用于DNA和干扰RNA共同递送的纳米药物：针对法布里病的联合基因疗法

《International Journal of Pharmaceutics: X》：Nanomedicines for DNA and interference RNA co-delivery: Combined gene therapy for Fabry disease

　　玛丽娜·贝拉扎-米洛尔|保拉·费尔南德斯-穆罗|玛达莱娜·阿里巴斯-加拉雷塔|安娜·德尔·波索-罗德里格斯|阿莉西亚·罗德里格斯-加斯科恩|玛丽亚·安赫莱斯·索利尼斯
PharmaNanoGene，巴斯克大学药学院药学与食品科学系，拉斯卡拉伊·伊克尔古内亚研究中心，西班牙维多利亚-加斯特伊兹

**摘要**
法布里病（FD）是一种多系统罕见疾病，由编码α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）的GLA基因突变引起。这种酶的缺乏导致糖鞘脂在溶酶体中的逐渐积累，尤其是三己糖酰鞘脂（Gb3）和裂解型Gb3。目前的疗法在疗效上仍然有限，无法完全阻止疾病进展。在这项研究中，我们设计了含有5纳米金纳米颗粒（“金色SLNs”）的固体脂质纳米颗粒，用于共同递送GLA质粒DNA和针对Gb3合成酶的siRNA，以同时促进α-Gal A的产生并抑制Gb3的合成，作为法布里病的双重治疗策略。这些纳米药物通过优化的静电组装工艺制备，结合了DNA和siRNA与金色SLNs、protamine肽和多糖。它们在大小、表面电荷和核酸结合能力方面进行了表征，并在法布里病的内皮细胞模型（IMFE-1细胞）中进行了评估，以评估细胞内转运、α-Gal A表达、Gb3合成酶下调、Gb3减少、细胞活力和血液相容性。基于金色SLNs的纳米药物，粒径在200至300纳米之间，具有正表面电荷，能够至少15天内提高α-Gal A活性并降低Gb3合成酶表达和Gb3水平。Protamine和金纳米颗粒在核酸浓缩和细胞内释放过程中发挥了关键作用，而脂质组成和多糖涂层决定了其疗效和安全性。本研究首次提出了能够同时实现基因补充和遗传底物减少治疗的纳米药物，从而拓宽了法布里病的治疗范围。

**1. 引言**
基于核酸的疗法为缺乏有效治疗方法的病理状况提供了不同的革命性策略。它们的作用机制和高特异性使其成为病毒感染、未满足临床需求的遗传性疾病、多种癌症（Deverman等人，2018年）和罕见疾病（Schambach等人，2024年）的潜在治疗选择，与传统药物相比具有显著优势（Dunbar等人，2018年）。然而，基于核酸的疗法需要开发创新的递送系统，以保护核酸免受降解，确保针对目标细胞的特异性和适当的细胞内分布，防止脱靶效应和免疫反应的激活。鉴于基因治疗的兴起，迫切需要开发安全、高效和特异性的基因治疗递送系统。材料和纳米技术的进步极大地推动了非病毒载体的发展，这些载体具有更好的安全性，并在工业生产方面具有优势，尽管它们在疗效上不如病毒载体（del Pozo-Rodríguez等人，2020年）。在这方面，基于脂质的系统是市场上或临床研究中最常用的递送系统，其次是抗体-药物偶联物、聚合物-药物/蛋白质偶联物和无机纳米颗粒（NP），包括金纳米颗粒（GNs）（Shan等人，2022年）。最近在脂质纳米颗粒（LNPs）方面取得的里程碑，如COVID-19疫苗的商业化和首个上市的小干扰RNA（siRNA）产品ONPATTRO?，加速了基于脂质的纳米递送系统的发展，推动了这些策略向更高级临床阶段的进展（Samaridou等人，2020年）。除了LNPs外，固体脂质纳米颗粒（SLNs）也展示了作为核酸递送系统的潜力，目前被认为是最有前景的非病毒平台之一。SLNs是由固体脂质核心和表面活性剂层组成的球形纳米颗粒，这种多功能纳米平台允许对其表面进行修饰，以将负载的核酸靶向特定细胞，并调节细胞内转运和核酸释放，从而提高其疗效和安全性（Gómez-Aguado等人，2020年；Mendes等人，2022年；Rodríguez-Castejón等人，2022年）。

法布里病（FD）是一种罕见的代谢性疾病，由于其单基因病的特性，可以被认为是适合用基于核酸的疗法治疗的良好候选对象（Shaimardanova等人，2023年）。FD是一种溶酶体贮积症（LSD），由编码溶酶体酶α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）的GLA基因突变引起。结果，糖鞘脂三己糖酰鞘脂（Gb3）及其去酰化衍生物三己糖酰鞘氨醇（裂解型Gb3）在细胞溶酶体中逐渐积累，尤其是在血管内皮细胞和平滑肌细胞中，导致心脏、肾脏和脑血管表现（Tuttolomondo等人，2021年）。目前有两种治疗FD的策略：静脉注射（i.v.）酶替代疗法（ERT），使用两种重组酶——α-半乳糖苷酶α（Replagal?）或β-半乳糖苷酶（Fabrazyme?）；以及口服伴侣药物Migalastat（Galafold?）。2023年，pegunigalsidase alfa（Elfabrio?）获得了EMA和FDA的批准，作为FD的新ERT替代方案（欧洲药品管理局）。尽管现有疗法已显示出改善患者生活质量的潜力，但没有一种能够完全逆转临床表现，仍有许多临床需求尚未满足（Felis等人，2020年）。例如，ERT由于组织渗透性低、输注相关反应以及无法穿过血脑屏障而疗效有限（Azevedo等人，2021年）；而migalastat仅对某些特定突变有效（Müntze等人，2023年）。因此，需要开发新的策略。在这方面，提出了不同的替代方案，包括基因补充疗法和底物减少疗法（SRT）（Kant和Atta，2020年）。目前，多项临床研究正在评估FD基因治疗的安全性，这些研究在治疗方法上有所不同（Lenders和Brand，2021年）。通过质粒DNA（pDNA）或信使RNA（mRNA）递送GLA序列以在原生细胞中表达α-Gal A，已被提出以克服现有疗法的局限性（Domm等人，2021年）。通过基因补充内源性产生的α-Gal A具有优势，因为它涉及自然的翻译和翻译后修饰，与重组α-Gal A相比，增强了稳定性和降低了免疫原性（Rodríguez-Castejón等人，2022年）。除了基因补充方法外，还提出了SRT，通过抑制Gb3合成酶（Gb3S）来减少FD中的Gb3积累，从而特异性地抑制Gb3的合成。最近，通过siRNA介导的基因SRT（gSRT）已在体外被探索作为FD的特异性疗法（Beraza-Millor等人，2024年）。

在本研究中，我们提出了一种结合的核酸疗法，即在同一配方中共同递送GLA pDNA以恢复α-半乳糖苷酶A的表达和抗Gb3S siRNA以减少底物合成，旨在在同一靶细胞中实现双重治疗效果。使用单一非病毒载体共同递送pDNA和siRNA特别具有挑战性，因为它需要协调控制细胞摄取、内体逃逸和细胞内转运，以及两种具有不同理化性质的载物的浓缩和生物利用度。本研究中设计的平台基于SLNs，旨在促进有效的内化和内体逃逸，并结合了GN。GN的加入为核酸提供了额外的吸附界面，通过金-核碱基相互作用，有助于稳定pDNA/siRNA的共同加载，并在浓缩和细胞内释放之间达到更优的平衡（Arral和Whitehead，2026年；Dutour和Bruylants，2025年）。通过使GLA pDNA和Gb3S siRNA能够递送到同一靶细胞，该载体旨在促进细胞内Gb3水平的协调和持续减少，从而提高单一核酸方法的效果。因此，本研究旨在设计和评估一种基于SLNs和GNs的混合纳米药物，能够共同递送GLA质粒和针对Gb3S的siRNA。为此，设计并表征了一种血液相容的金色SLN平台，对其理化性质和核酸共同加载能力进行了评估，进一步评估了在FD内皮细胞模型IMFE-1细胞中的细胞内递送、功能转染、沉默效果和Gb3减少的持久性（图1）。

