来自Trichothecium sp. DWS815的细胞毒性麦角甾醇衍生物

《Natural Products and Bioprospecting》：Cytotoxic trichothecene derivatives from Trichothecium sp. DWS815

　　摘要：从土壤真菌Trichothecium sp. DWS815中分离出了十种新的三萜烯类化合物，其中包括两种新的倍半萜类三萜（trichotheciumones A (1) 和 B (2)）、一种新的三萜烯类糖苷（trichothecinoside A (3)）以及七种新的三萜烯类化合物（trichothecrotocins T?Z (4?10)），同时还发现了三种新的天然产物（11?13）和十三种已知的化合物（14?26）。通过广泛的光谱分析和量子化学ECD计算，阐明了这些新化合物的结构和绝对构型。鉴于已知的三萜类化合物具有显著的抗癌特性，对这些化合物针对三种癌细胞系（HCT116、4T1、MHCC97H）和一种正常细胞系（GES-1）的细胞毒性进行了评估。细胞周期分析显示，新化合物7和8能够诱导HCT116癌细胞进入G2/M期停滞，从而抑制细胞增殖。

引言：三萜烯是一类由多种真菌属（如Aspergillus、Cephalosporium、Fusarium、Myrothecium、Stachybotrys、Verticimonosporium和Trichothecium）产生的倍半萜类化合物[1, 2]，是谷物中的常见污染物[3]。这类化合物主要分为两大类：简单三萜烯和巨环三萜烯[4]。简单三萜烯具有核心环结构，通过抑制真核生物的蛋白质合成以及破坏线粒体和核糖体功能而表现出细胞毒性[5,6,7,8]。12,13-环氧三萜-9-烯（EPT）被认为是这种毒性的原因[9]，而该类化合物的结构多样性源于EPT核心上的各种取代模式。近年来，从Trichothecium属中不断发现了新的三萜烯[10,11,12,13]。在我们长期致力于从土壤真菌中发现结构新颖且具有生物活性的化合物的过程中[14,15,16,17]，之前对Myrothecium verrucaria PA 57的化学研究发现了具有细胞毒性的新型巨环三萜烯[18]。为了寻找对癌细胞系具有更高细胞毒性而对正常细胞系毒性较低的新类型三萜烯天然产物，我们从中国湖南省大围山国家森林公园采集的土壤样本中分离出了Trichothecium sp. DWS815菌株。对该菌株的发酵提取物进行全面的LC–MS分析后发现，其中含有丰富的简单三萜烯代谢物，表明该菌株具有产生新型三萜烯衍生物的潜力。通过化学研究，我们分离出了十种此前未描述的三萜烯衍生物（trichotheciumones A (1) 和 B (2)、trichothecinoside A (3) 以及trichothecrotocins T–Z (4–10），同时还发现了三种新的天然产物（11–13）和十三种已知的化合物（14–26）（图1）。

结果与讨论：化合物1以白色粉末的形式获得，其分子式为C19H26O7，通过HRESIMS测定m/z为367.1758 [M?+?H]+（C19H27O7的计算值为367.1751），对应于七度的不饱和度。1的1H NMR谱（表1）显示存在四个甲基峰，分别位于δH 0.98 (s, H3-14)、1.02 (s, H3-13)、2.17 (dd, J?=?7.2, 1.8?Hz, H3-4') 和 2.17 (s, H3-15)；四个亚甲基峰，分别位于δH 2.13/2.53 (ddd, J?=?15.8, 4.9, 3.4?Hz, Ha-2; dd, J?=?15.8, 8.0?Hz, Hb-2)、2.34/2.89 (d, J?=?15.1?Hz, Ha-6; d, J?=?15.1?Hz, Hb-6)、2.44/3.10 (dd, J?=?16.6, 2.3?Hz, Ha-9; dd, J?=?16.6, 9.1?Hz, Hb-9)；以及五个亚甲基峰，其中两个为顺式烯烃亚甲基（δH 5.77 (dq, J?=?11.4, 1.8?Hz, H-2') 和 6.45 (dq, J?=?11.4, 7.2?Hz, H-3')；还有三个氧代甲基峰，分别位于δH 4.01 (d, J?=?9.1?Hz, H-10)、4.45 (d, J?=?4.8?Hz, H-1) 和 5.63 (dd, J?=?8.0, 3.4?Hz, H-3)。13C NMR（表4）和DEPT谱确认了19个碳共振峰的存在，分别归属于四个甲基（δC 7.4, 15.6, 20.6, 31.5）、四个sp3亚甲基（其中一个含氧，δC 36.5, 39.4, 42.0, 66.8）、三个sp3氧代亚甲基（δC 72.3, 75.3, 81.7）、三个非质子化sp3碳（其中一个含氧，δC 43.1, 53.4, 76.5）、两个sp2烯烃碳（δC 119.3, 147.9）、一个酮羰基碳（δC 206.5）和两个酯羰基碳（δC 164.8, 173.6）。表1列出了化合物1的1H NMR光谱数据。

