两种商用qPCR试剂盒在检测钩端螺旋体（Leptospira spp.）方面的诊断性能评估 安德烈斯·埃斯特万·巴拉甘-佩尼亚（Andrés Esteban Barragán-Pe?a） 达尔文·帕雷德斯-努涅斯（Darwin Paredes-Nú?ez） 法比奥拉·希门尼斯·巴伦苏埃拉（Fabiola Jimenez Valenzuela） 索隆·阿尔贝托·奥兰多（Solon Alberto Orlando） 埃尔西·卡瓦哈尔（Elsy Carvajal） 安赫尔·塞巴斯蒂安·罗德里格斯-帕兹米尼奥（Angel Sebastian Rodriguez-Pazmi?o） 米格尔·安赫尔·加西亚-贝雷吉安（Miguel Angel Garcia-Bereguiain）

《Tropical Medicine and Infectious Disease》：Diagnostic Performance of Two Commercial qPCR Kits for Leptospira spp. Detection Andrés Esteban Barragán-Pe?a, Darwin Paredes-Nú?ez, Fabiola Jimenez Valenzuela, Solon Alberto Orlando, Elsy Carvajal, Angel Sebastian Rodriguez-Pazmi?o and Miguel Angel Garcia-Bereguiain

摘要
早期确认钩端螺旋体病对于及时进行抗菌治疗至关重要，据报道，基于PCR的诊断方法在症状出现后的第一周内具有很高的敏感性。我们评估了两种商用实时PCR试剂盒——Viasure Leptospira Real-Time PCR（Certest Biotec，西班牙）和Genesig Advanced Leptospira spp.（Primerdesign，英国）的诊断性能，并以针对lipL32的院内qPCR试剂盒作为参考方法。我们对235份在临床表现为钩端螺旋体病急性期采集的人类EDTA血液样本进行了回顾性比较评估。院内qPCR参考试剂盒检测出55份阳性样本和180份阴性样本，两种商用试剂盒均准确分类了所有样本，实现了100%的敏感性（95%置信区间：93.5–100）、100%的特异性（95%置信区间：98.0–100）和100%的总体准确性。总之，这两种商用qPCR试剂盒能够高效检测人体血液样本中的致病性钩端螺旋体。

