Foxp3驱动环境依赖性的表观遗传程序以定义调节性T细胞分子特性与功能

《Science Immunology》：Foxp3 drives context-dependent epigenetic programs that define regulatory T cell molecular identity and function

　　

调节性T细胞（Treg细胞）表达关键转录因子Foxp3，并显示出独特的表观遗传景观，确保了Treg细胞特异性的基因表达和稳定的抑制功能，然而Foxp3对此表观遗传特性的贡献仍不清楚。研究人员利用Foxp3转导的常规T细胞作为小鼠体内的功能获得性探针，鉴定出一个先前未被识别的亚群，该亚群获得了内源性Foxp3表达、类似Treg细胞的转录组和染色质特征以及抑制功能，且这些现象仅在体内发生。这些Foxp3驱动的特征在Treg细胞中保守，但在Foxp3突变的Treg样细胞中受损，证明了Foxp3的必要性。体内诱导内源性Foxp3表达需要降低的AKT-mTOR信号传导以及Foxp3依赖性的STAT5和核因子κB（NF-κB）参与。时序染色质图谱揭示了逐步的Foxp3驱动调控程序，包括一个在所有Treg细胞亚群中共享的核心程序以及效应器特异性程序，这两者均与NF-κB活性和Foxp3结合相关。因此，Foxp3整合了细胞内在和环境背景以驱动定义Treg细胞特性和功能的表观遗传程序，这对基于Foxp3的疗法具有启示意义。

Foxp3驱动调节性T细胞表观遗传身份建立的机制研究解读

调节性T细胞（T_reg细胞）是免疫耐受的关键调节者，其谱系稳定性依赖于转录因子Foxp3及独特的表观遗传景观。尽管已知Foxp3是T_reg细胞的主控调节因子，但其是否足以建立T_reg细胞特异性的表观遗传特征长期以来存在争议。早期体外研究表明，将Foxp3转导至常规T细胞（T_conv细胞）仅能诱导有限的转录变化，且无法诱导Foxp3基因座保守非编码序列2（CNS2）的去甲基化，导致学界普遍认为Foxp3仅是既有表观遗传环境下的转录执行者，而非重塑者。此外，T_reg细胞群体本身具有异质性，包含中心T_reg（cT_reg）细胞和效应T_reg（eT_reg）细胞等不同亚群，其表观遗传身份的建立机制尚不完全清楚。为了厘清Foxp3在染色质重塑中的确切作用，研究人员设计并实施了一系列体内外实验，相关成果发表在《Science Immunology》上。

在研究技术层面，研究人员主要采用了Foxp3逆转录病毒（RV）转导系统，将Foxp3或对照病毒转导至来自Foxp3^hCD2报告基因小鼠的na?ve T细胞（T_n细胞），并将其过继转移至Rag1^?/?受体小鼠体内。通过流式细胞术（FCM）分选不同的转导细胞群体，结合RNA测序（RNA-seq）、针对转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）以及重亚硫酸氢盐测序进行表观遗传和转录组分析。同时，研究整合了单细胞多组学（scMultiome）数据及Foxp3染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）数据，并利用CRISPR-Cas9基因编辑、显性负性抑制突变体及mTOR抑制剂处理等手段进行了机制验证。

研究结果

A subset of Foxp3-transduced T cells acquires T_regcell–like transcriptomic and epigenetic features in vivo

研究人员发现，在体内环境中，一部分Foxp3转导的T细胞能够诱导内源性Foxp3表达（endoFoxp3⁺）。与体外培养结果不同，这些细胞不仅在转录组水平上调了Ctla4、Il2ra等T_reg标志物，下调了Ifng等促炎因子，更重要的是在表观遗传层面表现出T_reg细胞特征，包括Foxp3基因座CNS2区域的低甲基化以及特定的染色质开放区域（OCRs）的可及性增强，表明Foxp3能在体内驱动正向自调节回路。

Foxp3-driven chromatin and transcriptional programs operate similarly in endoFoxp3⁺T cells and T_regcells

通过比较野生型（WT）T_reg细胞与Foxp3功能缺失突变（R397W或KO）的T_reg样细胞，研究人员证实在endoFoxp3⁺细胞中观察到的染色质和转录变化与T_reg细胞中的Foxp3依赖性程序高度保守。单细胞数据分析进一步显示，这些Foxp3驱动的染色质程序对应于T_reg细胞中的cT_reg和Helios⁺eT_reg亚群状态。