化合物2以白色粉末的形式获得，其分子式为C18H24O7，通过HRESIMS测定m/z为353.1599 [M?+?H]+（C18H25O7的计算值为353.1595），对应于七度的不饱和度。2的NMR谱与化合物1相似，但关键的结构差异在于2的桥接内酯部分缺少一个亚甲基单元，表明它是一种先前未描述过的7,8-seco-7-nor-trichothecene。通过比较关键NMR信号（1H–1H COSY、HSQC和HMBC相关），确定B环和C环的结构，以及crotonyl基团和acetyl基团的存在。此外，通过HMBC相关和长程（4JCH）相关确认了B环上C-5和C-10之间的内酯桥。NOESY相关进一步支持了化合物2的相对构型。

化合物3以白色粉末的形式获得，其分子式为C25H38O10，通过HRESIMS测定m/z为499.2519 [M?+?H]+（C25H39O10的计算值为499.2538），对应于八度的不饱和度。13C NMR谱显示了六个特征性的糖基信号。通过与文献数据的比较（δC 61.8, 67.5, 70.9, 74.1, 75.6, 102.1），以及CDCl3中的δH值（δH 3.18 (brs), 3.53 (brs), 3.86 (m), 3.87 (brs), 3.97 (brs), 4.44 (d, J?=?0.7?Hz），证实了1中存在mannose单元。通过H-1''到C-7的HMBC相关揭示了1''-O-7的mannosidic连接。 mannose单元的β-构型通过H-1''和H-3''的不对称质子峰以及H-1''与H-3''和H-5''的NOESY相关得到确认。基于关键NOESY相关和GIAO 13C NMR计算（使用STS协议对八个异构体进行），确定了手性中心C-1、C-3、C-4、C-5、C-10和C-11的相对构型。通过ECD计算（使用时间依赖密度泛函理论TDDFT方法）确定了3的绝对构型为1R,3R,4S,5R,7S,8R,11S-β-D-mannopyranoside。

化合物4以白色粉末的形式获得，其分子式为C16H24O5，通过质子化离子峰的m/z 297.1700 [M?+?H]+（C16H25O5的计算值为297.1697）确定，对应于五度的不饱和度。1D数据分析显示4与共分离的新天然产物isocrotocol B（11）具有相似的结构，但4在C-7位置有一个氧代甲基。通过比较实验和计算的ECD谱，确定了4的绝对构型为1R,3R,4S,5R,6R,7R,10R,11S。

