探究核苷酸长度对脂质纳米粒子结构和性质的影响

《International Journal of Pharmaceutics》：Exploring the impact of nucleotide length on lipid nanoparticle structure and properties

　　米哈尔·哈梅尔（Michal Hammel）| 范宇辰（Yuchen Fan）| 金俊烈（Lee Joon Kim）| 张楠志（Nanzhi Zang）| 肖白雪（Baixue Xiao）| 安东尼诺·卡利奥（Antonino Calio）| 叶春婉（Chun-Wan Yen）| 格雷格·L·胡拉（Greg L. Hura）
美国加州伯克利市劳伦斯伯克利国家实验室分子生物物理学与综合生物成像部门

**摘要**
脂质纳米颗粒（LNPs）是核酸（NA）治疗药物的多功能载体，包括反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰RNA（siRNA）、信使RNA（mRNA）和聚肌苷酸胞苷酸（poly-IC）。虽然已知脂质组成会影响LNPs的性质，但NA长度对其形态和内部结构的影响尚不明确，尤其是在载体与货物组装阶段。本文利用高通量小角X射线散射（SAXS）、动态光散射（DLS）和冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术，研究了混合后NA的长度和脂质组成。所有LNPs都形成了有序的NA/脂质结构，较长的NA促进了逆六方（HII）相的形成，并增加了各隔室之间的距离。相比之下，较短的NA，尤其是在含有SM102可电离脂质的配方中，更倾向于形成层状相。SAXS峰值反卷积通过“有序相的稳健性”（Robustness of Ordered Phase）因子来量化有序相与无序相，该因子与颗粒大小和封装效率相关。含有MC3可电离脂质和DOPE辅助脂质的配方表现出最稳定的HII相结构，这突显了辅助脂质曲率在隔室稳定中的作用。NA隔室化的变化表明了它们在负载能力上的差异，为不同核酸货物的LNPs设计提供了依据。

**1. 引言**
脂质纳米颗粒（LNPs）作为核酸（NA）治疗药物的重要递送平台，已成功应用于从不到20个核苷酸到数千个核苷酸的各种NA长度，用于基因治疗中的反义寡核苷酸（ASOs）和siRNA（Roberts等人，2020年；Hu等人，2020年），以及疫苗和免疫治疗中的mRNA（Ledford，2020年；Teo，2022年）。LNPs的形态，包括大小、形状和结构组织，对其稳定性（Fan等人，2024年；Oude Blenke等人，2023年；Reinhart等人，2023年）、细胞摄取（Li等人，2023年；Pattipeiluhu等人，2024年；Zheng等人，2023年）和疗效（Hammel等人，2023年；Xue等人，2025年）至关重要。理解LNPs结构与疗效之间的关系对于优化NA递送、提高递送效率和减少脱靶效应至关重要（Parot等人，2024年；Wang等人，2024年；Xue等人，2025年）。脂质组成的选择考虑了可电离脂质和辅助脂质的影响，因为LNPs的每个脂质成分都对LNPs的结构有独特贡献。脂质组成的变化会显著影响LNPs的结构，从而最终决定其稳定性和疗效（Carrasco等人，2021年；Cornebise等人，2022年；Kulkarni等人，2018年；Patel等人，2020年；Sarode等人，2022年；Siewert等人，2020年）。与脂质组成的变异性相比，人们对不同货物（特别是不同长度的NA货物）的影响研究较少。NA的长度显著影响LNPs的性质，包括颗粒大小、稳定性、封装效率（EE%）和NA递送效率。本文探讨了不同NA长度如何影响LNPs的形态，为LNPs药物的更合理设计提供了宝贵信息。

在这项研究中，我们采用了一种综合表征方法，结合了小角X射线散射（SAXS）、动态光散射（DLS）和冷冻透射电子显微镜（cryo-EM），以解析不同脂质组成和NA货物下LNPs的大小和内部结构。DLS提供了关于流体动力学大小和多分散性的关键数据，但其对内部组织的敏感性较低；相反，cryo-EM可以直观显示内部形态，但受限于低通量和有限的统计代表性（Wang等人，2023年）。我们利用高通量SAXS测量了LNPs在天然溶液状态下的整体平均电子密度，并通过将cryo-EM的直接成像结果与我们的SAXS衍生的“有序相的稳健性”（ROP）因子相关联，从而定量区分层状（Lα）、逆六方（HII）和无序相。我们的正交表征方法确保了结果的可扩展性和准确性，揭示了单一方法分析无法获得的结构细节。

