一种用于指甲渗透测试的3D打印扩散池

《International Journal of Pharmaceutics》：A 3D-printed diffusion cell for nail permeation testing

　　斯坦尼斯拉斯·梅索努夫（Stanislas Maisonneuve）| 桑迪·弗里尼奥（Sandy Vrignaud）| 马克·皮埃（Marc Pihet）| 弗雷德里克·拉加尔斯（Frédéric Lagarce）| 西尔维·克劳斯特-曼西埃（Sylvie Crauste-Manciet）| 布里斯·卡尔维尼亚克（Brice Calvignac）| 文森特·勒布雷顿（Vincent Lebreton）
法国昂热市大学医院中心，拉雷街4号（49933 Angers Cedex 9），用于内服的药剂

**摘要**
在抗真菌药物的临床前研究中，评估活性药物成分（API）在指甲中的扩散情况是一项具有挑战性的任务，但却是必不可少的。然而，现有的模型要么价格昂贵，要么难以获取。因此，本研究设计了一种基于3D打印细胞和牛蹄切片的模型。该模型使用了两种含有两性霉素B（AmB）的制剂（一种凝胶和一种乳膏）进行测试。在3D打印细胞中扩散7天后，通过高效液相色谱法（HPLC）对牛蹄切片中的AmB进行了定量分析。结果显示，AmB凝胶在牛蹄中的平均浓度为125.9 ± 7.4 μg/cm3，而AmB乳膏的浓度为95.6 ± 15.9 μg/cm3（这里的“cm3”是指牛蹄厚度乘以扩散面积）。为了进一步测试AmB在牛蹄中的扩散能力，还进行了琼脂扩散实验，以评估其在水基基质中的扩散能力及其抗真菌活性。虽然这种模型无法直接应用于人类，但它可以用于比较不同半固态制剂的效果。

**引言**
针对侵袭性真菌感染的新抗真菌药物的开发是一个漫长、成本高昂且风险较高的过程，通常需要十年或更长时间，从临床前优化到第3阶段试验并最终获得批准。研发成本中位数约为7.08亿美元，若考虑资本投入和失败情况，总成本可能超过10亿至20亿美元（Mulcahy等人，2025年）。即使是对现有药物进行重新配方或重新定位，由于可以利用已建立的安全性和药代动力学数据，这一过程的时间线也会缩短（通常为3至12年），但仍需进行早期可行性评估以避免不必要的开支和技术失败（Al Khzem和Wali，2025年；Pinzi等人，2024年；Amantea等人，2015年）。在许多情况下，药物通过上皮组织的扩散是阻碍制剂开发的关键因素。为了在早期阶段评估项目的可行性，拥有能够提供初步判断结果的体外模型是非常有用的。这类模型必须能够证明或至少暗示活性药物成分在其药理靶点上的存在。

对于甲真菌病（发病率约为5.5%的常见疾病），指甲会受到多种真菌（皮肤癣菌、非皮肤癣菌或酵母菌）的感染。治疗方式可以是口服或局部应用。例如特比萘芬、伊曲康唑或氟康唑等口服抗真菌药常被作为成人或婴儿的首选药物。然而，口服药物可能存在副作用，并可能与其他治疗方法发生相互作用。局部治疗常与口服治疗结合使用以提高疗效，或单独使用以避免相互作用或副作用；在浅表感染的情况下，也可单独使用局部治疗。局部制剂的设计旨在增强药物在指甲中的滞留时间和渗透能力（Laubé和Nardello-Rataj，2020年；Leung等人，2020年）。无论是口服还是局部治疗，药物的疗效都与其在指甲结构中的扩散程度相关，或者是在吸收后进入全身循环，或是通过直接接触发挥作用。

甲真菌病常由非皮肤癣菌（如镰刀菌属）引起，这些真菌对传统抗真菌疗法的敏感性较低。由于常用药物（如特比萘芬或伊曲康唑）对这些真菌的最低抑菌浓度（MIC）较高，导致治疗效果不佳和复发。两性霉素B是一种有效、安全、价格低廉且易于使用的药物，Lurati等人建议将其作为治疗非皮肤癣菌引起的甲真菌病的一线疗法（Lurati等人，2011年）。但由于担心其难以穿透指甲板、需要长期治疗以及可能产生的全身毒性，其在指甲疾病中的应用受到限制。最近关于局部两性霉素B制剂的研究表明，优化后的局部递送方式可以在减少全身暴露的同时，在感染部位达到有效的药物浓度（Souza等人，2021年；Monod和Méhul，2019年）。