**2. 材料与方法**
**2.1. 材料**
用于制备SLNs的1,2-二油酰-3-三甲铵丙烷氯化物盐（DOTAP）和1,2-二油酰-3-二甲铵丙烷（DODAP）从Avanti Polar-lipids, Inc.（美国阿拉巴马州阿拉巴斯特）获得，而D-Lin-MC3-DMA（MC3）脂质从BroadPharm（美国加利福尼亚州圣地亚哥）购买。Precirol? ATO 5（棕榈硬脂酸甘油酯）由Gattefossé（西班牙马德里）提供。Tween 80和二氯甲烷从Panreac（西班牙马德里）获得。Sigma-Aldrich（西班牙马德里）提供了鲑鱼源的硫酸protamine盐（Grade X）、分子量为3260 Da的右旋糖酐（Dx）、来自Ceratonia siliqua的D-半乳糖-D-甘露聚糖（Mr约为200,000）（Gal）和5纳米的Nile Red。Lifecore Biomedical（美国明尼苏达州查斯卡）提供了分子量为100 KDa的透明质酸（HA）。平均粒径为5纳米的GNs来自Sigma-Aldrich，以柠檬酸缓冲液中的稳定水悬浮液形式提供，其中柠檬酸作为表面稳定剂。根据制造商的信息，粒浓度约为5.5×10^13颗粒/mL。GNs储存在2–8°C下，除非另有说明，否则按原样使用。针对人类Gb3S mRNA的siRNA来自Dharmacon?（英国剑桥），以及Dharma?FECT转染试剂。使用的功能性siRNA序列为GCACACGGACUUCAUUGUU（J-016315-05，分子量13,430.1 g/mol）。作为阴性对照，使用了随机序列（UGGUUUACAUGUCGACUAA）。编码绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pcDNA3-EGFP（6.1 kb）由B.H.F. Weber教授的实验室（德国雷根斯堡大学）提供。编码α-Gal A的质粒pCMV6-AC-αGLA（7.1 kb）从Origene（美国马里兰州罗克维尔）购买。用于琼脂糖凝胶电泳实验的材料来自Bio-Rad（西班牙马德里）。琼脂糖、脱氧核糖核酸酶I（DNAse I）和十二烷基硫酸钠（SDS）从Sigma-Aldrich购买，GelRed?来自Biotium（美国加利福尼亚州弗里蒙特），GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder和1 Kb pDNA ladder来自Gibco（美国马萨诸塞州赛默飞世尔科学）。永生化法布里内皮细胞系-1（IMFE-1）由Kanenski博士（美国马里兰州贝塞斯达国立神经疾病和中风研究所）和Shen博士（美国德克萨斯州达拉斯贝勒研究所）提供。EGM?-2培养基添加了2%胎牛血清（FBS）、氢化可的松、人表皮生长因子（hEGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、人成纤维细胞生长因子（hFGF-B）、胰岛素样生长因子1（R2-IGF-1）、庆大霉素硫酸盐-两性霉素（GA-1000）、抗坏血酸和肝素，均来自Lonza（瑞士巴塞尔）。细胞培养试剂，包括胰蛋白酶/EDTA和磷酸盐缓冲液（PBS）来自Gibco（西班牙马德里），而葡萄糖来自Sigma-Aldrich。

用于研究IMFE-1细胞内吞活性的AlexaFluor488-转铁蛋白、AlexaFluor488-霍乱毒素和Fluorescein-70,000 MV Dx来自ThermoFisher Scientific（西班牙马德里）。用于定量α-Gal A活性的4-甲基伞形花烃基-α-D-半乳吡喃糖苷（4-MU-α-Gal）、N-乙酰-D-半乳糖胺和4-甲基伞形花烃酮（4-MU）来自Sigma-Aldrich。Micro BCA?蛋白测定试剂盒来自Thermo Fisher Scientific（西班牙马德里）。用于研究pDNA和siRNA在载体表面暴露情况的Quant-it? Picogreen和Quant-it? Ribogreen试剂盒来自ThermoFisher（西班牙马德里）。定量逆转录PCR（RT-qPCR）用于量化mRNA表达，所用材料以及LightCycler? 2.0系统由Roche Diagnostics（德国曼海姆）提供：高纯RNA分离试剂盒、First Strand cDNA合成试剂盒、LightCycler? FastStart DNA Master SYBR Green I和特异性引物。用于检测Gb3S表达的抗人类Gb3S兔抗体来自Sigma-Aldrich（西班牙马德里），以及山羊血清和Triton? X-100。用于检测Gb3的鼠抗人类Gb3单克隆抗体来自BioLegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥），纯Gb3来自Matreya（美国宾夕法尼亚州州立学院）。用于生存力检测的噻唑蓝四唑溴化物（MTT）来自Sigma-Aldrich（西班牙马德里）。

**2.2. SLNs和非病毒制剂的制备**
SLNEE的制备方法如前所述（Gómez-Aguado等人，2021年）。Precirol? ATO 5溶解在二氯甲烷（5% w/v）中，并与含有Tween 80（0.1% w/v）和阳离子/可电离脂质（0.4% w/v）的水溶液混合。乳液通过超声波处理（Branson Sonifier 250；美国康涅狄格州丹伯里）在50 W下处理30秒获得。有机溶剂通过搅拌并在真空条件下蒸发1小时45分钟而被去除。SLNHM的制备方法如先前所述（Rodríguez-Castejón等人，2022年）。简而言之，仅由Precirol? ATO 5组成的油相和水相分别加热至80°C。然后，将水相加入油相中，并进行30分钟的超声处理。siRNA载体的制备是通过将SLN与不同的成分结合来完成的：siRNA、GNs和一种多糖，分别是Dx、Gal或HA，具体方法如先前所述（Beraza-Millor等人，2023年）。根据之前研究中GNs量的优化结果，将siRNA溶液与5纳米GNs混合15分钟；使用了两种比例的GNs，分别为2.75×10^11（GN5）和1.38×10^11（GN2.5）个金分子。接着，按P:siRNA的比例为2:1（w:w）或3:1（w:w）加入P，并混合5分钟。随后，分别加入Gal、Dx或HA溶液，按多糖:siRNA的比例为0.1:1（w:w）、1:1（w:w）或0.5:1（w:w）混合15分钟。最后，将SLN加入复合物中，得到最终的SLN:siRNA比例为5:1（w:w）的载体。对于pDNA载体，遵循相同的工艺，只是将siRNA替换为pcDNA3-EGFP或pCMV6-AC-α-GLA。在某些研究中，制备了不含GN的pcDNA3-EGFP载体。

为了制备同时递送pDNA、siRNA、GNs和多糖的载体，优化了这些成分的添加顺序（图S1），以及GNs和P的用量（表S1）。在所有配方中，siRNA:pDNA:SLN的比例（w:w:w）为0.05:1:5。Dx:pDNA的比例为1:1（w:w），HA:pDNA的比例为0.5:1（w:w）。