化合物5以白色粉末的形式获得，其分子式为C27H32O7，通过质子化离子峰的m/z 469.2211 [M?+?H]+（C27H33O7的计算值为469.2221）确定，对应于十二度的不饱和度。1D数据分析显示其结构与共分离的化合物trichothecrotocin O（16）相似，不同之处在于5在C-7位置有一个苯甲酰氧基取代了甲氧基。通过1H–1H COSY相关和HMBC相关确认了5的相对构型。表2 化合物5-8的1H NMR光谱数据
化合物6和7均以白色粉末的形式获得，根据其HRESIMS数据，分子式均为C19H26O5，m/z分别为335.1851 [M?+?H]+（C19H27O5的计算值，335.1853）和335.1863 [M?+?H]+（C19H27O5的计算值，335.1853），这表明它们具有七个不饱和度。对化合物6和7的一维数据（表2和表4）进行分析后发现，它们与另一种共分离出的天然产物二氢三萜醇酮（12）非常相似，不同之处在于含有肉桂酰基团。通过H-2'/H-3'/H-4'的1H–1H COSY数据以及H-3和H-2'与C-1'、H-4'与C-2'和C-3'的HMBC相关性证实了该基团的连接性。通过图2中显示的关键NOESY相关性，确定化合物6的相对构型与12相同。通过将实验数据与GIAO 13C NMR计算结果（STS协议）进行比较（表S11），确定了C-15的α-取向。化合物6和7之间的一个关键区别在于肉桂酰基团的几何结构，根据H-2'和H-3'之间的偶联常数（J?=?11.4?Hz），确定化合物7中的肉桂酰基团为Z构型。使用与化合物6相同的程序阐明了化合物7的相对立体化学结构。最后，通过比较它们的实验和计算得到的ECD光谱（图4），确定化合物6和7的绝对构型均为1R,3R,4S,5R,8R,10R,11S。因此，化合物6和7分别被命名为三萜醇酮V和三萜醇酮W。

化合物8也以白色粉末的形式获得，根据其HRESIMS数据中的质子加合物m/z 333.1708 [M?+?H]+（C19H25O5的计算值，333.1697），其分子式为C19H24O5，表明它具有八个不饱和度。一维（表2和表4）和二维数据表明，化合物8的结构与另一种共分离出的已知化合物克罗托辛（22）相似，仅肉桂酰基团的E几何结构有所不同。化合物8和22之间的几何差异与化合物6和7之间的差异一致，这一点通过H-2'和H-3'之间较大的偶联常数（J?=?15.6?Hz）得到证实。H3-13/H-3/H-10/H3-14/H-6的NOESY相关性表明它们的共面取向，这有助于确定相对构型。计算得到的1R,3R,4S,5R,6R,7S,10R,11S的ECD曲线与实验数据非常吻合（图4）。因此，化合物8被命名为三萜醇酮X。

化合物9和10也均以白色粉末的形式获得。化合物9的分子式为C15H20O3，根据其HRESIMS数据中的质子加合物m/z 249.1482 [M?+?H]+（C15H21O3的计算值，249.1485），表明它具有六个不饱和度。根据其HRESIMS数据中的钠加合物m/z 339.1563 [M?+?H]+（C19H24O5Na的计算值，339.1567），化合物10的分子式为C19H24O5，表明它具有八个不饱和度。对化合物9和10的一维数据（表3和表4）进行分析后发现，它们与另一种共分离出的已知化合物7-脱氢-8-脱氢三萜醇B（24）非常相似。化合物9的关键结构区别在于C-3位置没有肉桂酰基团。对化合物9的二维数据进行了全面分析，确认其剩余的平面结构和相对构型与化合物24相同。计算得到的1R,3R,4S,5R,10R,11S异构体的ECD曲线与实验数据非常吻合（图4）。化合物10的关键结构区别仅在于肉桂酰基团的E几何结构，这一点通过H-3与C-1'、H-4'与C-2'和C-3'的HMBC相关性以及C-2′与C-3′之间较大的偶联常数（J?=?15.5?Hz）得到证实，证实肉桂酰基团具有反式烯烃双键。化合物10的NOESY相关性与化合物9相似，表明它们的相对构型相同。此外，化合物10的实验ECD光谱（图4）与计算得到的1R,3R,4S,5R,10R,11S异构体的光谱一致。因此，化合物9和10分别被命名为三萜醇酮Y和三萜醇酮Z。

