沙奎那韦在人肺腺癌细胞中下调Claudin-2表达并增强化疗敏感性

《European Journal of Pharmacology》：Downregulation of claudin-2 expression and chemoresistance by saquinavir in human lung adenocarcinoma cells

　　

小本沙耶香 | 木村理穂 | 吉野勇人 | 森本和志 | 真野武弘 | 白塚美香子 | 石川良信 | 松永敏之 | 近藤聡 | 生田晃

日本岐阜县岐阜市501-1196，岐阜药科大学生物制药科学系生物化学实验室

摘要

Claudin-2（CLDN2）是一种与紧密连接相关的跨膜蛋白，在肺腺癌中高表达，并有助于化学抗性。在这里，我们筛选了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的小分子药物，以识别能够降低CLDN2表达并增强抗癌药物诱导的癌细胞毒性的化合物。基于结构的虚拟筛选预测，人类免疫缺陷病毒（HIV）蛋白酶抑制剂沙奎那韦（SQV）可以与CLDN2蛋白的第二个细胞外环结合。与预测一致，SQV显著降低了人类肺腺癌A549细胞中的CLDN2蛋白水平，而不影响其mRNA表达。相比之下，另一种HIV蛋白酶抑制剂利托那韦或HIV整合酶抑制剂拉替格韦没有显著效果，这表明病毒酶的抑制并不直接参与CLDN2表达的调节。环己亚胺追踪实验表明，SQV降低了CLDN2蛋白的稳定性。药理学抑制实验进一步表明，SQV诱导的CLDN2下调是通过增强网格蛋白依赖的内吞作用和随后的溶酶体降解来实现的。在三维球体模型中，SQV降低了氧化应激和核因子红细胞2相关因子2蛋白的表达，而没有改变球体大小、细胞活力或缺氧应激。值得注意的是，SQV增强了多种抗癌剂（包括多柔比星、顺铂和SN-38）在肺腺癌细胞系衍生的球体和患者来源的类器官中的细胞毒性作用。我们建议SQV通过降低CLDN2表达和氧化应激来改善化学抗性。

引言

全球人口增长和老龄化预计将导致癌症患者数量逐渐增加。最常见的五种癌症是肺癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌，这些癌症合计占所有诊断出的癌症的大约53%（Shah等人，2025年）。尽管癌症治疗取得了进展，但获得化学抗性仍然是治疗失败和临床结果不佳的主要原因。化学抗性的分子机制非常复杂，涉及多种因素（Zheng，2017年）。癌细胞建立了一个有利于其生存和进展的微环境（Biray Avci等人，2024年）。微环境中的亚致死性缺氧、酸性条件和氧化应激被认为是导致药物抗性的关键因素（Wu等人，2021年）。然而，微环境应激条件促进化学抗性的分子机制尚未完全了解。

Claudins（CLDNs）是紧密连接（TJs）的组成部分，在哺乳动物中包含超过20个成员（Mineta等人，2011年）。CLDNs具有共同的结构特征，包括四个跨膜结构域、细胞内氨基和羧基末端结构域以及两个细胞外环（ECLs）（Zihni等人，2016年）。第一个细胞外环（ECL1）通常由大约50个氨基酸组成，含有决定细胞间离子选择性的带电残基（Gunzel和Fromm，2012年）。第二个细胞外环（ECL2）由大约20个氨基酸组成，参与CLDN分子之间的同型和异型相互作用。

已在多种癌症组织中报告CLDN亚型的异常表达（Wang等人，2022年）。到目前为止，我们已经证明CLDN2在人类肺腺癌中表达上调（Ikari等人，2012年）。此外，CLDN2的过表达不仅增强了细胞增殖，还增强了三维（3D）球体培养模型中的化学抗性，这些模型比单层培养更接近于天然肿瘤的结构和功能特征（Maruhashi等人，2018年；Nunes等人，2019年；Paquet-Fifield等人，2018年）。因此，CLDN2可能成为克服肺癌化学抗性的新治疗靶点。