2.3 SLN和载体的表征：尺寸、多分散指数和ζ-电位的测量
尺寸和多分散指数通过动态光散射（DLS）技术确定。ζ-电位通过激光多普勒流速计（LDV）测量。测量在ZetaSizer Nano ZS（Malvern Instruments，英国伍斯特郡）中进行，温度为25°C。DLS测量在高度稀释的MilliQ?水中进行，以确保单次散射并最小化颗粒间相互作用（Bhattacharjee，2016年；Stetefeld等人，2016年）。

2.4 稳定性研究
通过EE方法制备的含有SLN的载体（SLNET和SLNEMC3）以水悬浮液的形式在4°C下储存30天，储存在用Parafilm?密封的聚丙烯微量离心管中，以减少蒸发损失，并保存在封闭的冰箱中，从而减少暴露于环境光的影响。之后测量颗粒尺寸、多分散指数（PDI）和ζ-电位。

2.5 琼脂糖凝胶电泳分析
通过0.7%（w/v）琼脂糖凝胶电泳（使用GelRed?标记）研究了载体结合pDNA和siRNA的能力、保护pDNA免受DNase I酶切的能力以及释放pDNA和siRNA的能力。凝胶在120V下运行30分钟，使用Uvitec Uvidoc D-55-LCD 20M自动透射显微镜（英国剑桥）进行分析。通过将共递送载体直接加入凝胶中（最终浓度为0.03 μg pDNA/μL和0.002 μg siRNA/μL）来评估系统的结合能力。为了研究对DNase I酶切的保护作用，将相同浓度的载体在37°C下与1.5 U DNase I/2.5 μg DNA共孵育30分钟。然后加入SDS溶液（4% w/v），最终浓度为1%（w/v），并在室温下孵育。在释放研究中，加入SDS溶液以解离核酸。作为对照，使用了1 kb pDNA梯度和未经处理的pR-M10-αGal A以及RiboRuler Ultra低范围DNA梯度。

2.6 pDNA和siRNA在纳米颗粒表面的暴露
使用Quant-it? PicoGreen和Quant-it? RiboGreen试剂盒评估了共递送载体表面上pDNA和siRNA的暴露情况，这些试剂盒中的染料在与pDNA和RNA结合时会产生强烈的荧光。按照各自用户手册中的描述，为每种核酸制备校准曲线。共递送载体在1 x TE缓冲液中稀释，并与相应的工作试剂孵育5分钟后，在λ=480–530 nm的波长下使用Glomax?-Multi Detection System（Promega，美国威斯康星州麦迪逊）微孔板读数仪进行读取。

2.7 体外研究
2.7.1 细胞培养
用于体外研究的细胞模型是FD（IMFE-1细胞）（Shen等人，2007年）。细胞在37°C、5% CO2的空气环境中培养，每2或3天更换一次培养基，每7天传代一次。

2.7.2 转染效率
2.7.2.1 EGFP转染
IMFE-1细胞在24孔板中以每孔30,000个细胞的密度培养72小时，然后加入载体。移除0.5 mL培养基，留下足够的体积覆盖细胞，向每个孔中加入75 μL稀释在葡萄糖（5% v/v）中的载体（相当于2.5 μg pDNA和25 nM siRNA）。孵育4小时后，用2 mL新的完全培养基更新培养基。细胞继续培养48小时。为了了解转染效率（以转染细胞的比例和转基因蛋白的产生量表示），使用pcDNA3-EGFP质粒制备载体。转染效率通过用PBS洗涤细胞两次并用胰蛋白酶-EDTA裂解细胞来评估。将细胞悬浮液以1000 rpm离心5分钟后，将沉淀重悬在PBS中，并在CytoFLEX流式细胞仪（Beckman Coulter）上以525 nm（FITC通道）进行分析。转染效率计算为EGFP阳性细胞占总细胞的百分比，EGFP表达量通过平均荧光强度量化。每个样本包括10,000个记录的事件。

2.7.2.2 α-Gal A转染
转染前，细胞在6孔板中以每孔200,000个细胞的密度培养。孵育72小时后，移除1 mL培养基，并向每个孔中加入75 μL稀释在葡萄糖5%（v/v）中的载体（相当于2.5 μg pDNA和25 nM siRNA）。四小时后，更新培养基并继续培养48小时。然后，用PBS洗涤细胞两次，收集细胞并用5000 rpm离心5分钟。将细胞沉淀重悬在100 μL Milli-Q?水中并进行超声处理。

通过荧光测定法（Rodríguez-Castejón等人，2022年）检测α-Gal A的活性，以检测4-MU-α-Gal转化为产物4-MU的过程。每个样本的等分液与4-MU-α-Gal（5 mM）和100 mM的特异性α-半乳糖苷酶B抑制剂α-N-乙酰半乳糖胺在0.1 M柠檬酸钠缓冲液（pH=4.4）中在37°C下孵育30分钟。反应在30分钟后用0.1 M甘氨酸-NaOH缓冲液（pH=10.4）终止。使用Glomax?-Multi Detection System（Promega，美国威斯康星州麦迪逊）通过荧光信号（激发波长=360 nm；发射波长=450 nm）测定产物4-MU的形成量。蛋白质浓度通过Micro BCA?蛋白测定试剂（Thermo Fisher Scientific，美国伊利诺伊州罗克福德）测定。1单位的α-Gal A活性相当于在37°C下1小时内水解1 nmol底物。α-Gal A活性以4-MU nmol/h/mg总蛋白质表示。

2.7.3 IMFE-1细胞的内吞作用
为了研究IMFE-1细胞的内吞作用，将细胞在24孔板中以每孔30,000个细胞的密度培养。孵育72小时后，移除0.5 mL培养基，并向细胞中加入不同的内吞标记物：转铁蛋白（75 μg）、霍乱毒素（5 μg）和70,000 kDa Dx（500 μg）。30分钟或2小时后，用PBS洗涤细胞两次并用胰蛋白酶-EDTA裂解细胞。将细胞悬浮液以1000 rpm离心5分钟后，将沉淀重悬在PBS中，并在CytoFLEX流式细胞仪（Beckman Coulter）上以525 nm（FITC通道）进行分析。每个样本收集10,000个事件。

2.7.4 细胞结合
为了研究细胞结合情况，用荧光染料Nile Red（λ=590 nm）标记SLN。IMFE-1细胞以每孔60,000个细胞的密度接种在24孔板中并孵育48小时。转染前，移除0.5 mL培养基，并向每个孔中加入75 μL稀释在葡萄糖（5% v/v）中的载体（相当于2.5 μg pDNA和25 nM siRNA）。孵育2小时后，移除培养基，用PBS洗涤细胞两次并从板上分离细胞。将细胞悬浮液以1000 rpm离心5分钟后，将沉淀重悬在PBS中，并在CytoFLEX流式细胞仪（Beckman Coulter）上以610 nm（ECD通道）进行分析。每个样本收集10,000个事件。

在PBS（细胞条件）中制备了Nile red标记的SLNET和SLNEMC3的校准曲线，SLN的用量分别为10、20、30、40和50 μg的Precirol? ATO 5。使用GloMax?-Multi Detection System（Promega，美国威斯康星州麦迪逊）测量荧光信号（激发波长=520 nm；发射波长=580 nm）。

2.7.5 pDNA的细胞内分布
将细胞接种在4孔Millicell EZ载玻片（Millipore）中，每孔35,000个细胞的密度，并在1 mL培养基中孵育24小时。使用Label IT? Cy5标记的pDNA制备共递送载体。细胞用75 μL稀释在葡萄糖（5% v/v）中的载体处理（相当于2.5 μg pDNA和25 nM siRNA）。转染两小时后，用PBS洗涤载玻片两次，用4%的戊二醛（PFA）固定，并用DAPI-fluoromount-G?封片液覆盖。使用Leica DM IL LED荧光倒置显微镜进行分析。