指甲是一种复杂的结构，其富含角蛋白、脂质含量低且水分含量有限，形成了一个密集的角质化屏障，限制了分子的扩散。对于像两性霉素B这样的大分子、两性化合物及水溶性差的物质来说，这一屏障尤为棘手（Laubé和Nardello-Rataj，2020年）。目前，API在指甲中的扩散主要使用T.J. Franz扩散细胞模型进行评估（Franz，1975年）。尽管该模型已被多个团队改进（Córdoba-Díaz等人，2000年；Naumann等人，2014年），但其基本原理始终未变：该模型由两个通过膜（模拟皮肤）分隔的腔室组成，可用于模拟经皮吸收。受体腔室通常填充有温度控制的生理缓冲液（如磷酸盐缓冲盐水PBS），药物在扩散过程中会在此浓缩。虽然这种缓冲液在皮肤扩散研究中是合理的，但在指甲扩散研究中并不适用（因为它是惰性介质）。此外，指甲治疗的目的并非让药物进入全身循环。

指甲治疗通常具有局部作用，因此不需要药物进入全身循环。例如，能够扩散到磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的分子属于生物制药分类系统（BCS）中的I类和III类；而两性霉素B属于IV类。因此，对于在指甲中扩散但无法进入PBS的药物来说，这种治疗方法可能是可行的。

Franz模型的一个替代方案是Wagner团队在20世纪90年代末开发的Saarbrücken模型（Wagner等人，2000年）。该模型由两部分组成：放置吸水纸和皮肤的支架，以及用于压紧两者的压机。实验通过塑料接头密封。该模型主要评估药物在基质中的浓度，而非受体腔室中的浓度。在指甲递送研究中，这一模型特别适用，因为它关注药物在目标腔室（指甲）中的积累情况。

虽然之前描述的模型都是定量模型，但也存在定性模型，例如Lusiana等人开发的模型（Lusiana和Müller-Goymann，2013年），该模型使用预先感染的牛蹄切片进行琼脂扩散实验。由于本研究需要定量分析，因此未选择这一定性模型。本研究专注于量化抗真菌药物在指甲基质中的沉积情况以及其在指甲板内的渗透情况。由于真菌感染仅发生在指甲内部，因此无需评估全身扩散。因此，我们选择了对Saarbrücken模型进行适应性修改的版本。

**方法**
本研究旨在开发一种基于3D打印扩散细胞的简单、易于获取且经济可行的体外验证模型，用于评估抗真菌药物在指甲中的渗透情况。据我们所知，这是首次报道使用3D打印技术替代传统Saarbrücken模型的研究。

**结果**
两性霉素B在DMSO和丙二醇中完全溶解，但在水中及大多数经典溶剂中的溶解度较低（药典，1292条）。为避免使用具有毒性的DMSO，我们采用了两种不同的配方策略：（1）使用Fungizone?（Cheplapharm Arzneimittel，法国Levallois-perret），其中两性霉素B以与表面活性剂（脱氧胆酸盐DOC）结合的胶束形式存在；（2）通过测量剪切应力和表观粘度随剪切率的变化来评估两种制剂（凝胶和乳膏）的流变行为（补充材料，图S1和S2）。两种制剂均表现出非牛顿流体特性，即表观粘度随剪切率增加而降低。

**讨论**
甲真菌病的研究需要可靠的临床前工具来评估抗真菌制剂的渗透性和活性。我们开发了一种基于3D打印技术的扩散细胞模型，其中包含牛蹄切片，证明了两种两性霉素B半固态制剂（乳膏和凝胶）能够释放药物并在琼脂扩散测试中保持其抗真菌活性。

**结论**
本研究表明，通过对Saarbrücken扩散模型进行逆向工程并结合SLA 3D打印技术，可以开发出一种经济可行且易于使用的指甲渗透研究模型。据我们所知，这是首次将Saarbrücken模型用于评估指甲中的药物扩散情况。该系统能够准确比较不同半固态制剂的效果。然而，其应用受到一些限制因素的影响：

**作者贡献声明**
斯坦尼斯拉斯·梅索努夫（Stanislas Maisonneuve）：撰写初稿、方法学设计、数据分析、形式化分析；
桑迪·弗里尼奥（Sandy Vrignaud）：审稿与编辑、数据可视化、验证、方法学指导、概念化；
马克·皮埃（Marc Pihet）：审稿与编辑、验证、方法学指导、概念化；
弗雷德里克·拉加尔斯（Frédéric Lagarce）：审稿与编辑、验证；
西尔维·克劳斯特-曼西埃（Sylvie Crauste-Manciet）：审稿与编辑、验证；
布里斯·卡尔维尼亚克（Brice Calvignac）：审稿与编辑、数据可视化、监督。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

**致谢**
作者感谢Guillaume Mabilleau博士（INSERM 1229-RMeS-REGOS）在牛蹄切片制备方面的贡献。