1. 引言
钩端螺旋体病是全球范围内最广泛的动物源性疾病之一[1,2,3]。该病由钩端螺旋体属的致病性螺旋体感染引起，这些螺旋体寄生于各种哺乳动物（如老鼠、家畜、狗和野生动物）的肾小管中，并通过尿液排出[1,2]。人类主要通过接触被感染动物尿液污染的土壤和水源而感染。钩端螺旋体在温暖潮湿的环境中可以存活数周，导致该疾病在热带和亚热带地区广泛传播[3]。钩端螺旋体病的全球影响显著，估计每年约有100万例重症病例和近6万人死亡[1,3,4]。然而，由于许多地方诊断能力有限和报告不足，这些数字可能被低估了。发病率在热带国家最高，通常也出现在低收入和中等收入地区[1,2,3,4]。高风险群体包括自给农民、贫民窟居民、污水处理厂和屠宰场工人、矿工以及与动物宿主或受污染环境有密切接触的人[1,5,6]。环境和气候因素起着越来越重要的作用：大雨和洪水反复与钩端螺旋体病暴发相关，因为它们会传播细菌并增加人类接触机会[1,5,6]。气候变化、快速城市化（特别是在卫生条件差且啮齿动物众多的地区）以及人口增长共同构成了这一重新出现的威胁，凸显了钩端螺旋体病的“完美风暴”，这突显了“同一健康”（One Health）的重要性[1,7,8,9]。
钩端螺旋体病的临床表现差异很大，且常常是非特异性的，这使得诊断变得困难[1,2,3,4]。症状可以从轻微的类似流感的症状到涉及多个器官的严重形式（称为魏尔病，表现为黄疸、肾衰竭和出血）[1,2,3,4]。早期症状（发热、头痛、肌肉疼痛、恶心）与其他许多急性发热性疾病（登革热、疟疾和流感）相似，导致经常被误诊[1,2,3]。如果医疗人员没有根据暴露史保持高度怀疑，适当的治疗可能会被延迟[1,3,10]。这一点至关重要，因为早期开始抗生素治疗可以降低出现严重并发症的风险。在重症病例中，病死率可能超过10%，而治疗延迟会加剧这一风险[1,3,10]。
在实验室中诊断钩端螺旋体病一直很困难，尤其是在资源匮乏的环境中。传统的金标准是显微镜凝集试验（MAT），该试验可以检测针对活钩端螺旋体的抗体。尽管它能特异性地确认钩端螺旋体暴露，但MAT提供的血清型信息受到交叉反应的显著影响[11]。此外，MAT在急性期的敏感性较低，需要繁琐的滴度测定程序才能显示出抗体上升趋势。此外，MAT是一项劳动密集型测试，需要维持多种钩端螺旋体血清型的活菌株和训练有素的人员[2,10,11,12]。实际上，MAT通常只在参考实验室可用，因此通常使用IgM ELISA或快速测试。然而，这些方法在早期阶段的敏感性较低，并且存在交叉反应导致的假阳性风险[11,12,13]。从血液或尿液中培养细菌是可行的，但过程缓慢，需要数周到数月的时间，且不敏感，在临床实践中很少有帮助[11,12]。总体而言，依赖“传统”的血清学方法导致许多早期病例未被发现，治疗被延迟，从而导致这种被忽视的疾病持续被低估和临床管理不善[1,2,3,4,10]。
近年来，在改进诊断方面取得了显著进展。基于PCR的测试可以在急性期（通常在24-48小时内）确认钩端螺旋体病，比血清学方法快得多，并能实现早期干预[10,14]。大量研究表明，当优化得当时，针对临床样本的PCR具有高敏感性和特异性[11,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26]。已经开发了针对多个基因靶点的PCR检测方法，例如外膜脂蛋白基因lipL32，该基因在致病性钩端螺旋体的P1亚群中高度保守，使其成为非常特异的诊断靶点，也是商用试剂盒和院内协议中最常用的。其他更特异于P2亚群（以前称为“中间型”钩端螺旋体）的基因也被使用，如secY[15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26]。这种管家基因secY在钩端螺旋体中广泛分布，可用于检测P1和P2亚群，而rrs（16S）则具有最广泛的包容性，但代价是降低了针对致病性菌株的特异性[18,19,20,21,22,23,24,25,26]。
在厄瓜多尔等地方性疾病的背景下，有商用PCR试剂盒可用于检测人体样本中的钩端螺旋体，尽管关于其临床性能的信息通常仅限于制造商在用户手册中的声明。因此，本研究旨在分析两种商用实时PCR试剂盒（Certest Biotec的Viasure Leptospira Real-Time PCR和Primerdesign的Genesig Advanced Leptospira spp.）在厄瓜多尔用于基于lipL32基因标记的钩端螺旋体感染的诊断的临床性能。

2. 方法学
2.1. 研究设计
本研究采用回顾性比较评估方法，使用了之前通过qPCR检测过钩端螺旋体的EDTA全血样本。共有235份样本被纳入研究，这些样本来自厄瓜多尔私人实验室采集的疑似钩端螺旋体病的发热患者。所有血液样本最初在2023年和2024年进行常规临床检测，并直接储存在-20°C直至进一步分析。分析在2025年进行，因此样本的储存时间从6个月到最长2年不等。在这235份样本中，根据参考标准有85份为阳性，150份为阴性（lipL32/secY/rrs阴性）。这些阴性样本中包括25份登革热病毒阳性和4份布鲁氏菌阳性样本。
使用厄瓜多尔瓜亚基尔国家公共卫生与研究所验证的参考qPCR协议的数据，计算了敏感性（SE）、特异性（SP）、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）、总体一致率（OPA）以及似然比，并给出了95%的置信区间。这些计算使用R软件版本2024.4.2764.1进行，通过Posit平台访问。

2.2. DNA提取
本研究使用的所有商用qPCR试剂盒以及参考方法都进行了DNA提取。所有提取均使用QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN，荷兰文洛）。从每个临床样本中提取200 μL的DNA，并用100 μL的洗脱缓冲液进行洗脱。