2.7.6 siRNA的沉默效果
评估siRNA载体和共递送载体在IMFE-1细胞中沉默Gb3S mRNA的能力。细胞以每孔30,000个细胞的密度接种在12孔板中，转染前72小时。移除1 mL培养基，并向每个孔中加入75 μL稀释在葡萄糖（5% v/v）中的载体（相当于25 nM siRNA和2.5 μg pDNA）。四小时后，用2 mL新的完全培养基更新培养基，并继续培养48小时。通过RT-qPCR方法测定IMFE-1细胞中的Gb3S mRNA表达量（Zumbrun等人，2010年）。使用High Pure RNA分离试剂盒提取细胞总RNA，并进行DNA酶消化和反转录。使用LightCycler? FastStart DNA Master SYBR Green I和特异性引物组扩增cDNA，以定量人类Gb3S转基因和β-actin基因作为内源性参考。Gb3S基因的特异性引物对为5’-GGCAACATCTTCTTCGGAGACTTC-3′（正义）和5’-CGAACTTCCACATGAGTGCGATCC-3′（反义），β-actin基因的特异性引物对为5’-CATTGTGATGGACTCCGGAGACGG-3′（正义）和5’-CATCTCCTGCTCGAAGTCTAGAGC-3′（反义）。热循环条件为95°C预热600秒，然后是45个循环：95°C 5秒、62°C 10秒和72°C 20秒。最后，通过单次循环：95°C 60秒、70°C 60秒和95°C 1秒进行熔解曲线分析。通过??Ct方法计算沉默抑制效果。作为基因沉默的阴性对照，使用了ON-TARGETplus?非靶向siRNA（scramble），作为阳性对照使用了ON-TARGETplus? Cyclophilin B Control siRNA（Human）。

2.7.7 Gb3S酶的表达
通过免疫细胞化学方法在IMFE-1细胞中研究Gb3S酶的表达。细胞以每孔30,000个细胞的密度接种在12孔板中，转染前72小时。移除1 mL培养基，并向每个孔中加入75 μL稀释在葡萄糖（5% v/v）中的载体（相当于25 nM siRNA和2.5 μg pDNA）。四小时后，用2 mL新的完全培养基更新培养基，并继续培养48小时。通过RT-qPCR测定IMFE-1细胞中的Gb3S mRNA表达量（Zumbrun等人，2010年）。使用High Pure RNA分离试剂盒提取细胞总RNA，并进行DNA酶消化和反转录。使用LightCycler? FastStart DNA Master SYBR Green I和特异性引物组扩增cDNA，以定量人类Gb3S转基因和β-actin基因。Gb3S基因的特异性引物对为5’-GGCAACATCTTCTTCGGAGACTTC-3′（正义）和5’-CGAACTTCCACATGAGTGCGATCC-3′（反义）。热循环条件为95°C预热600秒，然后是45个循环：95°C 5秒、62°C 10秒和72°C 20秒。最后，通过??Ct方法计算沉默抑制效果。作为基因沉默的阴性对照，使用了ON-TARGETplus?非靶向siRNA（scramble），作为阳性对照使用了ON-TARGETplus? Cyclophilin B Control siRNA（Human）。

2.7.7 Gb3S酶的表达
通过免疫细胞化学方法在IMFE-1细胞中研究Gb3S酶的表达。细胞以每孔35,000个细胞的密度接种在4孔Millicell EZ载玻片（Millipore，马萨诸塞州伯灵顿）中并孵育24小时。转染前72小时，移除1 mL培养基，并向每个孔中加入75 μL稀释在葡萄糖（5% v/v）中的载体（相当于2.5 μg pDNA和25 nM siRNA）。四小时后，用2 mL新的完全培养基更新培养基，并继续培养48小时。通过RT-qPCR测定IMFE-1细胞中的Gb3S mRNA表达量（Zumbrun等人，2010年）。从细胞中提取总RNA，并使用High Pure RNA分离试剂盒进行DNA酶消化和反转录。使用LightCycler? FastStart DNA Master SYBR Green I和特异性引物组扩增cDNA，以定量人类Gb3S转基因和β-actin基因。Gb3S酶的表达量以4-MU nmol/h/mg总蛋白质表示。

2.7.8 细胞内分布
将细胞接种在4孔Millicell EZ载玻片（Millipore）中，每孔35,000个细胞的密度，并在1 mL培养基中孵育24小时。使用Label IT? Cy5标记的pDNA制备共递送载体。细胞用75 μL稀释在葡萄糖（5% v/v）中的载体处理（相当于2.5 μg pDNA和25 nM siRNA）。转染两小时后，用PBS洗涤载玻片两次，用4%的戊二醛（PFA）固定，并用DAPI-fluoromount-G?封片液覆盖。使用Leica DM IL LED荧光倒置显微镜进行分析。

2.7.8 Gb3的定量
为了定量IMFE-1细胞中的Gb3，采用了Wee-Ren等人（Ng和Narayanan，2021年）开发的方法。该方法基于使用特定的FITC标记的小鼠抗人类Gb3单克隆抗体（BioLegend；美国）。该抗体可以与总脂质提取物中的所有Gb3异构体结合，因此可以量化样品中存在的Gb3量，不论其异构体或种类如何（Krüger等人，2010年；Park等人，2003年）。使用冰冷的氯仿提取IMFE-1细胞的总脂质，并用FITC标记的小鼠抗人类Gb3单克隆抗体处理。通过在480 nm和520 nm的激发和发射波长下测量荧光信号，在GloMax?-Multi Detection System（Promega，美国威斯康星州麦迪逊）中测定Gb3的量。浓度是通过使用纯Gb3制备的标准曲线外推荧光信号来计算的。有关该方法的更详细信息，请参见补充材料中的“Gb3定量技术验证”部分（2.7.9节）。2.7.9节。

2.7.9 细胞活力
使用MTT分析对用载体处理的IMFE-1细胞的活力进行了分析。细胞在96孔板中培养，每孔1000个细胞，总培养基体积为100 μL。24小时后，移除培养基并替换为载体悬浮液，继续培养4小时。再过24小时，用50 μL MTT试剂处理细胞，培养2小时后，通过GloMax?-Multi Detection System（Promega，威斯康星州麦迪逊）进行吸光度分析以测量代谢活性。

2.8 与红细胞的相互作用：溶血和凝集
根据Kurosaki等人（Kurosaki et al., 2010）描述的方案，评估了siRNA载体和共递送载体的溶血和凝集效应。新鲜血液以4000 rpm离心5分钟，然后弃去血浆和白细胞层。随后，用PBS清洗红细胞三次并离心，最后将红细胞稀释至最终浓度为5%（v/v）用于溶血研究，以及2%（v/v）用于凝集评估。在溶血实验中，载体与红细胞以1:1（v/v）的比例混合并培养60分钟。培养后，以4000 rpm离心5分钟，并使用GloMax?-Multi Detection System（Promega，威斯康星州麦迪逊）微孔板读数仪在545 nm处测量上清液中的血红蛋白释放量。溶血值以溶血缓冲液阳性对照的百分比（100%）表示。

2.9 统计分析
结果以平均值±标准差（SD）的形式报告。统计分析使用IBM? SPSS? Statics 28（IBM公司，纽约州阿蒙克）进行。通过Shapiro-Wilk检验评估样本的正态分布，通过Levene检验评估方差的齐性。不同配方之间的差异通过ANOVA和Student's t检验进行比较。