表3 化合物9-13的1H NMR光谱数据
表4 化合物1-13的13C NMR光谱数据

化合物11、12和表三萜醇B（13）是首次从这种真菌中分离出的新天然产物。首先确定了化合物11的绝对构型，并在图S143中提供了化合物13的ECD光谱。已知化合物14-26通过分析它们的HRESIMS和一维数据并与文献数据进行比较而被鉴定为三萜醇酮N（14）[12]、三萜烯类似物（15）[19]、三萜醇酮O（16）[12]、三萜醇酮Q（17）[12]、三萜醇酮（18）[22]、三萜醇（19）[23]、8-脱氧-三萜醇（20）[22]、三萜醇素（21）[24]、克罗托辛（22）[21]、克罗托科尔（23]、7-脱氢-8-脱氢三萜醇B（24）[25]、环内罗迪醇（25）[26]和环内罗迪醇C（26）。

三萜醇酮A（1）和B（2）具有基于三萜烯核心的不寻常的倍半萜骨架。尽管在结构上有所不同，但化合物1和2很可能由相同的前体三萜烯衍生物生物合成[4, 28]。图1提出了化合物1和2的潜在生物合成途径。该途径表明，三萜醇中的C-7–C-8键断裂后经过氧化，会产生关键中间体ⅰ，它属于罕见的7,8-开环三萜烯类。随后，羧酸根阴离子对C-12环氧基的亲核攻击会形成化合物1，这是首次报道的具有开放A环的三萜烯类倍半萜。或者，克罗托辛（22）可以通过氢氧根离子对6,7-环氧基的亲核开环转化为中间体15。然后，中间体15中的C-7–C-8键进一步断裂并氧化，会产生化合物2，这是首次报道的A环开环的非三萜烯类倍半萜例子。

这些分离出的化合物的细胞毒性活性通过CCK-8方法针对人类结肠癌细胞系HCT116、小鼠乳腺癌细胞系4T1、人类肝癌细胞系MHCC97H以及作为正常细胞系对照的人类胃上皮细胞系GES-1进行了评估。其中，化合物7、8、10、13、17、18、20、24表现出显著的抗增殖活性（图5A、B）。其中，化合物17的活性最强，其对HCT116、4T1和MHCC97H细胞的IC50值分别为0.35 μM、0.52 μM、0.57 μM（表5）。细胞周期分析显示，新化合物7和8使HCT116细胞停留在G2/M期。用0、1和2 μM的化合物7处理后，G2/M期细胞比例增加（对照组：5.25%，1 μM：17.22%，2 μM：32.42%），而G0/G1期细胞比例减少（对照组：64.79%，1 μM：52.01%，2 μM：24.61%）（图6A、B）。用0、1和2 μM的化合物8处理后，G2/M期细胞比例增加（对照组：4.41%，1 μM：7.14%，2 μM：12.31%），而G0/G1期细胞比例减少（对照组：62.78%，1 μM：60.54%，2 μM：50.59%）（图6C、D）。然而，这些测试化合物在这些三种癌细胞系和GES-1细胞系之间没有表现出明显的选择性抑制增殖作用。结构-活性关系（SAR）分析表明，C-3位置的肉桂酰基团的构型影响毒性。具体来说，将C-3位置的肉桂酰基团从Z构型改为E构型会降低毒性，Z构型（如化合物7和24）比E构型（如化合物6和10）具有更高的活性。

图5 对四种细胞系的抗增殖活性。A、B：使用CCK-8测定法（多柔比星作为阳性对照），评估了分离出的化合物在浓度为5 μM和50 μM时的细胞毒性（HCT116、4T1、MHCC97H和GES-1）。

表5 化合物7、8、10、13、17、18、20、24的细胞毒性活性
图6 用化合物7和8处理后的HCT116细胞周期分析。A：分别用0、1和2 μM的化合物7和8处理24小时后，细胞周期分布的直方图。B、D：用化合物7和8处理后，HCT116细胞在G0/G1、S和G2/M期的百分比。数据以平均值±标准差（n=3）表示。

