《Carbohydrate Polymers》：CRISPR/Cas9 mediated knockout of MeSSI enhances resistant starch content without compromising yield in cassava
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卢晓华|王雅杰|车彦年|李玉恒|农宝昌|葛玉健|王向文|郭玉轩|李瑞梅|刘娇|郭建春|袁瑶|耿梦婷
中国海南省海口市，海南大学热带农业与林业学院热带作物育种国家重点实验室，邮编570228
摘要
提高木薯中的抗性淀粉（RS）含量对于培育营养价值更高、功能更强的食品作物至关重要
卢晓华|王雅杰|车彦年|李玉恒|农宝昌|葛玉健|王向文|郭玉轩|李瑞梅|刘娇|郭建春|袁瑶|耿梦婷
中国海南省海口市，海南大学热带农业与林业学院热带作物育种国家重点实验室，邮编570228
摘要
提高木薯中的抗性淀粉（RS）含量对于培育营养价值更高、功能更强的食品作物至关重要。在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9技术对MeSSI基因进行了定向突变，以探究其在淀粉生物合成和RS积累中的作用。MeSSI基因敲除系的RS含量增加了6.74倍，直链淀粉含量提高了16.42%，同时总淀粉含量和根系产量未受影响。淀粉结构分析显示，每个淀粉质体中的小颗粒数量增加，支链淀粉的链长分布发生了变化，表现为短链（DP6–12）减少，中长链增多，从而导致分支度降低。这些变化增强了淀粉的热稳定性并改变了其糊化特性。转录组分析表明，相关基因（如AGPase亚基和糖酵解基因）的表达上调，这表明碳代谢发生了重新编程以支持淀粉的积累。本研究表明MeSSI是决定支链淀粉精细结构和RS形成的关键因素，为改善木薯的营养价值提供了精确的基因编辑策略。
引言
抗性淀粉（RS）是一类在肠道中难以被酶分解、在结肠中发酵产生短链脂肪酸（SCFAs，如丁酸）的淀粉成分，这些脂肪酸有助于维持肠道健康、减少炎症并改善代谢稳态（Hu等人，2016；Shen等人，2022）。高RS摄入量与餐后血糖降低、胰岛素敏感性提高以及肥胖、结直肠癌和2型糖尿病风险降低有关（Higgins等人，2011；Regina等人，2006）。因此，提高主粮作物中的RS含量是功能性食品开发和营养育种的重要目标。
木薯是全球最重要的含淀粉作物之一，为热带地区超过8亿人提供主食。与玉米、水稻或小麦等谷物作物相比，木薯的RS含量相对较低（Lu等人，2025；Utsumi等人，2021）。这一限制阻碍了其在低血糖指数和健康导向食品中的应用。通过增加RS含量来改善木薯淀粉的功能特性是现代育种计划的关键目标。RS的比例受多种因素影响，包括直链淀粉与支链淀粉的比例、支链淀粉的精细结构以及淀粉颗粒内葡聚糖链的物理排列（Raigond等人，2015；Tian & Sun，2020）。在高等植物中，直链淀粉由颗粒结合型淀粉合成酶I（GBSSI）合成，而支链淀粉的合成需要可溶性淀粉合成酶（SSs）、淀粉分支酶（SBEs）和去分支酶（DBEs）的协同作用（Huang等人，2021；Yang等人，2025）。先前的研究表明，抑制SBE可以增加直链淀粉和RS的含量；然而，这种方法通常会导致淀粉产量或器官生物量下降（Han等人，2022；Luo等人，2021；Sun等人，2017；Yang等人，2016）。
SSs包含多种异构体（SSI-SSV），它们在支链淀粉生物合成过程中分别参与不同的葡聚糖链延长阶段（Irshad等人，2021；Wang等人，2023）。其中，SSI的独特之处在于它由大多数植物基因组中的单一基因编码，而SSII、SSIII和SSIV则存在多个异构体，这表明其功能具有非冗余性和进化保守性。SSI是发育中的储存组织中最丰富的SS异构体，在水稻胚乳中占总SS活性的60%以上（Fujita等人，2006）。重组玉米SSI的生化研究表明，该酶优先延长DP<10的短葡聚糖链（Commuri & Keeling，2001）。与此一致的是，水稻SSI的体外分析显示，它优先延长DP 6–7的短葡聚糖链，从而生成DP 8–12的支链淀粉（Fujita等人，2006）。