LNPs的结构被描述为包裹着密集堆积核心的脂质单层（Aburai等人，2020年；Carrasco等人，2021年；Hammel等人，2023年；Kulkarni等人，2018年；Nogueira等人，2020年；Patel等人，2020年；Pattipeiluhu等人，2024年；Yanez Arteta等人，2018年），而核心可以在无序的“蠕虫状”结构（Cárdenas等人，2023年；Kulkarni等人，2018年；Unruh等人，2024年）、有序的多层Lα相（Hammel等人，2023年；Uebbing等人，2020年）、有序的逆六方（HII）（Aburai等人，2020年；Carrasco等人，2021年；Pattipeiluhu等人，2024年；Yanez Arteta等人，2018年）或偶尔高度有序的立方相（Rizwan等人，2011年；Yu等人，2023年）之间转变。此前我们证明，改变PEG脂质的化学性质（Hammel等人，2023年）会影响ASO-LNPs的内部结构和大小及其疗效。然而，NA货物的长度如何影响LNPs的结构仍不清楚（Li等人，2024年；Maeki等人，2024年）。为了填补这一知识空白，我们筛选了20种LNP配方，研究脂质和货物种类对LNPs内部结构的影响。

**2. 材料与方法**
2.1. 化学品和材料
脂质成分包括胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DSPC）、PEG化的脂质（1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000）（DMG-PEG-2k）和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺（DOPE），均购自Avanti Polar Lipids（美国）。可电离脂质MC3和SM-102分别购自MedChemExpress（美国新泽西州）和Cayman Chemical（美国密歇根州）。核酸货物包括在先前研究中使用的反义寡核苷酸（ASO，16个核苷酸）（Hammel等人，2023年；Pratsinis等人，2023年；Sarode等人，2022年）、小干扰RNA（siRNA，26个核苷酸，由Genentech合成）、信使RNA（eGFP mRNA，996个核苷酸，购自TriLink）以及双链RNA聚肌苷酸胞苷酸（poly-IC，高分子量聚肌苷酸-聚胞苷酸；1.5–8 kb），均由Nitto Avecia（美国俄亥俄州）合成和纯化。Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州）。磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）购自Gibco（美国纽约州）。柠檬酸缓冲液（25 mM，pH 4.0）在实验室使用柠檬酸二水合物（Sigma-Aldrich，美国密苏里州）和无RNA酶无菌水配制，并在使用前储存在4°C。其他所有试剂均按商业供应商提供的原样使用，无需额外纯化。

2.2. 高通量LNPs筛选
LNPs的制备采用了我们之前开发的基于机器人液体处理器的高通量相混合方法（Fan等人，2021年；Pratsinis等人，2023年）。具体而言，核酸溶液和四组分脂质混合物通过机器人液体处理器（TECAN EVO）加入到96孔板中。然后快速（0.5 mL/s）将脂质相注入并与静态核酸水相混合（每次吸移循环0.1 mL，共10次循环），使核酸负载的LNPs自组装。研究的LNPs由可电离脂质：辅助脂质：胆固醇：DMG-PEG2k以摩尔比50:10:38.5:1.5组成，其中可电离脂质为SM102或MC3，辅助脂质为DSPC或DOPE，总脂质浓度固定为1 mM。在不同NA长度下，分别将ASO、siRNA、mRNA和poly I:C等核酸货物加载到每种脂质组成中，N/P比固定为6。在含有25%乙醇和75% 25 mM柠檬酸缓冲液（pH 4.0）的缓冲液条件下进行相混合。除空LNPs外，所有配方均制备了三个独立样品，用于三次封装效率（EE）测量、DLS粒径分布和SAXS结构特征分析（见2.3节“粒径和封装效率（EE）”和2.4节“HT-SAXS数据收集与分析”）。对于某些配方，如图例5C2所示，只获得了一到两个EE的重复值。

2.3. 粒径和封装效率（EE）
LNPs的粒径分布通过DLS（Wyatt DynaPro plate reader III）测量。LNPs在PBS中稀释10倍后进行粒径测量。DLS设置如下：激光波长=825.6 nm，检测角度=150度，启用自动衰减。封装效率（EE）使用Quant-iT OliGreen ssDNA检测试剂盒（ThermoFisher Scientific）测定。简而言之，LNPs先在Tris-EDTA（TE）缓冲液或含有0.2% Triton-X 100的TE缓冲液中稀释，然后使用OliGreen（针对ASO）或RigoGreen（针对siRNA、mRNA和poly IC）进行NA浓度定量。%EE计算公式为：(1-未加载NA浓度 / 总NA浓度) * 100%。

