双模态成像实现原位胶质瘤脑室内CAR-T治疗的纵向生物分布谱分析

《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Dual-modality imaging enables longitudinal biodistribution profiling of intracerebroventricular CAR-T therapy in orthotopic glioma

　　

局部区域CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-cell）递送正日益被探索用于胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM），以改善颅内肿瘤暴露；然而，颅内给药后的器官水平生物分布动力学在体内仍缺乏定量数据，限制了基于给药途径的优化和临床前风险评估。在此，研究人员报道了一种基于吲哚菁绿偶联铁纳米颗粒（Indocyanine Green–conjugated iron nanoparticles, ICG-NPs）的双模态细胞标记和追踪策略，利用第二近红外窗口（Second Near-infrared Window, NIR-II）荧光成像和磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）对体内B7-H3靶向CAR-T细胞（TX103）的生物分布进行评估。利用肝素-鱼精蛋白辅助方案（Heparin–protamine-assisted protocol），TX103细胞实现了高效标记（83.1%），且未检测到细胞活力、CAR表达、免疫表型（包括活化/耗竭标志物谱和CXCR3表达）或细胞毒功能的改变。体外成像显示NIR-II荧光强度与标记细胞数量呈线性相关（R2?=?0.973, p?<?0.001），而MRI在高细胞密度下提供了互补的解剖学背景。在原位胶质瘤小鼠模型中，纵向MRI和NIR-II成像捕捉到了脑室内（Intracerebroventricular, ICV）和静脉（Intravenous, IV）给药后肿瘤相关定位和全身生物分布的途径依赖性差异。此外，器官水平的NIR-II暴露与跨器官CD3? T细胞密度呈正相关（R2?=?0.552, p?<?0.001），并得到多器官病理学验证的支持。综上所述，该研究建立了一种生物相容性的双模态工作流程，可将颅内解剖定位与纵向全身生物分布读数联系起来，用于实体瘤模型中的临床前CAR-T追踪。

论文解读：双模态成像揭示脑室内CAR-T治疗的生物分布特征

研究背景与立项依据

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的中枢神经系统原发性恶性肿瘤，尽管采用标准治疗方案，患者中位生存期仍仅为约15个月。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法作为一种新兴的治疗策略，在胶质瘤治疗中显示出潜力，尤其是局部区域给药方式被广泛探索以期克服血脑屏障的限制。然而，目前的临床转化面临一个核心瓶颈：虽然局部给药旨在提高颅内暴露，但颅内注射（如脑室内给药）并不等同于细胞被限制在中枢神经系统内。脑脊液引流和淋巴流出途径可能导致细胞重新分布至外周器官，引发潜在的脱靶毒性。同时，单一成像模态难以同时满足颅内精细解剖定位与全身纵向监测的需求。因此，建立一种能够将颅内定位与全身生物分布动力学联系起来的非侵入性框架，对于优化CAR-T治疗策略和风险评估至关重要。本研究正是基于此背景，旨在开发一种双模态成像策略，以解决上述问题，相关成果发表在《Cancer Immunology, Immunotherapy》期刊上。

主要关键技术方法

研究人员构建了吲哚菁绿偶联铁纳米颗粒（ICG-NP）探针，利用肝素-鱼精蛋白复合物（HPC）增强T细胞摄取。核心技术手段包括：（1）利用NIR-II荧光成像进行高灵敏度、深组织穿透的全身生物分布监测；（2）利用7.0T小动物MRI进行颅内肿瘤解剖定位和信号演变分析；（3）采用流式细胞术评估标记对CAR-T细胞表型和功能的影响；（4）建立U87MG-Luc原位胶质瘤NOG小鼠模型，分别通过脑室内（ICV）和静脉（IV）途径给予ICG-NP标记的TX103细胞（B7-H3靶向CAR-T）或非靶向T细胞；（5）通过电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）、普鲁士蓝染色及CD3免疫组化进行多器官病理验证。