3. 结果
3.1 SLN和载体的表征：大小、多分散指数和ζ电位
表1显示了SLN的组成、粒径、多分散指数（PDI）和ζ电位。采用两种不同的方法制备SLN：溶剂蒸发/乳化（SLNEE）和热熔乳化（SLNHM）。SLN由Precirol? ATO 5、Tween 80和阳离子脂质DOTAP（SLNET和SLNHT）或DOTAP与可电离脂质MC3（SLNEMC3和SLNHMC3）或DODAP（SLNED和SLNHD）的混合物组成。粒径范围为90至230 nm，PDI值低于0.3，表明粒径均匀。表面电荷通过ζ电位表示，始终为正值。SLNHM的粒径较小，ζ电位较高（p < 0.001）。考虑到脂质组成，添加MC3或DODAP会导致粒径比仅含DOTAP的SLN更大（p < 0.001）。

表1. SLN的组成和理化特性
SLN类型 制备方案 阳离子/可电离脂质（%） Tween 80（%） 粒径（d.nm） PDI ζ电位（mV）
DOTAP MC3 0.4 0.19 1.1 ± 1.8 0.27 ± 0.01 +66.2 ± 0.8
HMC3 0.2 0.2 0.11 37.1 ± 0.8 0.27 ± 0.01 +65.5 ± 0.6
HD 0.2 0.2 0.11 35.0 ± 2.2 0.28 ± 0.01 +62.0 ± 0.9
ETE 0.4 0.11 84.9 ± 1.3 0.24 ± 0.01 +56.6 ± 2.0
EMC3 EE 0.2 0.2 0.12 30.1 ± 1.4 0.28 ± 0.01 +58.7 ± 1.1
ED EE 0.2 0.2 0.12 01.4 ± 3.5 0.28 ± 0.01 +56.9 ± 2.1

3.2 SLN和载体的表征：大小、多分散指数和ζ电位
表1显示了SLN的组成、粒径、多分散指数（PDI）和ζ电位。采用两种不同的方法制备SLN：溶剂蒸发/乳化（SLNEE）和热熔乳化（SLNHM）。SLN由Precirol? ATO 5、Tween 80和阳离子脂质DOTAP（SLNET和SLNHT）或DOTAP与可电离脂质MC3（SLNEMC3和SLNHMC3）或DODAP（SLNED和SLNHD）的混合物组成。粒径范围为90至230 nm，PDI值低于0.3，表明粒径均匀。表面电荷通过ζ电位表示，始终为正值。SLNHM的粒径较小，ζ电位较高（p < 0.001）。考虑到脂质组成，添加MC3或DODAP会导致粒径比仅含DOTAP的SLN更大（p < 0.001）。

表S1显示了siRNA载体、pDNA载体和共递送载体的大小、PDI和ζ电位。图S2、S3和S4展示了不同配方之间的大小和ζ电位，以便进行比较。发现制备共递送纳米药物的成分添加顺序至关重要。在四种制备方案（A、B、C和D）中（图S1），只有方案A和B制备出的共递送载体在4°C储存至少一周后仍能保持稳定的纳米特性。方案A和B制备的纳米药物的理化特性取决于SLN的组成，粒径范围为108 nm至300 nm，ζ电位为正（+30至+44 mV），PDI低于0.4。所有共递送载体的ζ电位均低于用于制备它们的SLN（p < 0.001）。方案A制备的载体（图S2）的粒径大于方案B制备的载体（图S2）。最大差异出现在DxP3GN5-ET（301 nm vs 244 nm）和HAP3GN5-HMC3（335 nm vs 185 nm）之间。

3.3 共递送载体的转染效率
在添加含有pcDNA3-EGFP和siRNA的共递送载体后2天，通过流式细胞术分析了IMFE-1细胞的转染效率。SLNEE制备的纳米药物的转染效率取决于阳离子和可电离脂质的组成，SLNET的转染率约为20%，SLNEMC3为40%（图3），SLNED为5%（图S5）。SLNEMC3基共递送载体的荧光强度平均值较高（图3），表明蛋白质产生较多。当载体采用SLNHM制备时，转染效率低于2%，且荧光强度接近0，无论是否含有可电离脂质。因此，这些载体被排除在进一步研究之外。

3.4 共递送载体的稳定性研究
图5显示了在4°C储存30天后，使用方案B制备的共递送载体的理化特性。总体而言，所有载体在粒径、ζ电位和PDI方面均保持良好稳定性，除了HAP2GN2.5-ET和HAP3GN2.5-EMC3在30天时粒径分别增加了90 nm和170 nm。

3.5 共递送载体的保护能力
图6展示了基于SLNEE的共递送载体结合、保护和释放siRNA及pDNA的能力，通过琼脂糖凝胶电泳进行评估。图6A和C分别对应使用P3和P2制备的Dx配方，图6B和D对应使用P3和P2制备的HA配方。

3.6 载体中GNs比例的影响
使用方案B制备的SLNEE时，评估了GNs比例（GN5和GN2.5）对共递送载体理化特性的影响。两种GNs比例均能制备出具有合适理化特性的载体。然而，在某些配方中，较低的GNs比例导致粒径减小（p < 0.001）。

3.7 细胞结合
使用Nile Red标记的载体评估了细胞结合能力，该过程不会改变粒径或ζ电位（p > 0.05，表S2）。首先，我们确认了尼罗红标记的载体在SLNET和SLNEMC3之间的荧光强度是相当的（见图S9）。图8显示了转染共递送载体后2小时的细胞结合程度。所有配方都实现了接近100%的阳性细胞，除了HAP3GN5-ET，其平均阳性细胞比例为80%（见图8A）。在荧光强度方面，使用SLNET制备的纳米载体的荧光强度低于使用SLNEMC3制备的纳米载体（见图8B）。与其较低的细胞结合率一致，HAP3GN5-ET在所有评估的配方中也显示出最弱的荧光信号。下载：下载高分辨率图像（279KB）下载：下载全尺寸图像图8. 转染后2小时，共递送载体在IMFE-1细胞中的细胞结合情况。数据以平均值±标准差表示；n=3。（A）转染共递送载体后的阳性细胞百分比。（B）转染共递送载体后的平均荧光强度。数据以平均值±标准差表示；n=3。A.U.：任意单位。* p<0.001。

3.8. pDNA的细胞内分布
图9显示了用Label IT? Cy5标记的pDNA在IMFE-1细胞中经选定共递送载体处理后的细胞内分布情况。正如预期的那样，当细胞暴露于裸露的pDNA或裸露的siRNA时，未检测到细胞内荧光（数据未显示）。含有较少GNs（GN2.5）的载体产生的荧光信号比含有较多GNs（GN5）的载体更强，这可能反映了较高GNs含量带来的更强DNA凝聚能力。基于Dx的纳米载体的荧光信号明显弱于含有HA的载体，这与HA能够抵消P引起的强DNA凝聚作用一致。最显著的细胞内荧光出现在用HAP2GN2.5-ET、HAP2GN2.5-EMC3、HAP3GN2.5-ET和HAP3GN2.5-EMC3处理的细胞中。关于SLN组成，基于SLNEMC3的载体诱导了更高的荧光水平，这可能归因于它们较低的表面电荷，从而降低了DNA的凝聚能力。下载：下载高分辨率图像（177KB）下载：下载全尺寸图像图9. 转染不同共递送载体后，pDNA在IMFE-1细胞中的细胞内分布。蓝色：用DAPI标记的细胞核。红色：用Label IT? Cy5标记的核酸的荧光信号。刻度尺=15 μm。（有关此图例中颜色参考的解释，请参阅本文的网页版本。）