已经探索了几种调节CLDN功能的方法。产气荚膜梭菌肠毒素的羧基末端半片段可以与CLDN3和CLDN4结合，导致这些蛋白的细胞表面表达减少和细胞间屏障功能破坏（Sonoda等人，1999年）。此外，我们报告了针对ECL2的肽可以选择性地降低CLDN1、CLDN2和CLDN14的表达（Mizukami等人，2025年；Nasako等人，2020a；Nasako等人，2020b）。尽管这些基于肽的策略证明了概念可行性，但肽类疗法通常存在稳定性低和口服生物利用度差等限制。迄今为止，尚未报道能够直接靶向CLDN2并降低其表达的小分子有机化合物（≤1,000 Da）。

在本研究中，我们筛选了一个FDA批准的药物库，以识别能降低人类肺腺癌A549细胞中CLDN2表达的小分子化合物。我们确定沙奎那韦（SQV）是一种人类免疫缺陷病毒（HIV）蛋白酶抑制剂，可以降低CLDN2蛋白水平。因此，研究了SQV诱导的CLDN2下调的分子机制以及SQV对3D球体模型中抗癌药物敏感性的改善效果。

章节片段

材料

氯喹（CQ）、SN-38和SQV来自加拿大多伦多的Toronto Research Chemicals。顺铂、环己亚胺、多柔比星、单丹酰卡达维林（MDC）和拉替格韦来自美国密歇根州安娜堡的Cayman Chemicals。洛匹那韦（LPV）、奈非那韦（NFV）和利托那韦（RTV）来自日本的东京Kasei Kogyo。4', 6-二氨基-2-苯吲哚（DAPI）来自日本的Dojindo Laboratory。兔抗CLDN1（51-9000）和抗CLDN2（51-6100）多克隆抗体，以及小鼠

通过SBVS鉴定SQV作为CLDN2结合化合物

为了识别靶向CLDN2的ECL2的小分子化合物，我们对e-Drug3D集合中的1,777种FDA批准的药物进行了SBVS筛选。该筛选使用了CLDN2的同源模型，通过AutoDock Vina进行分子对接，并使用AMBER16对最小化复合物进行重新评分。在此工作流程中，MM/GBSA被用作单次结构重新评分步骤，以便对化合物进行优先排序。重新评分过程后，有几个高分化合物被选中

讨论

已有报道指出，在包括肺癌、乳腺癌、胃癌和结直肠癌在内的多种实体肿瘤中，CLDN2表达上调（Venugopal等人，2019年）。到目前为止，我们已经证明CLDN2在A549细胞的3D球体模型中促进了化学抗性（Maruhashi等人，2018年）。CLDN2可能是肺腺癌的潜在治疗靶点。几种针对CLDN2的ECL2的肽类策略，如VPDSM和DSMKF，已被证明可以降低CLDN2表达

CRediT作者贡献声明

松永敏之：撰写 – 审阅与编辑。近藤聪：撰写 – 审阅与编辑。白塚美香子：研究。石川良信：研究。森本和志：撰写 – 审阅与编辑。真野武弘：研究。木村理穂：数据管理。吉野勇人：撰写 – 审阅与编辑。小本沙耶香：数据管理。生田晃：撰写 – 原稿撰写、监督、项目管理和资金获取

利益冲突

作者声明没有利益冲突。资助者在研究的设计、数据收集与分析、手稿撰写或结果发表决定方面没有发挥作用。

数据可用性

数据可应要求提供。

资助

本研究部分得到了JSPS KAKENHI资助（项目编号19H03373）、AMED（资助编号JP18lm0203002）、COMIT合作研究2025，以及双叶电子纪念基金会、计会研究基金会、小林基金会、小山研究基金会、小川科学技术基金会、高桥产业经济研究基金会、武田科学基金会和Terumo生命科学基金会（21-III4045）的资助（资助对象为A. I.）。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：生田晃报告称获得了日本学术振兴会的财务支持。生田晃报告称获得了日本医疗研究开发机构的财务支持。生田晃报告称获得了双叶电子纪念基金会的财务支持。生田晃报告称获得了General的财务支持