2.4. HT-SAXS数据收集与分析
SAXS数据在劳伦斯伯克利国家实验室的高通量模式下使用Advanced Light Source SIBYLS光束线12.3.1收集（美国加州）。X射线波长设定为λ=1.216 ?，样品与探测器距离为2070 mm，散射矢量q的范围为0.01 ?-1至0.45 ?-1。散射矢量定义为q=4πsinθ/λ，其中2θ是散射角。实验在20°C下进行（Hura等人，2009年）。样品暴露10秒，探测器帧率为0.3秒，以最大化信号，并使用SAXS FrameSlice应用程序（https://bl1231.als.lbl.gov/ran）合并SAXS信号。10秒的暴露过程中未观察到辐射损伤，所有收集的帧都用于进一步分析。所有SAXS曲线可在simplescattering.com上通过入口代码XSIC0PFJ获取。

2.5. 使用洛伦兹函数进行SAXS拟合
合并的SAXS曲线使用OriginPro 2023（OriginLab Corporation，美国马萨诸塞州）绘制和分析。我们使用第一个峰（q1）来搜索更高q值的辅助峰，这基于HII、La或立方（Pn3m）相的衍射规律。当这些辅助峰无法与噪声准确区分时，特别是对于SM102配方中观察到的宽峰，我们依赖cryo-EM成像来验证所分配的相。主要和次要HII峰的初始位置定义为q0、q1=√3*q0和q3=√4*q0。Lα峰的位置位于q约0.14–0.15 ?-1（d约44–41 ?）范围内，根据SAXS信号估算。Lα峰定义为q0、q1=√3*q0和q3=√4*q0。从一级峰q1位置出发，使用布拉格方程计算有序结构的重复距离：d=2π/q0。主要SAXS峰通过OriginPro内置的多峰洛伦兹拟合在批处理模式下进行反卷积：y=y0 + (2*area/π)*(width/(4*(x-xc)2+width2))，其中y0是偏移量，xc是函数的中心，分别对应于分配给脂质双层和LNPs非双层中间体的SAXS峰的中心。双层结构和非双层中间体的xc上下限分别设为0.05–0.09 ?-1，HII信号的xc上下限为0.1–0.14 ?-1，Lα信号的xc上下限为0.14–0.15 ?-1。函数的宽度和面积没有限制。洛伦兹函数面积与宽度比的相对误差（分数不确定性）使用以下公式计算：SDR=area/width * √((SDarea/area)2 + (SDwidth/width)2)。

2.6. 冷冻电子显微镜成像
所有冷冻电镜网格在CEMRC GloQube上以20 mA的电流放电9秒，并在CEMRC Vitrobot Mark IV上制备，温度设定为4°C/95%湿度。新鲜制备的LNPs在原始样品浓度下成像。多余的液体通过-25的 blot力去除，等待时间为45秒，排水时间为0.5秒。所有图像均在Talos Arctica 200 KeV TEM上收集，配备Falcon III相机。从概述图中的孔洞采集图像。部分孔洞以0.96 ?的像素大小和-1.5至-2.5 μm的离焦范围或0.78 ?的像素大小和-1.5 μm的离焦范围进行更高倍数的成像。总电子剂量为60 e-/?2。

2.7. 每个LNPs中mRNA拷贝数的定量估计
为了定量估计每个LNP配方中的NA拷贝数，我们使用了Carrasco等人2021年开发的先前方法（Carrasco等人，2021年）。简而言之，通过动态光散射（DLS）测得的LNP平均直径被用来计算LNP的体积，然后该体积被填充了5种成分（4种脂质和NA），同时遵守它们的摩尔比例（可电离脂质：辅助脂质：胆固醇：DMG-PEG2k的摩尔比为50:10:38.5:1.5），并将它们的分子体积分配给LNP中的每个分子。MC3的分子体积为1.29 nm3，DSPC和DOPE为1.30 nm3，胆固醇为0.63 nm3，PEG单元为0.67 nm3，平均核苷酸为0.33 nm3，这些数据来自（Yanez Arteta等人，2018年）。SM102的分子体积为1.37 nm3，是根据平均脂质成分体积估算的（Armen等人，1998年）。H2O的体积分数是指LNP体积中被水占据的部分，可以估计为25%（Yanez Arteta等人，2018年）。该模型还通过减少LNP中NA的摩尔比例来考虑封装效率。