3.9. α-半乳糖苷酶A活性
为了评估共递送载体在体外诱导α-Gal A合成的能力，在转染携带pCMV6-AC-αGLA的载体后48小时，测量了IMFE-1细胞内的α-Gal A活性（见图10）。未经处理的细胞的基线α-Gal A活性为13 nmol/h/mg蛋白，并将结果与使用Lipofectamine? 2000制备的pCMV6-AC-αGLA（阳性对照）进行了比较。除了DxP3GN5-ET、HAP2GN5-ET和HAP3GN5-ET外，所有配方都显著增加了细胞内的α-Gal A活性。HAP2GN2.5-EMC3的活性最高（118 nmol/h/mg），其次是DxP2GN2.5-EMC3和HAP3GN2.5-EMC3（分别为82和77 nmol/h/mg）。减少GNs含量导致DxP3GN2.5-ET、HAP2GN2.5-ET、DxP2GN2.5-EMC3和HAP2GN2.5-EMC3配方的α-Gal A活性显著提高，与各自的GN5配方相比。下载：下载高分辨率图像（141KB）下载：下载全尺寸图像图10. 经共递送载体处理后，IMFE-1细胞中的α-Gal A活性。数据以平均值±标准差表示；n=3。* p<0.001。# p<0.001（与使用不同SLN制备的相同载体相比）。

3.10. siRNA的存在是否影响α-Gal A表达的转染效率
为了确定siRNA在共递送系统中的存在是否影响α-Gal A表达的转染效率，将酶活性与仅用pDNA制备的载体转染后的酶活性进行了比较。使用不含siRNA的SLNEMC3载体获得的α-Gal A活性与相应的共递送载体获得的活性相当（见图10和图S10）。对于基于GN5的载体，当仅与pDNA一起配制时，α-Gal A活性更高。相比之下，在共递送载体中，GN2.5配方的α-Gal A活性更强。这种行为不受所使用的多糖（Dx或HA）的影响。

3.10. 基因沉默效果
图11显示了基于SLNEE的共递送载体在IMFE-1细胞中的基因沉默效果，通过RT-qPCR在转染后48小时量化Gb3S mRNA的表达来确定。作为阴性对照，在用pEGFP制备的基于SLN的共递送载体中配制了一个不诱导基因沉默的随机siRNA序列；这并没有导致Gb3S水平的任何降低，从而证实观察到的沉默效果来自治疗性siRNA。下载：下载高分辨率图像（174KB）下载：下载全尺寸图像图11. 共递送载体在IMFE-1中的Gb3S基因沉默效果。数据以平均值±标准差表示；n=4。* p<0.001（不同配方之间）。# p<0.001（使用DOTAP或DOTAP/MC3制备的载体之间）。减少纳米载体中的GNs含量增强了所有基于SLNET和SLNEMC3的配方的沉默效果。对于含有P3的Dx载体（DxP3GN5-ET和DxP3GN5-EMC3），沉默效率约为10%。加入SLNEMC3提高了DxP3GN2.5-EMC3和HAP2GN5-EMC3载体的沉默活性。总体而言，显示出最高沉默活性的配方为：DxP2GN2.5-ET、HAP2GN2.5-ET、HAP3GN2.5-ET、DxP2GN2.5-EMC3、DxP3GN2.5-EMC3、HAP2GN5-EMC3、HAP3GN2.5-EMC3和HAP3GN2.5-EMC3。还评估了仅含siRNA（不含pDNA）的载体的沉默效果（见图S11）。在这种情况下，含有SLNET的载体实现了大约80-90%的沉默水平，超过了相应的SLNET共递送配方。对于仅含siRNA的SLNEMC3载体，沉默能力约为70%。

3.11. Gb3S酶表达
通过在转染后7天和15天对IMFE-1细胞进行免疫细胞化学分析研究了Gb3S酶的表达。图12显示了未经处理的细胞和用选定共递送载体处理的细胞在两个时间点的荧光显微镜图像，而所有测试配方的图像见图S12。在未经处理的细胞中，对应于Gb3S的绿色荧光非常丰富，并且在每个细胞中都能检测到。相比之下，用共递送载体处理的细胞在转染后7天仅显示出极少的Gb3S荧光。在15天时，所有条件下的Gb3S水平仍然较低，尽管荧光强度比7天时更高。下载：下载高分辨率图像（276KB）下载：下载全尺寸图像图12. 用共递送载体转染的IMFE-1细胞中的Gb3S免疫细胞化学分析。蓝色：用DAPI标记的细胞核。绿色：Gb3S的荧光信号。放大倍数：20倍。刻度尺：100 μm。（有关此图例中颜色参考的解释，请参阅本文的网页版本。）

3.12. Gb3的定量
还量化了共递送载体减少Gb3合成的能力。在转染IMFE-1细胞后7天和15天测量了Gb3水平。在两个时间点，所有载体都显著降低了Gb3水平（见图13A），并且某些配方的7天Gb3水平低于定量下限。在15天时，最有效的减少Gb3的载体是DxP3GN2.5EMC3和HAP2GN2.5EMC3。下载：下载高分辨率图像（110KB）下载：下载全尺寸图像图13. 用不同载体处理后IMFE-1细胞中的Gb3定量。（A）用不同共递送载体处理后IMFE-1细胞中的Gb3定量。（B）用不同pDNA或siRNA载体处理后7天和15天IMFE-1细胞中的Gb3定量。NT：未经处理的细胞。数据以平均值±标准差表示；n=2。* p<0.001（与7天处理的细胞相比）。# p<0.001（与15天处理的细胞相比）。虚线：定量下限。图13B显示了用含pDNA或siRNA单独处理的IMFE-1细胞中的Gb3水平。总体而言，含pDNA的载体比含siRNA的载体减少了更多的Gb3。通常，单一核酸载体（pDNA或siRNA）降低Gb3水平的能力低于相同组成的共递送载体（P、多糖和SLN）。

3.13. 细胞活力
在IMFE-1细胞中转染共递送载体24小时后，使用MTT测定法测量了细胞活力。图15显示，共递送载体导致细胞活力降低，尽管始终大于或等于80%。含有SLNEMC3的载体提供的细胞活力低于SLNET载体，特别是DxP3GN2.5-EMC3和HAP3GN2.5-EMC3配方。对于siRNA载体，细胞活力约为100%（见图S14）。下载：下载高分辨率图像（190KB）下载：下载全尺寸图像图15. 加入共递送载体24小时后IMFE-1细胞中的活力。NT：未经处理的细胞。数据以平均值±标准差表示；n=3。* p<0.001（不同配方之间）。

3.14. 与红细胞的相互作用：溶血和血凝
图16显示了共递送载体与红细胞孵育后的血凝能力。含有Dx的载体引起了红细胞的凝集，特别是那些用SLNET制备的载体。对于这些载体，增加P的比例（P3）减少了凝集效应。相比之下，含有HA的载体没有观察到凝集现象。下载：下载高分辨率图像（299KB）下载：下载全尺寸图像图16. 共递送载体的血凝效应。阳性对照：Poly-l-Lysine。刻度尺：50 μm。如图17所示，所有配体的共递送载体的溶血活性均低于15%。下载：下载高分辨率图像（183KB）下载：下载全尺寸图像图17. 共递送载体的溶血活性。裂解缓冲液表示100%的溶血。结果以平均值±标准差表示；n=3。