3 实验部分
3.1 一般实验程序
光学旋转是在Rudolph Research Analytical Autopol IV自动偏振仪上测量的。紫外光谱是使用Cary 300光谱仪（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）记录的。红外光谱是使用Shimadzu傅里叶变换红外光谱仪和KBr颗粒记录的。圆二色性（CD）光谱是在Chirascan?-plus圆二色光谱仪上获得的。高分辨率电喷雾离子化质谱（HRESIMS）光谱是使用Agilent 6500系列Q-TOF质谱仪（Agilent Technologies，新加坡）获得的。核磁共振（NMR）光谱是在Bruker Avance III HD 600 MHz和500 MHz光谱仪上记录的，以四甲基硅烷（TMS）作为内标。柱层析（CC）使用的是大孔吸附树脂D101（天津浩聚树脂技术有限公司，中国天津）、硅胶（200–300目，青岛海洋化工，中国青岛）和Sephadex LH-20（GE Healthcare，瑞典乌普萨拉）。半制备型色谱柱包括MCI GEL?（三菱化学公司，日本）、Semipreparative ZORBAX SB-C18（Agilent，5 μm，9.4 mm × 150 mm）、Supersil ODS-B（Elite，10 μm，20.0 mm × 250 mm）、Supersil ODS2（Elite，10 μm，20.0 mm × 250 mm）和Preparative SinoPark C18（Elite，10 μm，20.0 mm × 250 mm），并通过EClassical P3500预制备型HPLC系统和DAD检测器（EClassical P3500，大连Elite Analytical Instruments有限公司，中国大连）进行分析。实验进程通过预涂硅胶GF254板（青岛海洋化工）进行监控。斑点在紫外光（254或365 nm）下或用10% H2SO4在乙醇中喷雾后加热进行可视化。本研究中使用的所有其他化学品均为分析级。

3.2 真菌材料
真菌菌株Trichothecium sp. DWS815是从湖南省大雪山国家森林公园采集的森林土壤样本中分离出的。根据ITS序列和系统发育分析（表S24和S25），该菌株被鉴定为Trichothecium sp.（GenBank登录号ON386019.1）。该菌株的凭证样本已存放在中国长沙中南大学的湘雅药学院。