2.3. 钩端螺旋体检测的参考qPCR协议
该协议基于lipL32、rrs（16S）和secY基因的实时扩增和检测[22]；同时，β-actin也被用作DNA提取的质量控制。secY基因的特异性序列用HEX荧光染料标记，lipL32和rrs（16S）基因用FAM标记。β-actin基因的特异性序列用Cy5荧光染料标记（序列详情见补充表S1）。该院内协议使用一组双链引物：Duplex 1：β-actin（Cy5）+ lipL32（FAM）；Duplex 2：secY（HEX）+ rrs（16S）（FAM）。扩增在Bio-Rad CFX96实时系统（BioRad，美国华盛顿州伍丁维尔）上进行。PCR反应在最终体积为15 μL的体系中进行，包含：1X TaqManTM Fast Advanced Master Mix（Applied Biosystems，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）、每种引物0.2 μM和0.13 μM的内控探针。作为模板，使用5 μL的基因组DNA和0.9 μL的无DNase和RNase的超纯水。PCR条件如下：初始变性95°C 2分钟，随后进行45个循环，每个循环包括95°C 5秒（变性）和60°C 35秒（杂交和延伸）。每个双链反应还包括提取阴性对照和无模板对照（NTCs）。建议对每个qPCR系列运行一个阳性对照反应。如果协议正确应用且试剂使用得当，对于一系列qPCR反应来说，阳性对照的预期定量循环（Cq）值必须小于30。对于一般样本，补充表S2提供了基于获得的Cq值的结果解释。

2.4. Viasure Leptospira Real Time PCR检测试剂盒（RUO）
Certest Biotec开发了一种定性实时PCR测试，用于检测疑似人类钩端螺旋体病患者的临床样本中的钩端螺旋体DNA。VIASURE Leptospira Real-Time PCR检测试剂盒（RUO）旨在检测EDTA全血、血清和尿液样本中的钩端螺旋体。提取DNA后，通过扩增lipL32基因的保守区域来识别致病性钩端螺旋体。该试剂盒包含了实时PCR所需的所有组件（特异性引物/探针、dNTPs、缓冲液、聚合酶）的稳定格式，以及一个内部对照以监测PCR抑制。钩端螺旋体DNA目标在FAM通道中被扩增和检测，而内部对照（IC）根据所用设备在不同通道（HEX、VIC或JOE）中被检测，因此应选择正确的检测通道[27]。

2.5. Genesig Advanced Leptospira Real-Time PCR试剂盒（“Genesig Kit”）
Genesig Advanced Leptospira Real-Time PCR试剂盒（Primerdesign，英国曼彻斯特）是一种即用型实时PCR测试，针对lipL32基因，这是一种在致病性钩端螺旋体物种中高度保守的标记。该试剂盒以冻干条的形式提供，包含引物、探针、聚合酶和外源内部对照，设置简单，只需添加提取的DNA和复水缓冲液即可。该试剂盒设计用于高分析灵敏度（≤100个lipL32拷贝/反应）和宽动态范围（10^2–10^7拷贝，线性R2 > 0.99），可在单个封闭管工作流程中实现快速检测。该检测具有出色的特异性，不对腐生性钩端螺旋体或其他病原体产生交叉反应，并包含一个内部对照以检测抑制或提取问题。尽管标记为RUO，但内部验证研究表明其在早期钩端螺旋体血症检测和定量监测中的可靠性，使其成为血清学检测的强大补充，有助于更好地诊断钩端螺旋体病[28]。扩增协议按照制造商的手册进行。

3. 结果
3.1. 样本处理
共有235个人类样本使用三种qPCR方法进行了检测：参考方法、“Viasure试剂盒”和“Genesig试剂盒”。样本组成详见表1：150份通过院内参考PCR确认为lipL32/secY/rrs阴性的阴性样本；55份lipL32阳性样本；38份secY阳性样本，其中30份lipL32阴性。在85份lipL32或secY阳性的样本中，有83份也呈rrs阳性。表1显示了Viasure和Genesig试剂盒与院内参考qPCR的结果对比。对于基于lipL32的钩端螺旋体检测和进一步分析商用qPCR试剂盒，考虑了180份阴性样本，包括150份lipL32/secY/rrs阴性和30份secY阳性但lipL32阴性的样本（表1和表2）。表2显示了本研究中使用的三种方法的qPCR扩增曲线示例。表2列出了评估的实时PCR商用试剂盒针对钩端螺旋体的临床性能参数。