3. 结果与讨论
3.1. 高通量LNP配方
本研究选择了四种载荷，包括ASO、siRNA、mRNA和poly-IC（更多细节见方法部分）。每种载荷都准备了四种不同的脂质组合，以评估脂质选择对不同长度NA的影响。还准备了每种脂质组合的空LNP作为对照。在LNP配方过程中进行了相混合条件下的表征，以捕捉LNP制备的即时自组装阶段。LNP的表征包括载荷封装效率（EE）、通过动态光散射（DLS）测定粒径，以及通过高通量小角X射线散射（HT-SAXS）和冷冻电镜（cryoEM）观察内部形态。HT-SAXS能够在96孔板格式下使用最小样本体积快速收集SAXS测量数据（Hura等人，2009年）。HT-SAXS的通量与我们的自动化LNP配方系统的容量相匹配。通过冷冻电镜进一步可视化了代表性配方，以帮助区分有序NA/脂质LNP区室化信号与脂质双层或小非双层囊泡中间体的信号。我们之前的工作（Hammel等人，2023年）表明，ASO负载的LNP粒径在纯化过程中保持不变（pH 4.0到PBS缓冲液pH 7.4）。然而，纯化前后的LNP在SAXS特征上显示出轻微变化，特别是六角相特征的增强，这一点通过冷冻透射电镜得到了证实。尽管纯化和pH值从酸性变为中性可能会影响LNP结构，从而影响其进入内体的能力，但在pH 4.0的预纯化缓冲液中的LNP代表了高通量配方过程后立即出现的最一致状态。在这里，我们分析和比较了预纯化的LNP，因为这一阶段在LNP的早期筛选和开发中至关重要。
3.2. 通过SAXS和CryoEM识别NA/脂质相
所有研究的LNP都表现出明显的SAXS峰（图1），表明粒子核心中NA/脂质的高度有序区室化。d间距（d = 2π/q，其中d是NA/脂质重复区室之间的距离）在41 ?到53 ?之间变化。对于大多数研究的LNP配方，SAXS峰对应于NA/脂质在倒六角（HII）相内的排列，其特征是在q1 = q0*√3和q2 = q0*√4处有两个明显的辅助峰（图1，插图）。与MC3 LNP相比，这些辅助峰在SM102 LNP中更宽且不那么明显，表明NA/脂质区室之间的距离不规则。尽管NA长度存在显著差异，所有MC3配方都表现出相似的SAXS峰形状，MC3/DSPC LNP的d间距约为53 ?，MC3/DOPE LNP的d间距约为49 ?（图1A-B）。峰位置的一致性表明所有NA长度的NA排列都是均匀的。较长核酸（NA）的布拉格峰宽度增加表明NA/脂质区室之间的间距更加多样化。有趣的是，双链poly-IC和单链mRNA的峰形状相似，表明NA/脂质的内部区室化并不受相对较长序列核酸的具体结构的影响。相反，较小NA观察到的更明确的布拉格峰表明NA/脂质的区室化更为均匀。

下载：下载高分辨率图像（654KB）
下载：下载全尺寸图像
图1. 不同组成的LNP的SAXS轮廓比较。（A-D）LNP装载了不同类型的NA：16 nt ASO（黑色），26 nt siRNA（红色），996 nt mRNA（蓝色），poly-IC（绿色），或未装载NA（空LNP，浅灰色）。图例中突出了可电离脂质和辅助脂质的组成。HII相峰的位置在q、q*√3和q*√4处用虚线标出，并指出了它们的d间距。两种不同的HII相d间距用黑色和灰色突出显示。（右侧面板）平滑的SAXS轮廓以偏移方式显示，以突出辅助峰。SAXS轮廓使用20点窗口的相邻平均进行了平滑处理。相应的HII（灰色或黑色虚线）和Lα（红色虚线）相的辅助峰也被标出。未分配的DSPC峰在q约为0.27?-1处用蓝色虚线标出。