EndoFoxp3⁺cells mediate suppressive functions of Foxp3-transduced T cells

功能实验表明，endoFoxp3⁺细胞是介导抑制功能的关键亚群。在体外抑制实验中，只有该亚群能有效抑制效应T细胞的增殖。在T细胞转移诱导的结肠炎模型中，通过白喉毒素（DT）特异性清除endoFoxp3⁺细胞会导致严重的体重下降和结肠炎症，证实了其在体内的病理保护作用及长期稳定性。

Limited contribution of endogenous Foxp3 protein to the functional competence of endoFoxp3⁺T cells

利用Foxp3^KO:hCD2骨髓嵌合体模型，研究发现虽然内源性Foxp3蛋白对某些表面标志物（如CTLA-4）的表达有促进作用，但对于endoFoxp3⁺细胞的核心表观遗传特征（如TSDR去甲基化）及体内抑制结肠炎的功能并非必需。这表明外源性Foxp3结合体内环境已足够赋予细胞功能活性。

Reduced AKT-mTOR activity enables Foxp3-dependent endoFoxp3induction in vivo

机制探索发现，体内与体外环境的关键差异在于AKT-mTOR信号通路活性。体内微环境中较低的AKT-mTOR活性（表现为磷酸化AKT和4EBP1水平降低）是诱导内源性Foxp3的必要条件。体外实验证实，使用雷帕霉素（rapamycin）或Torin1抑制mTOR，或在低剂量IL-2条件下培养，均可促进Foxp3转导细胞诱导内源性Foxp3，而组成性激活AKT（caAKT）则会阻断这一过程。

STAT5 and NF-κB are required for Foxp3-dependent endoFoxp3induction

进一步机制研究表明，Foxp3通过依赖信号转导和转录激活因子5（STAT5）及NF-κB来启动内源性Foxp3转录。染色质分析显示，Foxp3启动子区域富含NF-κB和FKH motif。利用显性负性IκBα（dnIκBα）阻断NF-κB核易位，或通过CRISPR敲除Rel和Rela，均显著损害了内源性Foxp3的诱导。同时，利用miRNA敲低Stat5a/b或使用缺乏关键增强子（CNS0或CNS3）的小鼠模型，也证实了STAT5和NF-κB分别通过CNS0和CNS3对Foxp3转录的必要性。

Stepwise Foxp3-driven chromatin remodeling at Foxp3-induced OCRs

时序分析揭示了Foxp3驱动的染色质重塑是分步进行的。早期开放区域（如D3亚群）包括Foxp3启动子，在转移后第7天即可见；而晚期开放区域（如D2亚群，包含CNS2）则在第23天才完全形成。这表明Foxp3首先建立核心表观程序，随后发展出效应器特异性程序。

Distinct Foxp3-driven cis-regulatory programs are associated with NF-κB and AP-1 activity and Foxp3 binding

motif富集分析和单细胞投影显示，核心程序（D3）与NF-κB活性相关，且在cT_reg和eT_reg中共享；而效应器特异性程序（D1/D2）则与AP-1（特别是BATF）及IRF复合元件（AICEs）相关，主要在Helios⁺eT_reg细胞中富集。这些区域也与Foxp3的ChIP-seq峰高度重叠，证实了Foxp3的直接调控作用。

讨论与结论

本研究通过Foxp3转导系统提供了功能获得性证据，确立了Foxp3不仅是转录执行者，更是T_reg细胞表观遗传身份的关键驱动因子。研究阐明了一个精确的环境整合模型：体内较低的AKT-mTOR活性为Foxp3诱导内源性Foxp3创造了许可环境，随后Foxp3通过与STAT5和NF-κB协同作用，启动其自身的转录并形成正向自调节回路。这种染色质重塑是一个动态、分阶段的过程，从建立核心cT_reg特征逐步过渡到eT_reg特异性程序，且与AP-1家族成员（如BATF）的合作密切相关。这些发现解决了领域内关于Foxp3能否主动重塑表观遗传的长期争论，并为基于Foxp3工程化T细胞的免疫治疗策略提供了重要的理论依据，提示在特定的免疫抑制环境下，即使在内源性Foxp3蛋白功能受损的情况下，外源性Foxp3仍可能通过驱动表观遗传重编程发挥治疗作用。