3.3 发酵、提取和分离
这种真菌最初在含有20 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨、1 g/L酵母提取物粉末和15 g/L琼脂的Sabouraud Dextrose Agar（SDA）培养基上培养8天，温度为25°C。随后，将琼脂块上的菌丝剪下并转移到无菌水稻发酵培养基中。培养基由100克水稻和80毫升水配制，在500毫升Erlenmeyer烧瓶中。对于大规模发酵，将总共14公斤水稻分配到139个烧瓶中并接种这种真菌。发酵在25°C下进行21天。水稻在室温下用乙酸乙酯提取10次，溶剂在真空下蒸发以获得提取物（170克）。提取物被吸附在500克大孔吸附树脂D101上，然后依次用水、80%甲醇水溶液和100%甲醇进行洗脱。收集80%甲醇水溶液部分并浓缩得到26克残留物。接着使用硅胶CC进行分馏，洗脱梯度为石油醚–乙酸乙酯（v/v，100:0、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1）和乙酸乙酯–甲醇（v/v，100:0、10:1、5:1、1:1、0:100），得到九个组分（A～I）。组分Fr.A经过MCI处理得到五个子组分（Fr.A1～Fr.A5）。Fr.A2使用半制备型Supersil ODS-B（CH3CN: H2O，55:45）分离得到化合物24（tR = 20.9 min，22.5 mg）和Fr.A2-1。Fr.A2-1使用Supersil ODS-B（MeOH: H2O，57:43）分离得到化合物7（tR = 36.9 min，3.5 mg）和21（tR = 40.1 min，1.9 mg）。Fr.A4使用半制备型ZORBAX SB-C18（CH3CN: H2O，49:51）分离得到化合物20（tR = 23.9 min，50.2 mg）。Fr.B使用Sephadex LH-20（MeOH）分离得到五个子组分（Fr.B1～Fr.B5）。Fr.B3在Preparative SinoPark C18（MeOH: H2O，62:38）上分离得到四个组分（Fr.B3-1～Fr.B3-4）。Fr.B3-1使用半制备型Supersil ODS2（CH3CN: H2O，28:72）纯化得到化合物1（tR = 21.1 min，0.3 mg）和2（tR = 29.2 min，0.6 mg）。Fr.B3-4使用半制备型Supersil ODS-B（MeOH: H2O，53:47）纯化得到化合物17（tR = 47.0 min，24.5 mg）。Fr.C在半制备型ZORBAX SB-C18上使用CH3CN-H2O梯度（v/v，从20:100到50:50，流速：3 mL/min）分离得到化合物22（tR = 19.8 min，1.6 mg）、16（tR = 17.7 min，4.9 mg）和8（tR = 19.4 min，6.8 mg）和5（tR = 32.8 min，6.58 mg）。Fr.D首先经过Sephadex LH-20（MeOH）处理，然后使用半制备型Ultimate XB-CN（CH3CN:H2O，19:81）进一步分离，得到19（tR=14.6分钟，1.1毫克）、18（tR=9.5分钟，1.9毫克）、9（tR=12.3分钟，1.5毫克）、13（tR=28.9分钟，8.4毫克）、26（tR=20.0分钟，3.5毫克）、25（tR=24.9分钟，9.9毫克）和12（tR=17.0分钟，2.3毫克）。Fr.E也经过Sephadex LH-20（MeOH）处理，随后使用半制备型Supersil ODS-B（MeOH:H2O，26:74）进行纯化，得到14（tR=15.9分钟，1.4毫克）、15（tR=12.2分钟，41.9毫克）、4（tR=10.7分钟，3.09毫克）、23（tR=23.5分钟，3.3毫克）和11（tR=8.7分钟，1.6毫克）。Fr.F经过Sephadex LH-20（MeOH）处理后，使用半制备型ZORBAX SB-C18和CH3CN–H2O的梯度（从5:95到21:79，时间100分钟，流速3毫升/分钟）进行纯化，得到3（tR=81.6分钟，1.3毫克）。Fr.I同样经过Sephadex LH-20（MeOH）处理，然后使用半制备型Ultimate XB-CN和CH3CN–H2O的梯度（从25:75到45:55，时间40分钟，流速3毫升/分钟）进行纯化，得到化合物6（tR=29.8分钟，0.5毫克）和10（tR=35.1分钟，1.9毫克）。

Trichotheciumone A（1）：白色粉末；[\alpha]^{25}_{D} +37.5（c 0.04，MeOH）；UV（MeOH）λmax（log ε）：210（3.48）nm；IR（KBr）νmax：3442、2979、2950、2923、1714、1647、1294、1178、1115、1028、817 cm?1；CD（c 1.19 mM，MeOH）：205 nm（Δε –4.84）、227 nm（Δε +4.38）、269 nm（Δε –1.91）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）和1H NMR（CDCl3，600 MHz）数据见表1和表4；HRESIMS（正离子）m/z 367.1758 [M +H]+（C19H27O7的计算值，367.1751，Δ +1.9064 ppm）。

Trichotheciumone B（2）：白色粉末；[\alpha]^{25}_{D} +264.86（c 0.037，MeOH）；UV（MeOH）λmax（log ε）：210（2.88）nm；IR（KBr）νmax：3434、2924、2855、2788、1718、1578、1435、1384、1180 cm?1；CD（c 1.05 mM，MeOH）：200 nm（Δε +5.29）、226 nm（Δε –2.83）、270 nm（Δε –0.51）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）和1H NMR（CDCl3，600 MHz）数据见表1和表4；HRESIMS（正离子）m/z 353.1599 [M +H]+（C18H25O7的计算值，353.1595，Δ +1.1326 ppm）。