冷冻电镜图像进一步支持了装载不同NA载荷的MC3/DSPC配方中存在连续的NA/脂质区室，这些区室以HII相形式排列（图2A-C）。

下载：下载高分辨率图像（3MB）
下载：下载全尺寸图像
图2. 通过冷冻电镜确定SAXS峰形状和d间距。代表性的MC3/DSPC（A-C面板）和SM102/DSPC（D-F面板）组成的LNP的冷冻电镜图像。相应的SAXS轮廓以及使用三种洛伦兹函数（红色代表双层和非双层中间体信号，蓝色代表HII相，绿色代表Lα相）进行的SAXS峰拟合也被显示出来。HII和Lα相分别用蓝色和绿色括号突出显示。图g和h还显示了空SM102/DSPC和MC3/DSPC LNP的冷冻电镜图像。冷冻电镜图像中的刻度尺=100 nm。

冷冻电镜图像还显示了小的LNP非双层中间体（< N/30 nm）（Brimacombe等人，2025年）（Kulkarni等人，2018年）以及独立的无NA脂质双层或附着在LNP颗粒上的双层，也称为“泡状结构”（Cheng等人，2023年，Chen等人，2025年，Simonsen，2024年）。MC3/DSPC LNP对不同NA载荷的有效区室化也通过它们的冷冻电镜图像显示出的形态差异得到了证实（图2A-C，H）。脂质双层作为SAXS信号的一部分，在q范围0.05–0.10 ??1处形成一个肩峰，这一点通过为脂质双层模型计算的理论SAXS轮廓得到了支持（图3）。来自脂质双层的SAXS代表了有序脂质/NA相中看到的布拉格峰的形状因子。理论SAXS轮廓在q范围0.05–0.10 ??1处的肩峰与双层模型在q<0.05 ??1处的SAXS信号增加相匹配，除了在MC3/DOPE中观察到的较宽的布拉格峰（图3BD）。这表明无序NA/脂质相（如“蠕虫状”（Cárdenas等人，2023年）或小LNP中间体）的形状因子对q<0.1 ??1信号有所贡献，使得脂质双层的形状因子不那么显著。更具体地说，在四种脂质组合中，MC3/DSPC LNP显示出相对较高的双层贡献（图3A），这可能是由于LNP泡状结构的存在（图2AB和图S2）。MC3/DOPE LNP显示出最低的肩峰程度，但SAXS峰更为明显（图2D-F），表明双层贡献较小，NA/脂质有序程度较高。

下载：下载高分辨率图像（268KB）
下载：下载全尺寸图像
图3. 单层结构在配方中的存在及其对SAXS信号的贡献。比较了为单层脂质双层计算的理论SAXS曲线（灰色）和装载LNP配方的实验SAXS曲线（颜色按图例指示）。用于计算脂质双层模型的SAXS轮廓的参数：尾部长度=15 ?，头部长度=13 ?，散射长度密度（SLD）尾部=19*10-6 ?2，SLD头部=27*10-6 ?2，SLD溶剂=22*10-6 ?2。双层模型的SAXS被调整以匹配ASO-LNP配方在q范围0.05–0.1 ?-1处的SAXS特征，比例分别为（A）MC3/DSPC为1，（B）MC3/DOPE为0.25，（C）SM102/DSPC为0.3，（D）SM102/DOPE为0.17。通过冷冻电镜观察ASO-MC3/DSPC、ASO-SM102/DSPC、mRNA-MC3/DSPC、mRNA-SM102/DSPC和poly-IC-MC3/DSPC中的双层（见图S2）。