体内遗传学研究进一步支持了SSI在不同植物物种中的作用。在拟南芥中，AtSSI占叶片SS活性的约65–72%；缺乏AtSSI的T-DNA插入突变体表现出DP 8–12链显著减少，最丰富的链类型从DP 11–12转变为DP 13–15，同时DP 17–20链增加，叶片淀粉含量下降23%，直链淀粉比例从19%上升到31%（Delvallé等人，2005）。在水稻胚乳中，四个OsSSI突变系的SSI蛋白含量仅为野生型的0–20%，其DP 8–12链减少，而DP 6–7和DP 16–19链增加，链长变化的程度与OsSSI的缺失程度呈正相关（Fujita等人，2006）。值得注意的是，水稻SSI缺失突变体的种子形态、颗粒大小、结晶度和种子重量未受影响，而OsSSIIIa的活性增加了3倍，表明SS同工酶之间存在补偿机制（Fujita等人，2006）。Zhao等人（2019）进一步证明，RNAi介导的OsSSI抑制显著提高了直链淀粉含量并提升了糊化温度。在小麦中，TaSSI的抑制减少了DP 8–12链并改变了颗粒大小分布，但对总淀粉含量没有显著影响（McMaugh等人，2014）。在甘薯中，IbSSI在体内合成DP 9–17的葡聚糖链；其过表达增加了淀粉含量和颗粒大小，而RNAi抑制则提高了直链淀粉比例，表明其底物范围比水稻OsSSI更广（Wang等人，2017）。相比之下，反义抑制StSSI在马铃薯块茎中未检测到淀粉结构的变化，这与块茎中StSSII和StSSIII占主导地位的情况一致（Kossmann等人，1999）。这些发现共同表明，SSI的短链延长功能在物种间是保守的，但其对淀粉性质的贡献因组织类型和物种特异性同工酶组成而异。
由于支链淀粉的结构是决定淀粉消化性的关键因素，SSI被认为与RS的形成有关。在水稻中，OsSSIIIa突变体背景下的研究表明，进一步失去OsSSI会进一步增加RS含量（Hayashi等人，2015），这表明SSI在调节淀粉消化性方面的作用被低估了。然而，SSI在RS积累中的作用仍很大程度上尚未被探索，尤其是在根茎作物中。在本研究中，我们使用CRISPR/Cas9技术敲除了木薯中的MeSSI基因，以评估其在淀粉生物合成中的作用。我们系统分析了直链淀粉含量、RS水平、支链淀粉链长分布、颗粒形态和物理化学性质的变化，并评估了MeSSI敲除对淀粉产量和农艺性状的影响。我们的结果为了解木薯淀粉组成的分子调控提供了新见解，并为培育具有更好RS含量和更高功能价值的木薯品种开辟了新途径。
章节片段
植物材料
messi突变体是通过CRISPR/Cas9技术在SC8木薯品种（Manihot esculenta Crantz South China No.8）背景下创建的。messi突变体和未转化的SC8木薯（野生型，WT）在中国海南三亚的试验田中自然条件下生长。在收获期（种植后10个月）收集messi突变体和WT的储藏根，用于分析淀粉的精细结构和物理化学性质。
为了阐明MeSSI在木薯淀粉生物合成中的功能作用，我们使用CRISPR/Cas9系统在MeSSI基因的第一外显子内诱导了定点突变（图1A）。通过农杆菌介导的转化，成功获得了四个转基因系（messi-4、messi-8、messi-11和messi-16）。编辑效率分析证实这四个转基因系均携带了目标突变。
MeSSI是支链淀粉精细结构和淀粉颗粒形成的关键决定因素
支链淀粉的精细结构，包括链长分布和分支模式，是由多种酶的协同作用决定的，主要包括SSs、SBEs和DBEs。在SS异构体中，SSI在支链淀粉生物合成过程中主要负责延长短葡聚糖链。生化和体外研究一致表明，SSI优先延长DP 6–12的短链，从而生成大部分A链。
结论
本研究表明MeSSI是木薯中支链淀粉结构和淀粉颗粒形成的关键调节因子。CRISPR/Cas9介导的MeSSI敲除显著增加了直链淀粉和RS的含量。MeSSI突变引发了碳代谢途径的转录组重编程，包括AGPase的上调和MeSBEI的下调，从而实现了代谢补偿。因此，储藏根的产量和总淀粉积累未受影响。
卢晓华：撰写原始草稿、进行研究、获取资金、进行正式分析、数据管理。王雅杰：撰写原始草稿、进行验证、进行研究、获取资金。车彦年：撰写原始草稿、制定方法、进行研究、进行正式分析。李玉恒：进行验证、制定方法、进行研究。农宝昌：制定方法、进行研究、进行正式分析。葛玉健：制定方法、进行研究、进行正式分析。王向文：使用软件、进行研究、进行正式分析。
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
本工作得到了热带作物育种国家重点实验室项目（SKLTCBLHZD202503、NKLTCBCXTD39）、国家自然科学基金（32460458、31960058）、中央公共利益科学机构基础研究基金（1630052024008、1630052025003）以及海南省博士后研究计划（2025）的支持。