Trichothecinoside A（3）：白色粉末；[\alpha]^{25}_{D} –2.0（c 0.05，MeOH）；UV（MeOH）λmax（log ε）：200（3.17）nm；IR（KBr）νmax：3420、2962、2935、2876、1715、1649、1383、1291、1184、1083、1027、959 cm?1；CD（c 1.00 mM，MeOH）：217 nm（Δε –7.13）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）和1H NMR（CDCl3，600 MHz）数据见表1和表4；HRESIMS（正离子）m/z 499.2519 [M +H]+（C25H39O10的计算值，499.2538 Δ –3.8057 ppm）。

Trichothecrotocin T（4）：白色粉末；[\alpha]^{25}_{D} –12.5（c 0.037，MeOH）；UV（MeOH）λmax（log ε）：200（2.82）nm；IR（KBr）νmax：3459、3371、2981、2932、2859、1628、1457、1135、1125、1098、1051 cm?1；CD（c 1.35 mM，MeOH）：200 nm（Δε –28.13）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）和1H NMR（CDCl3，600 MHz）数据见表1和表4；HRESIMS（正离子）m/z 297.1700 [M +H]+（C16H25O5的计算值，297.1697，Δ +1.0009 ppm）。

Trichothecrotocin U（5）：白色粉末；[\alpha]^{25}_{D} –10.9（c 0.064，MeOH）；UV（MeOH）λmax（log ε）：200（3.21）nm；IR（KBr）νmax：3434、2978、2946、2922、2859、1737、1714、1647、1436、1248、1179、1133、1049 cm?1；CD（c 1.37 mM，MeOH）：200 nm（Δε –30.89）、210 nm（Δε +0.19）、225 nm（Δε –8.52）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）和1H NMR（CDCl3，600 MHz）数据见表2和表4；HRESIMS（正离子）m/z 469.2211 [M +H]+（C27H33O7的计算值，469.2221，Δ –2.1312 ppm）。

Trichothecrotocin V（6）：白色粉末；[\alpha]^{25}_{D} +12.5（c 0.008，MeOH）；UV（MeOH）λmax（log ε）：210（2.94）nm；IR（KBr）νmax：2971、2928、2855、1717、1576、1445、1384、1183、1081、971 cm?1；CD（c 1.50 mM，MeOH）：208 nm（Δε –11.61）、291 nm（Δε +0.92）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）和1H NMR（CDCl3，600 MHz）数据见表2和表4；HRESIMS（正离子）m/z 335.1851 [M +H]+（C19H27O5的计算值，335.1853，Δ –0.5967 ppm）。

Trichothecrotocin W（7）：白色粉末；[\alpha]^{25}_{D} –6.98（c 0.043，MeOH）；UV（MeOH）λmax（log ε）：210（3.08）nm；IR（KBr）νmax：2959、2928、1716、1647、1466、1366、1287、1183、1081、966、816 cm?1；CD（c 1.29 mM，MeOH）：213 nm（Δε –4.32）、293 nm（Δε +1.46）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）和1H NMR（CDCl3，600 MHz）数据见表2和表4；HRESIMS（正离子）m/z 335.1863 [M +H]+（C19H27O5的计算值，335.1853，Δ +2.9834 ppm）。

Trichothecrotocin X（8）：白色粉末；[\alpha]^{25}_{D} –16.67（c 0.024，MeOH）；UV（MeOH）λmax（log ε）：208（3.29）nm；IR（KBr）νmax：2965、2925、2857、1716、1602、1384、1185、1083、969 cm?1；CD（c 0.72 mM，MeOH）：203 nm（Δε –13.10）、230 nm（Δε +0.50）；13C NMR（CDCl3，125 MHz）和1H NMR（CDCl3，500 MHz）数据见表2和表4；HRESIMS（正离子）m/z 333.1708 [M +H]+（C19H25O5的计算值，333.1697，Δ +3.3016 ppm）。