相比之下，SM102配方中的SAXS峰宽化和d间距随NA长度的变化而变化，这也表明SM102 LNP的内部形态存在变化（图1C-D）。峰宽化的存在表明NA/脂质区室化无序以及Lα相的存在。值得注意的是，当装载短长度ASO时，SM102/DSPC LNP的SAXS轮廓与空SM102/DSPC LNP相似，两者都显示出Lα相的主导（图1C）。它们相似的小d间距（41–44 ?）和冷冻电镜下的形态（图2D-G）表明短NA的包装可能不足。对于较长序列的NA，d间距增加（图3A），HII相对LNP内部结构的贡献更为显著（图1C-D），这也通过它们的冷冻电镜图像得到了证实（图2E-F）。此外，SM102配方显示的辅助峰不那么明显，表明由于NA在Lα相中的液态区室化，NA/脂质区室之间的间距不规则（Uebbing等人，2020年）。与mRNA LNP相比，双链poly-IC的布拉格峰锐度增加，与SM102中的siRNA相比，表明双链核酸可能增强了Lα相的均匀性。
3.3. 通过冷冻电镜确认空LNP中的脂质相
如冷冻电镜（图1、图2、GH、图S2）所证实的，空LNP配方的SAXS分析表明存在有序的脂质相（图S1）。这些空LNP显示的SAXS峰大小明显小于装载LNP中的峰大小，这与先前的研究结果一致，这些研究表明mRNA的区室化增强了结构有序性（Aburai等人，2020年，Uebbing等人，2020年，Yanez Arteta等人，2018年）。具体来说，空MC3 LNP显示出有序相，d间距为55 ?；对于DSPC和DOPE分别为50 ?（图5A和图S1AB）。根据SAXS辅助峰，MC3/DOPE配方可能采用立方相，而MC3/DSPC配方似乎遵循HII相（图S1A）。然而，仅从辅助峰准确区分立方相和HII脂质相是具有挑战性的，因为可能存在Lα相以及来自小颗粒和双层的形状因子贡献（图S1CD）。相比之下，SM102空LNP显示出宽的布拉格峰，这是Lα相的特征，无论使用哪种辅助脂质，d间距都保持为40 ?（图S1B）。高胆固醇（38.5%）和DSPC（10%）含量已知可以促进LNP中有序脂质相的形成（X. Wang等人，2025年），通过紧密的胆固醇-辅助脂质包装（Kumarage等人，2025年，Martinez-Seara等人，2010年）。虽然纯胆固醇/DSPC双层通常显示的d间距在49到65 ?之间（Costigan等人，2000年），但这里观察到的部分无序的Lα相表明SM102阴离子脂质破坏了这种高度有序性（Costigan等人，2000年）。相反，在LNP颗粒背景下，MC3与DOPE或DSPC结合时支持一个明显的HII相。在空LNP中观察到的HII或立方脂相（图S1）验证了现有的模拟（X. Wang等人，2025年），并表明阴离子脂质与胆固醇和辅助脂质一起可以成功建立有序相。值得注意的是，包含DSPC的配方在q=0.27–0.28?-1处显示出一个显著的峰，其起源尚不清楚（图S1）。这个峰在含有DSPC的poly-IC负载的LNP中也观察到（图1），这些LNP显示出最低的封装效率（图5C），可能导致无NA的、脂质有序相。我们假设这个在q=0.27–0.28?-1处的布拉格峰源于有序DSPC/胆固醇脂质结构的刚性（Chakraborty等人，2020年）。
3.4. 有序相的稳健性（ROP因子）
为了量化有序相（HII、Lα）、双层和非双层中间体对LNP内部结构的相对贡献，我们使用三个洛伦兹函数拟合SAXS峰（Hammel等人，2023年，Padilla等人，2025年）（图S1）。对应于HII相的洛伦兹函数基于辅助峰进行相位分配，并在47到53 ?之间变化（图1插图）。Lα相位于41到44 ?之间。背景由脂质双层和LNP中间体的形状因子得出，使用第三个洛伦兹函数进行拟合。我们对所有用三种独立重复制备的配方应用了这种拟合方法。相似的SAXS峰位由三次测量的小标准偏差表示（图4a），证明了HT-SAXS测量和数据分析的一致性。拟合方法有效地捕捉了大多数样本在q = 0.05–0.2 ?-1范围内的SAXS信号，除了含有长核酸（NAs）的MC3/DOPE配方。在这些特定的含有长NAs的MC3/DOPE案例中，SAXS曲线显示出一个不对称峰，其中HII相信号在较小的q范围内（0.1–0.125?-1）无法用单个HII-Lorentz函数充分拟合（见图S3）。这种差异可能源于存在无NA的脂质有序相的空LNPs（见图S1A）。随着NAs长度的减小，这种峰的不对称性减弱，这表明无NA的脂质相的存在减少，这与观察到的封装效率（EE）值明显降低相一致（与长NAs（mRNA或poly-IC）相比）。有序相中的这种多态性突显了当多种脂质和NA/脂质相共存时使用三个Lorentz函数进行拟合的局限性。

下载：下载高分辨率图像（351KB）
下载：下载全尺寸图像

图4. 独立制备样品之间的SAXS曲线拟合一致性。A) SAXS峰中心显示为平均值（n = 3，空LNPs为n = 1），表示由不同长度NA负载的LNP配方的d间距（Y轴）。误差条代表测量峰中心的标准偏差。B-C) ROP因子显示为平均值（n = 3，空LNPs为n = 1），表示由不同长度NA负载的LNP配方的d间距（X轴）。误差条代表Lorentz函数面积与宽度比值的相对误差（分数不确定性）（见第2.5节）。