研究结果

ICG-NP的表征

研究人员通过酰胺反应合成了ICG-NP探针。透射电镜显示其粒径均匀，直径约20 nm；动态光散射测得水合粒径为69.42 nm，Zeta电位为-36.82 mV。光谱分析证实该探针在NIR-II区域（约924 nm）具有显著发射峰，具备双模态成像的物理化学基础。

TX103细胞ICG-NP标记方案的优化

通过筛选孵育时间和浓度，确定最佳标记条件为100 μg/mL ICG-NP联合1× HPC孵育20小时。在此条件下，标记效率高达83.1%，且细胞活力、CAR表达率与未标记组无统计学差异。重要的是，标记后的TX103细胞在IFN-γ释放和肿瘤细胞杀伤实验中保留了完整的细胞毒功能。共聚焦显微镜观察显示ICG-NP主要定位于细胞核周胞质内，表明标记稳定。

ICG-NP标记保留TX103的关键免疫表型

流式细胞术分析显示，标记处理未改变TX103的免疫表型亚群分布，包括初始/TSCM（CCR7?CD45RA?）、中央记忆（CCR7?CD45RA?）和终末效应（CCR7?CD45RA?）细胞的比例。同时，活化标志物（CD69、4-1BB）及耗竭标志物（PD-1、LAG-3、TIM-3）的表达水平也未受显著影响，且归巢受体CXCR3的表达得以保留，证明该标记策略具有良好的生物相容性。

通过MRI和NIR-II成像对ICG-NP标记的CAR-T细胞进行体外高检测能力评估

体外梯度细胞数的成像实验表明，NIR-II成像在1×10³至2×10⁵细胞范围内与细胞数呈强线性相关（R²=0.973），检测下限可达1000个细胞。相比之下，MRI需要更高的细胞密度（5×10⁵细胞）才能产生可靠的T2加权信号变化。这确立了NIR-II适用于低丰度全身监测，而MRI适用于高细胞密度解剖定位的互补策略。

基于MRI的原位胶质瘤模型中细胞相关信号的肿瘤相关定位评估

在U87MG原位胶质瘤模型中，基线MRI确认肿瘤植入后，分别给予ICV-TX103、ICV-非靶向T细胞和IV-TX103。纵向MRI显示，ICV-TX103组在肿瘤区域显示出明显的信号模式，且该组小鼠的T2定义病变体积增长较慢，体重维持更好。病理结果进一步证实了ICV-TX103组在肿瘤部位存在显著的CD3? T细胞浸润和铁沉积，而对照组则极少。

利用NIR-II成像对ICG-NP标记的CAR-T细胞进行体内示踪

NIR-II成像虽在早期难以区分脑内细微结构，但在全身生物分布监测中表现出色。结果显示，ICV给药后，TX103在脑内的暴露分数（Brain-to-whole-body exposure fraction）下降速度慢于非靶向T细胞（第7天分别为36.0% vs 11.0%），表明靶向细胞在脑内滞留更久。此外，无论给药途径如何，肝脏和脾脏均显示出显著的荧光积累，其中IV给药组的肝脏信号高于ICV组。通过线性混合效应模型分析证实，器官水平的NIR-II暴露与CD3? T细胞密度呈正相关（β=0.000614, p<0.001）。

讨论与结论总结

研究人员在讨论中指出，虽然脑室内给药旨在提高颅内暴露，但并不能保证细胞局限于中枢神经系统，肝脏和脾脏作为主要的清除和再循环器官，其信号积累不容忽视。NIR-II成像在早期可能受到脑室池和脑脊液相关滞留的影响，但在第7天的信号更能反映肿瘤相关定位。MRI则提供了关键的颅内解剖背景，两者结合实现了优势互补。

结论部分强调，本研究成功建立了一种生物相容性的双模态成像工作流程，通过在原位胶质瘤模型中耦合MRI的颅内解剖定位与NIR-II的全身读数，并辅以多器官病理学锚定，实现了对CAR-T细胞相关信号的纵向、器官水平生物分布谱分析。这一框架为颅内CAR-T治疗中的给药途径优化和临床前风险评估提供了实用的工具。