Trichothecrotocin Y（9）：白色粉末；[\alpha]^{25}_{D} –51.35（c 0.037，MeOH）；UV（MeOH）λmax（log ε）：200（2.60）nm；IR（KBr）νmax：3452、2965、2923、2852、1664、1623、1593、1447、1422、1281、1185、1074、955 cm?1；CD（c 1.49 mM，MeOH）：256 nm（Δε –43.19）；13C NMR（CDCl3，125 MHz）和1H NMR（CDCl3，500 MHz）数据见表3和表4；HRESIMS（正离子）m/z 249.1482 [M +H]+（C15H21O3的计算值，249.1485，Δ –1.2041 ppm）。

Trichothecrotocin Z（10）：白色粉末；[\alpha]^{25}_{D} –63.16（c 0.019，MeOH）；UV（MeOH）λmax（log ε）：210（3.15）nm；IR（KBr）νmax：2917、2852、1732、1717、1606、1590、1384、1189、1101、1082、1064、957 cm?1；CD（c 0.60 mM，MeOH）：226 nm（Δε –13.12）；13C NMR（dimethyl sulfoxide-d6，150 MHz）和1H NMR（dimethyl sulfoxide-d6，600 MHz）数据见表3和表4；HRESIMS（正离子）m/z 339.1563 [M +H]+（C19H24O5Na的计算值，339.1567，Δ –1.1793 ppm）。

Isocrotocol B（11）：白色粉末；[\alpha]^{25}_{D} –18.0（c 0.05，MeOH）；UV（MeOH）λmax（log ε）：200（2.71）nm；IR（KBr）νmax：3507、3435、3332、2978、2939、2876、1637、1452、1321、1135、1100、1055、973、898、817 cm?1；CD（c 1.77 mM，MeOH）：221 nm（Δε +1.42）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）和1H NMR（CDCl3，600 MHz）数据见表3和表4；HRESIMS（正离子）m/z 283.1542 [M +H]+（C15H23O4的计算值，283.1540，Δ +0.7063 ppm）。

Trichothecolone（12）：白色粉末；[\alpha]^{25}_{D} –5.22（c 0.23，MeOH）；UV（MeOH）λmax（log ε）：200（2.02）nm；IR（KBr）νmax：3502、2982、2966、2931、1715、1458、1280、1081、957 cm?1；CD（c 8.64 mM，MeOH）：200 nm（Δε –71.20）、292 nm（Δε +15.78）；13C NMR（methanol-d4，150 MHz）和1H NMR（methanol-d4，600 MHz）数据见表3和表4；HRESIMS（正离子）m/z 267.1585 [M +H]+（C15H23O4的计算值，267.1591 Δ –2.2458 ppm）。

Epi-trichothecinol B（13）：白色粉末；[\alpha]^{25}_{D} +87.5（c 0.04，MeOH）；UV（MeOH）λmax（log ε）：200（2.71）nm；IR（KBr）νmax：3468、2985、2962、2938、1712、1643、1434、1376、1313、1245、1175、1078、1034、996、972、962 cm?1；CD（c 1.77 mM，MeOH）：221 nm（Δε +1.42）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）和1H NMR（CDCl3，600 MHz）数据见表3和表4；HRESIMS（正离子）m/z 335.1856 [M +H]+（C19H27O5的计算值，335.1853，Δ +0.8950 ppm）。

3.4 量子化学计算：使用Conformer–rotamer ensemble sampling tool（CREST）在气相中，以GFN0理论水平搜索化合物的构象空间[29, 30]，然后在GFN2-xTB水平进行优化，以避免初始几何结构不良引起的误差[31]，并设置4 kcal/mol的能量窗口以去除高能量构象。每个构象的优化和频率计算是在r2-SCAN-3c理论水平上，使用conductor-like polarizable continuum model（CPCM）进行的，以确保它们是势能面上的真实局部最小值[32, 33]。根据STS协议[34]，使用ωB97x-D/6-31G*（IEFPCM，氯仿）