNK-MAPK信号通路在小鼠和猪中介导胚胎基因组激活[11,18]。XLOC-040580由TPRA1调控，在猪EGA阶段特异性表达，并通过影响细胞周期、转录调控和代谢过程来影响EGA[19]。lncRNA还调节表观遗传修饰因子，例如lnc_3712抑制KDM5B的表达，阻碍核重编程[28]。这些发现为lncRNA在EGA期间的调控机制提供了重要参考。尽管已经研究了多种lncRNA的调控机制，但大多数研究集中在小鼠早期胚胎发育上，而lncRNA在猪早期胚胎发育中的功能机制，特别是在EGA期间的机制仍不清楚，需要进一步探索。

**pancRNA**
pancRNA被定义为起源于伴侣基因转录起始位点（TSS）上游几千碱基范围内并以相反方向转录的转录本，是单拷贝lncRNA中最丰富的亚型之一[29]、[30]、[31]。通常，pancRNA作为顺式调控元件，通过调节表观遗传修饰、转录等过程来激活或抑制伴侣基因的转录[32,33]。pancRNA在胚胎发育（pancIl17d、GATA6-AS1）[32,34,35]、组织和器官分化（BASP1-AS、lncKdm2b）[36,37]以及癌症（pancRNA_CCND1、FOXCUT）[38]、[39]、[40]、[41]中发挥重要作用。在胚胎发育背景下，pancIl17d通过招募TET3维持小鼠2细胞胚胎中Il17d启动子的低甲基化，促进胚胎发育。GATA6-AS1通过形成RNA-DNA三链体招募SMAD2/3来激活GATA6表达，驱动内胚层分化[35]。类似地，yylncT抑制DNMT3B，维持Bra基因的低甲基化并促进中胚层分化[42]。这些结果表明，pancRNA通过组蛋白修饰来调节关键发育基因的表达，表明它们在早期胚胎发育中的调控作用。

**机制方面**
pancRNA通过多种方式调节相邻基因的转录。在表观遗传调控方面，pancRNA（panciL7d）可以与TET3和PARP等蛋白质合作诱导CpG岛去甲基化和激活，或招募PRC2复合体催化H3K27me3，导致基因沉默[34]。在染色质构象调控方面，pancRNA作为支架招募介质复合体，促进增强子-启动子环化和转录激活。例如，BASP1-AS、lncKdm2b和pancNusap1通过调节染色质开放性和增强组蛋白乙酰化来促进神经元分化[36,37,43]。相反，pancRNA可以与FUS、Sam68和DHX9等RNA结合蛋白形成抑制性或激活性复合体。宫颈癌和Ewing肉瘤中的pancRNA_CCND1与FUS或Sam68/DHX9复合体结合，抑制Cyclin D1的转录[38]。此外，pancRNA可以与DNA形成R-loop结构，防止DNA甲基化，招募去甲基化酶并促进基因表达[44]、[45]、[46]。例如，LncRNA VIM-AS1通过R-loop维持局部染色质构象，允许NF-κB通路转录因子的招募并激活VIM转录[45]。尽管lncRNA在猪早期胚胎发育和EGA调节中的作用尚不清楚，但这些pancRNA的调控机制为探索EGA调节提供了新的视角。

目前，关于猪早期胚胎发育的分子调控机制的研究仍面临许多挑战，特别是在长链非编码RNA（lncRNA）在此过程中的作用方面仍不清楚。是否存在调控EGA的启动子相关lncRNA仍未知。在本研究中，通过随机引物筛选，我们鉴定了一种位于EIF4G3上游并以相反方向转录的lncRNA，命名为pancEIF4G3。pancEIF4G3在4细胞阶段高表达。敲除pancEIF4G3或EIF4G3会导致胚胎在4细胞阶段发育停滞。进一步分析表明，pancEIF4G3调节其伴侣基因EIF4G3的RNA表达水平。功能上，pancEIF4G3和EIF4G3的缺失会损害EGA，导致EGA关键基因和新生RNA的水平降低，并影响染色质开放性。这些结果表明，pancRNA在猪早期胚胎发育的EGA期间起调控作用，为猪胚胎发育的理论框架提供了新的见解。此外，本研究为优化家畜和家禽繁殖技术提供了理论基础，并为改进胚胎培养系统和提高克隆胚胎发育效率提供了潜在靶点。

**部分摘要**
引物和探针设计
引物使用PrimerPremier5（表S1）设计，并由中国北京基因组研究所合成（北京）。

**抗体**：以下抗体用于Western blot和IF检测：β-ACTIN（#sc47778；Santa Cruz）、anti-EIF4G3（#11281-1-AP；Proteintech）。

**胚胎培养和收集**
从当地屠宰场收集猪卵巢，并在37°C的生理盐水中运输。到达实验室后，用预热的（37°C）生理盐水清洗卵巢。

**pancEIF4G3**
pancEIF43是一种启动子相关的、在4细胞阶段高表达的、核定位的lncRNA。

**先前研究**
先前的研究表明，SINE相关lncRNA在猪早期胚胎发育的EGA阶段发挥着重要的调控作用[18]。因此，为了筛选早期猪胚胎发育中的EGA和启动子相关lncRNA，我们使用半随机引物扩增并筛选了4细胞阶段胚胎（EGA阶段）中的SINE相关lncRNA。通过pMD-18 T载体连接和测序鉴定出未知转录本，并通过...（原文此处内容不完整）。

**讨论**
在本研究中，我们鉴定了一种新的pancRNA，命名为pancEIF4G3。它是一种启动子相关的长链非编码RNA（lncRNA），在猪早期胚胎发育的胚胎基因组激活（EGA）中发挥关键作用。我们的结果表明，pancEIF4G3在4细胞阶段高表达并达到峰值，定位于细胞核内，通过结合OGG1来调节其相邻蛋白质编码基因EIF4G3的转录，从而确保适当的胚胎基因组激活。敲低pancEIF4G3或EIF4G3会导致胚胎在4细胞阶段发育停滞，伴随染色质可及性降低...

**作者贡献声明**
田耀河：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、方法学、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。
卢慧琴：验证、方法学、研究。
张晨源：方法学、研究。
张善龙：验证、方法学、研究。
李涵：验证、方法学、研究。
张世超：方法学、研究。
刘东松：方法学、研究。
朱彦龙：方法学、研究。
孙景涛：方法学、研究。

**数据可用性声明**
没有数据存放在官方存储库中。所需数据可应要求提供。

**资助**
本工作得到了中国国家自然科学基金（32402761、32372884）、CPSF博士后奖学金计划（GZB20240132）、中国博士后科学基金会（2025T180067）和黑龙江省自然科学基金（QC2025C008）的支持。

**利益冲突**
作者声明在本研究中不存在利益冲突。

**致谢**
我们感谢黑龙江省动物细胞与遗传工程重点实验室的所有成员的帮助，同时感谢东北农业大学的张一伟博士对实验数据分析的贡献。