3.2. Viasure和Genesig试剂盒对lipL32阳性菌株的临床性能
两种商用试剂盒均表现出100%的特异性：所有150份lipL32阴性样本均被准确识别为阴性，没有假阳性结果。两种商用试剂盒与参考qPCR的结果交叉分类总结在表1和表2中。两种试剂盒也实现了100%的敏感性：所有55份lipL32阳性样本均被正确识别。只有三个最初与参考检测方法结果不一致的样本被重新提取，并使用内部qPCR协议和两种商业试剂盒重新进行了测试；这三个样本在所有三种方法中最终都显示为阴性，从而实现了完全一致的结果。诊断性能指标如表2所示，两种试剂盒的敏感性（SE）、特异性（SP）、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）和总体一致性百分比（OPA）均达到了100%，因此满足了或超过了所有预定义的接受标准，表现出优异的诊断性能。对于参考方法，lipL32的平均Ct值为27.0（范围：15.5–34.7），而Viasure试剂盒的Ct值为27.2（范围：15.8–35.8），Genesig试剂盒的Ct值为27.9（范围：16.1–36.2）。

3.3. Leptospira secY阳性且lipL32阴性的菌株的临床性能
两种商业检测方法均未检测到30个secY阳性/lipL32阴性的样本，这证实了这两种试剂盒对缺乏lipL32的致病性Leptospira亚群P1具有高度特异性。

4. 讨论
在本研究中，Viasure试剂盒的诊断性能与经过验证的内部qPCR参考测试相当。所有lipL32阳性的Leptospira样本和所有参考阴性的样本都被该试剂盒正确识别，显示出100%的敏感性和100%的特异性。同样，Genesig试剂盒也产生了相同的结果，与参考方法相比没有假阳性或假阴性。这种完美的一致性（总体准确率为100%）突显了这两种商业测试在检测钩端螺旋体病急性发热期的可靠性，与经过验证的内部qPCR标准相比[22]。
这些结果与之前的分子诊断研究一致，表明设计良好的qPCR检测方法在用急性期患者的血液或尿液样本进行测试时可以达到近乎完美的准确性。例如，最近的一项荟萃分析报告称，qPCR在诊断人类钩端螺旋体病时的敏感性高达约98%，特异性约为99%[11,29]。此外，研究表明，针对lipL32基因的qPCR比传统的PCR更快且显著更敏感，能够在血液样本中检测到几乎两倍的阳性病例[30]。我们的发现进一步强调了基于qPCR的检测方法（包括商业试剂盒）在显著提高钩端螺旋体病早期确诊方面的有效性，相比血清学检测[11,26,31]。从这个意义上说，使用qPCR早期确诊钩端螺旋体病可以及时进行抗生素治疗，从而大大减轻疾病严重程度并防止并发症。此外，更广泛地使用这两种商业qPCR试剂盒或内部qPCR协议符合世界卫生组织等国际卫生组织的建议，促进了钩端螺旋体病监测和疫情管理的分子诊断标准化。这些qPCR检测方法提供了高准确性，使得在没有专门知识或复杂诊断方法（如MAT或培养）的条件下也能可靠地确认病例[26]。

我们的研究也有一些局限性需要承认。首先，我们仅使用了血液样本，建议进一步评估包括尿液样本在内的其他样本。此外，我们的评估主要集中在使用专门检测lipL32基因的试剂盒来检测致病性Leptospira亚群P1的菌株，但这些试剂盒无法检测由中间型（亚群P2）Leptospira引起的感染；在临床队列中已经报告过这种情况，其中中间型菌株的lipL32基因呈阴性但16S rRNA呈阳性，例如L. licerasiae病例[15,17,18]。相比之下，secY基因在Leptospira中广泛存在，包括亚群P1和P2，并被广泛用于属水平的检测和基因分型，具有更广泛的覆盖范围[20]。实际上，最近的现场研究表明，亚群P2的菌株可能与严重的疾病相关，这突显了涵盖这些菌株的临床重要性[32]。

总之，本研究中评估的两种商业试剂盒在检测发热患者血液样本中的致病性Leptospira方面表现出强大的临床性能，具有高敏感性和特异性。同时，由于这两种检测方法都针对lipL32基因，因此对中间型菌株（亚群P2）的检测范围有限。尽管如此，这些试剂盒仍能提高早期和准确的检测能力，对厄瓜多尔等钩端螺旋体病流行地区的临床管理和公共卫生工作具有明显的好处。

补充材料
以下支持信息可在以下链接下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/tropicalmed11050119/s1
表S1：Leptospira内部qPCR协议的引物和探针序列。
表S2：Leptospira spp.检测结果的解读。