下载：下载高分辨率图像（757KB）
下载：下载全尺寸图像

图5. NA负载和脂质组成对LNP结构、粒径和货物封装的影响。

为了定量比较有序脂质相与LNP中间体和双层结构之间的差异，我们使用了有序相的稳健性（ROP）因子。ROP因子定义为Lorentz函数面积与其半高宽（FWHM）的比值，同时捕捉有序相的丰度和均匀性（见图4B, C）。具体来说，Lorentz函数面积反映了HII或Lα相的结构因子。相比之下，峰宽表示相的均匀性，较宽的峰表明结构多态性增加。与仅测量相均匀性的标准布拉格峰宽不同，ROP因子提供了一个综合指标，用于评估在相同实验条件和脂质浓度下收集的SAXS数据的整体质量。虽然ROP因子是一个基于仪器的经验值而非通用常数，但它作为一个无量纲的指标，适用于在相同条件下比较SAXS数据。准确的计算需要基于辅助峰位和固定基线y0 = 0来精确定位Lorentz函数。三次测量的低标准偏差证实了这种拟合方法的高重复性（见图4B, C）。我们的分析表明所有NA都被强烈地封装到HII相中，只有使用SM-102/DSPC配制的短NA是一个显著的例外，这些短NA表现出显著的Lα相贡献。

3.5. 将ROP因子与LNP大小、封装效率（EE）和每个LNP中的NA链数量相关联

HII和Lα ROP因子的比值提供了关于相分布的额外见解（见图5A），这些见解可以与粒径（见图5B）、封装效率（EE）（见图5C）以及每个LNP颗粒中的NA链数量（见图5D）进行比较。大多数配方显示出强烈的HII信号，较大的NA在相应的较大d间距下包装（见图4B和5A）。在某些情况下，检测到明显的Lα相（d间距< 47 ?，无辅助峰），这与较小的d间距相关（见图4B和5A）。最小的d间距约为41 ?，观察到的ASO-SM102/DSPC LNP的SAXS峰形和d间距与空SM102/DSPC LNP相似（见图1C）。

随着NA负载长度的增加，我们观察到由HII相主导的ROP因子增加（见图4B和5A）、粒径增加（见图5B）以及NA封装效率降低（见图5C），这是所研究LNP的普遍趋势。鉴于HII相的丰富性，NA很可能以扩展的形式包装，这导致了较大的粒径和持续的结构有序性（见图5E）。长NA的包装需要连续的NA/脂质隔室，通常每个颗粒只装载少数NA链（Li等人，2022年）（Cárdenas等人，2023年）（见图5E）。通过结合LNP的平均直径和封装效率（EE），使用已建立的方法估计了LNP中的NA链数量（Carrasco等人，2021年）。这种方法估计出直径为50 nm的LNP中含有两条1992 nt长的mRNA链，NA的装载比为6。这个值与使用多激光圆柱形照明共聚焦光谱学得到的类似大小mRNA的实验结果一致（Li等人，2022年）（见图5D）。值得注意的是，NA的负载量高度依赖于LNP的大小。对于这里研究的较大LNP，长NA链（mRNA和poly-IC）的数量在20到50之间（见图5B和5C）。相比之下，短NA链（ASO和siRNA）的数量显著更高，范围在800到2000之间。观察到HII相的ROP对于短NA和长NA都是相似的，特别是在DOPE配方中（见图4B），这表明无论NA的长度如何，它们都可以在整个颗粒中形成连续的HII相。这种连续的NA/脂质包装也通过超大规模模拟得到了支持（R. Wang等人，2025年）。

正如MC3/DOPE LNP的例子所示，阴离子MC3脂质与DOPE辅助脂质的锥形几何结构一起促进了所有长度NA负载的HII相包装（Barbieri等人，2024年；Cheng和Lee，2016年；Schober等人，2024年）（见图4B和5A）。对于MC3 LNP，用DOPE替换DSPC还导致不同NA负载长度下的d间距减少了3–4 ?。