4. 讨论
纳米技术有机会设计出针对核酸、疾病和目标细胞的治疗系统，从而实现更有效和个性化的药物（Beraza-Millor等人，2024）。在这方面，能够在单一平台上共递送多种核酸的载体代表了治疗复杂疾病（如LSDs）的有希望的策略；同时还能减少制造和监管负担（Ball等人，2018）。先前的研究已经探索了使用各种纳米材料平台共递送pDNA和siRNA的应用，包括用于乳腺癌的富含精氨酸的寡肽接枝分支聚乙烯亚胺（PEI）（Lu等人，2015）；用于肝癌的聚γ-谷氨酸与PEI复合物（Peng等人，2017）或用可降解聚合物包覆的GN用于脑癌治疗（Bishop等人，2015）。
在这项工作中，开发了基于SLN和GNs（金色SLN）的共递送纳米系统，为高效的联合基因治疗平台奠定了基础。在单一纳米载体中共递送pDNA和siRNA需要控制细胞摄取和内体逃逸，以及两种大小和结合热力学显著不同的核酸的平衡凝聚和细胞内释放（Scholz和Wagner，2012；Zhu等人，2022）。与其他基于脂质纳米粒子或无机载体的系统相比（Li等人，2022；Zhu等人，2022），SLN和GNs的组合利用SLN促进细胞摄取和内体逃逸，以及GNs提供互补的核酸凝聚和稳定的能力。这些纳米系统被应用于FD，实现了编码α-Gal A的pDNA和靶向Gb3S的siRNA的同时递送，用于联合基因补充和gSRT介导的抑制策略。设计的纳米药物的功能相关性在IMFE-1细胞中进行了评估。这些细胞由于α-Gal A活性降低而在溶酶体中积累Gb3，为研究FD机制和评估潜在的治疗策略提供了相关平台（Ruiz-de Garibay等人，2015；Shen等人，2007）。
基于SLN的载体已被研究用于不同的应用（del Pozo-Rodríguez等人，2016；Gómez-Aguado等人，2021），包括用于FD的基因补充（Rodríguez-Castejón等人，2025，Rodríguez-Castejón等人，2022，Rodríguez-Castejón等人，2021；Ruiz-de Garibay等人，2015），以及最近用于gSRT（Beraza-Millor等人，2023）。本研究表明，制备顺序对于获得稳定的基于SLN的共递送系统至关重要；最佳方案首先是结合siRNA、GNs和SLNs，然后加入与P和多糖复合的pDNA。这一程序确保了核酸的有效凝聚、保护及释放，这一点通过琼脂糖凝胶电泳以及PicoGreen?和RiboGreen?检测得到了验证。SLNs通过不同的方法制备，其中HM方法由于使用了高能均质化作用，产生了较小的纳米颗粒（Graván等人，2023年）。与仅含有DOTAP作为阳离子脂质的配方相比，添加了可电离脂质（MC3或DODAP）的配方使颗粒尺寸增大，但所有SLNs都保持了正的ζ电位，这对于促进核酸吸附是必要的。通过静电相互作用将不同配体包覆在SLNs上可以产生稳定的纳米药物，其中核酸保持吸附在带正电的表面上（Beraza-Millor等人，2023年；Delgado等人，2011年；Gómez-Aguado等人，2021年；Rodríguez-Castejón等人，2025年）。多阳离子肽P因其能够增强遗传物质的核内摄取而具有实用性（Delgado等人，2012年）；在共递送系统中，P促进了pDNA的凝聚，但限制了siRNA的释放。多糖调节了载体的稳定性，并提供了额外的好处，如隐蔽性能和调节细胞摄取机制（Apaolaza等人，2014年；Delgado等人，2012年；Gómez-Aguado等人，2020年）。在本研究中，HA提高了IMFE-1细胞中pDNA的细胞内可用性（图9）。最终结构使得载体能够完全装载核酸，这一点通过琼脂糖凝胶中无游离载质（图6）和Picogreen/Ribogreen检测（图S8）以及体外观察到的一致生物学反应得到了证实。在之前的工作中，通过TEM和冷冻TEM对含有siRNA的金色SLN基载体及其最终结构进行了表征，其中清晰地展示了GNs在脂质纳米载体内的存在和分布（Beraza-Millor等人，2023年）。在此观察到的载体组装后颗粒尺寸的减小或无显著变化也在之前评估SLN作为pDNA递送系统的研究中有所报道。这种行为归因于紧凑纳米结构强大的核酸凝聚能力（del Pozo-Rodríguez等人，2009年；Rodríguez-Castejón等人，2025年；Vicente-Pascual等人，2020年）。在本研究中，GNs还通过其与核酸的已知相互作用促进了载物的压缩。因此，P介导的凝聚和GNs辅助的核酸结合共同作用可以导致表面相关核酸的更紧密包装以及部分暴露的柔性结构的塌陷，尽管加入了额外的成分，但水动力尺寸略有减小（Graczyk等人，2020年）。GNs在单一纳米药物中共同配制多种核酸方面发挥了关键作用。实际上，在之前的研究中，GNs对于基于SLN的siRNA系统的稳定组装是必需的（Beraza-Millor等人，2023年）。配方性能受核酸大小、剂量和核碱基组成的影响；因为核苷酸通过特定的碱基-表面相互作用吸附在GNs上，其吸附强度顺序为腺嘌呤 > 胞嘧啶 > 鸟嘌呤 > 胸腺嘧啶 ≈ 尿嘧啶（Dutour和Bruylants，2025年；Zhang等人，2012年）。荧光显微镜图像（图9）显示，在共递送载体中增加GNs含量增强了pDNA的凝聚，而对于siRNA，金色SLN中GNs、P和阳离子脂质的强烈凝聚限制了其细胞内检测（Beraza-Millor等人，2023年）。核酸的凝聚程度可能解释了为什么在IMFE-1细胞中，考虑到α-Gal A活性、Gb3S下调和细胞内Gb3水平，含有较低P和GN含量的配方具有更高的共递送载体效果。SLN的制备也显著影响了转染效率；尽管组成相同，SLNHM纳米药物的表现非常低（<2%），与SLNEE系统相比，这突显了技术因素在决定SLN理化性质及其对细胞行为影响方面的关键作用。阳离子ζ电位增强了与带负电的膜糖蛋白和蛋白聚糖的静电相互作用（Fr?hlich，2012年）。在这方面，基于金色SLN的纳米药物在IMFE-1细胞中的结合率接近100%；并且使用SLNEMC3配方时检测到每个细胞的荧光强度更高，反映了更高的内化效率（图8B）。内化机制和摄取率受载体理化性质的影响，直接影响转染效率（Delgado等人，2012年）。基于脂质的纳米颗粒主要通过网格蛋白和 caveolae 介导的内吞作用、巨噬作用和吞噬作用被内化（Rennick等人，2021年；Schlich等人，2021年），尽管能量独立的机制也可能起作用，具体途径取决于细胞类型（Duncan和Richardson，2012年）。在IMFE-1细胞中，网格蛋白、caveolae介导的途径和微吞噬作用可能参与共递送载体的摄取（图7）。摄取后，纳米颗粒进入早期内体，在那里酸化和酶活性可以降解核酸，因此有效的内体逃逸对于有效的细胞内递送和转染至关重要（Schlich等人，2021年）。脂质组成进一步调节了细胞内递送；可电离脂质DODAP和MC3在生理pH下保持中性；在酸性内体中获得正电荷，通过膜不稳定化促进核酸释放（Basha等人，2011年；Gilleron等人，2013年；Cheng和Lee，2016年；Sun和Lu，2023年）。这些机制特征与我们的实验观察结果一致；因为在用SLNEMC3共递送载体处理的细胞中，标记的pDNA更容易在细胞质中被检测到，这与增强的内体逃逸和更高的转染效率相符（图3和图10），进一步证实了这些配方带来的细胞内可用性的提高。然而，基于DODAP的载体显示的EGFP表达低于MC3，这可能是由于疏水结构域和脂质pKa值的差异（MC3为6.44，DODAP为5.59）（Gómez-Aguado等人，2022年），这些因素影响了内体不稳定化能力（Basha等人，2011年；Gilleron等人，2013年；Jayaraman等人，2012年）。早期内体逃逸也是实现足够沉默效果所必需的（Patel等人，2017年）；因为直接到达细胞质的siRNA量决定了治疗效果（Samaridou等人，2020年）。事实上，Gb3S基因的沉默效果至少持续15天，证实了SLNEMC3载体是最有效的。这些结果首次证明了结合基因补充和gSRT抑制的纳米药物在治疗FD方面的有效性。含有αGLA-pDNA而不含siRNA的载体比仅含siRNA的载体更有效地减少了Gb3，而共递送载体比任何单一核酸载体都实现了更大的Gb3减少，这突显了结合基因补充和gSRT的叠加潜力。这种策略对于心脏和肾脏等受FD严重影响的最严重器官可能特别相关（Branton等人，2002年；Felis等人，2020年）。实际上，FD治疗的主要目标之一是减少这些器官中的Gb3沉积（Kant和Atta，2020年；Miller等人，2020年；van der Veen等人，2020年）。从同一纳米药物中递送pDNA和siRNA可以保证两种核酸在同一细胞中的效果，α-Gal A活性减少了现有的Gb3沉积，而gSRT减少了新合成的Gb3，同时实现了交叉校正。基因补充疗法允许交叉校正，因为分泌的α-Gal A可以通过甘露糖-6-磷酸受体被邻近或远处的细胞摄取并转运到溶酶体，从而扩展其治疗效果（Domm等人，2021年；Pacienza等人，2012年）。在这方面，尽管最近的研究报告了超小配体修饰的GNs在肾纤维化（Chan等人，2023年）、神经退行性疾病（Lee等人，2026年）和肺部炎症（Liu等人，2026年）中的内在治疗效果，但在当前的FD平台中，GNs主要以技术成分的形式以低负荷掺入DOTAP/MC3-SLNs中，以稳定pDNA和siRNA的共装载和释放。因此，观察到的功能结果，即α-gal A活性和Gb3S的降低，是由载质驱动的。尽管如此，GN介导的器官特异性效应可能在FD受影响的组织（如肾脏或中枢神经系统）中进一步发挥作用，这值得未来研究。在转染研究中，即使在血清存在的情况下，共递送载体仍然有效，且不会影响IMFE-1细胞的存活率。在生物环境中，纳米颗粒迅速被生物大分子（主要是蛋白质）包覆，形成蛋白质冠层，影响毒性、生物分布、清除和免疫反应（Kobos和Shannahan，2020年；Kopac，2021年；Peigneux等人，2020年；Westmeier等人，2016年）。在含血清的培养基中进行转染更好地模拟了体内条件，强调了在生理真实环境中评估载体性能的重要性。由于金色SLN基共递送纳米药物旨在静脉给药，因此早期评估血液相容性是必要的。纳米颗粒与血液和免疫成分相互作用，其中血栓形成和免疫激活是常见的副作用（Halamoda-Kenzaoui等人，2019年；Halamoda-Kenzaoui和Bremer-Hoffmann，2018年）。颗粒大小、表面电荷和表面配体等特征决定了蛋白质冠层的形成，进而影响血液学毒性（Moraru等人，2020年；Scioli Montoto等人，2020年）。共递送载体没有表现出溶血活性，而多糖的类型对红细胞凝集有影响。只有Dx载体表现出一些溶血现象，这可能反映了HA的优越隐蔽性能。在之前的工作中，HA-SLN载体的TEM图像显示颗粒表面有一层光滑、形状良好的球形层，可能是由于HA的段环结构（Apaolaza等人，2014年）。此外，含有可电离脂质MC3的Dx基载体比DOTAP配方表现出更低的溶血现象，这与MC3载体表面正电荷数量较少一致。然而，在之前使用含有单一类型核酸（pDNA或siRNA）的Dx-SLN载体的研究中，未检测到溶血现象（Beraza-Millor等人，2023年；Delgado等人，2011年）。这些观察表明，在载体中结合多种类型的核酸不仅影响治疗效果，还影响安全性，强调了共递送纳米药物合理设计的重要性。本研究旨在开发和优化这种双重递送纳米药物。鉴于有许多相互依赖的配方变量（组装顺序、脂质组成、多糖涂层、GNs装载量和P比例），优先选择了FD（IMFE-1细胞）的相关体外模型，以有效表征和评估所设计的治疗策略。在FD小鼠模型中的体内评估，包括生物分布、肾脏和心脏的药代动力学以及安全性，是本工作范围之外的下一步。重要的是，研究小组之前的研究已经证明了基于SLN的基因递送在Fabry小鼠中的可行性（Rodríguez-Castejón等人，2025年；Rodríguez-Castejón等人，2022年；Rodríguez-Castejón等人，2021年），支持了计划中的体内转化。因此，使用这一新平台进行的未来研究将集中在确认体内的Gb3减少和系统安全性上。