与MC3 LNP相比，SM102 LNP通常显示出较低的ROP因子，尤其是在装载较长NA时，这从较小的圆圈大小可以看出（见图5A）。与MC3 LNP不同，用DOPE替换DSPC后，SM102 LNP在不同NA负载长度下的d间距增加了4–6 ?。SM102也被描述为一种设计用于增强mRNA包装的锥形几何结构（Binici等人，2025年；Hassett等人，2019年），而缺乏不饱和烷基尾部可能使得SM102在采用锥形几何结构方面不如MC3有效。ROP因子还显示，MC3比SM102更有效地包装短NA。然而，通过用DOPE替换DSPC，SM102 LNP中的HII包装在所有NA长度上得到了恢复（见图5A和4B），这突显了辅助脂质曲率轮廓在稳定HII相包装中的关键作用（Pattipeiluhu等人，2024年；Tesei等人，2024年）。

3.6. 总结

总之，我们全面表征了脂质成分和NA负载长度对LNP内部结构的影响。我们证明某些脂质组合在维持内部有序性方面比其他组合更为稳健，其中MC3/DOPE在不同长度的NA负载及其对LNP在HII相中的结构分隔影响方面最为一致。较大的NA，如mRNA和poly IC，形成较大的颗粒，并在HII相中具有延长的包装，这解释了HII主导的ROP因子与LNP大小增加之间的强相关性（见图5A-B）。相比之下，之前使用类似LNP配方的研究没有发现负载大小与LNP大小之间的相关性，这种差异可能归因于LNP制备程序的差异（Schober等人，2024年）。此前，我们已经证明ASO-脂质在有序HII相中的分隔对于实现体外有效的mRNA敲低至关重要（Hammel等人，2023年）。此外，还表明在HII相中包装较长的NA可以增强内体货物的释放（Schober等人，2024年）并提高LNP的效率。这些发现共同表明，HII相中的NA/脂质分隔可能是LNP配方效率的一个指标，值得进一步研究。

另一方面，短长度的NA负载，如ASO和siRNA，产生最多样化的结构，调节脂质组成可以显著改变NA/脂质的分隔。我们还展示了在相对较小的q范围内SAXS峰肩部与LNP泡状结构、空单层结构和LNP中间体之间的关系。对于有序结构，我们建议使用ROP因子来定量分析LNP的SAXS信号，并区分NA在HII相和Lα相中的包装。值得注意的是，我们的LNP筛选关注初始组装阶段，使我们能够直接评估NA大小和脂质组成如何影响LNP组装结构的初始组织。使用HT-SAXS（Hura等人，2009年）有效监控LNP的内部形态提供了对LNP配方开发的宝贵见解。通过与冷冻电镜结果相关联，我们提出HT-SAXS结合ROP因子的定量解释，是一种有效的筛选和优化LNP内部结构的方法。

（A）图4A重新绘制了总ROP因子（HII和Lα）。血浆颜色填充表示HII相和Lα相之间的ROP因子比值。颜色代码从黄色到蓝色的转变表示HII相对于Lα特征的比例，而圆圈符号的大小代表两种有序相的ROP值之和。（B）不同脂质和负载组成的LNP的粒径和多分散指数（PDI），通过DLS测量。（C）不同负载在LNP中的封装效率（EE%）。结果显示了n = 3次独立重复实验的平均值±标准偏差。（D）使用基于颗粒直径模型的分子体积模型计算出的四种配方中LNP中的NA拷贝数量，并根据封装效率进行了调整（见方法部分）。灰色符号显示了半径为50 nm、封装效率为90%的LNP中的NA拷贝数量，这与实验确定的直径约为60 nm、N/P比为6.0、封装效率为98%的1929 nt mRNA的平均NA拷贝数量相符，pH值为4.0。（E）长（左侧面板）和短（右侧面板）NA的HII相到Lα相（NA用红色表示，脂质用蓝色表示）的示意图。

4. 结论

我们的系统阐明了NA长度和脂质组成如何共同决定LNP的内部结构和性质。利用高通量SAXS和冷冻电镜，我们确定NA负载长度影响LNP的包装和结构。具体来说，较长的NA（例如mRNA、poly-IC）驱动形成具有较大隔室间距的有序逆HII相，而较短的NA（ASO、siRNA）倾向于促进Lɑ排列，尤其是在SM102配方中。新的ROP因子成功量化了这种结构秩序，显示出与封装效率和粒径的明显相关性。在所有评估的具有不同脂质组成的LNP中，MC3/DOPE组合在所有NA长度上都显示出最稳健和稳定的HII相组织，强调了辅助脂质曲率在结构稳定中的关键作用。总体而言，这些见解为LNP配方的合理设计和优化提供了重要的结构框架，指导了针对日益多样化的核酸治疗剂的更有效递送系统的开发。