5. 结论
我们报告了一个基于GNs和SLNs的混合平台，它可以共同递送GLA pDNA和siRNA来对抗Gb3S，实现在同一细胞中的基因补充和底物减少机制。生产和组成过程至关重要。一方面，通过乳化/蒸发法获得的纳米载体在效果上优于通过热熔乳化法制备的载体；另一方面，含有MC3的系统在摄取和细胞内可用性之间提供了最佳平衡。精蛋白和GNs控制了核酸的凝聚和释放；值得注意的是，较低的GNs装载量改善了功能指标，表明精细调节凝聚对于细胞质递送至关重要。在IMFE-1细胞中，优化的共递送载体提高了α-gal A活性，下调了合成酶靶点，并在至少15天内降低了细胞内的Gb3水平，细胞存活率超过80%，且溶血现象较低；HA涂层进一步增强了血液相容性。总体而言，这些数据验证了一个整合了互补基因治疗方法的共递送平台，并支持其在FD治疗中的潜力。本研究的主要局限性是其仅限于体外范围；因此，接下来需要在Fabry小鼠中进行体内评估，以确认器官水平的Gb3减少和安全性。

作者贡献声明：
Marina Beraza-Millor：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据分析、概念化。
Paula Fernández-Muro：撰写——审阅与编辑、方法学、研究。
Madalen Arribas-Galarreta：撰写——审阅与编辑、方法学。
Ana del Pozo-Rodríguez：撰写——审阅与编辑、软件、资源、方法学、资金获取、数据分析、概念化。
Alicia Rodríguez-Gascón：撰写——原始草稿、验证、监督、资源管理、项目管理、资金获取、数据分析、概念化。玛丽亚·安赫莱斯·索利尼斯（María ángeles Solinís）的职责包括：写作（包括审稿与编辑工作）、撰写初稿、数据可视化处理、成果验证、项目监督、软件开发、资源管理、项目统筹、调查研究、资金筹集、正式数据分析以及概念化工作。

贝拉萨-米洛尔（Beraza-Millor）和费尔南德斯-穆罗（Fernández-Muro）的研究工作得到了巴斯克大学（UPV/EHU）的资助（分别为项目编号PIF21/61和PIF23/45），而阿里巴斯-加拉雷塔（Arribas-Galarreta）则获得了巴斯克政府的支持（项目编号PR E_2022_1_00144）。本项目的资金支持来自西班牙教育部（MCIU/AEI/FEDER）、欧盟（项目编号RTI2018–098672-B-I00）以及巴斯克政府（项目编号IT1587-22）。