利用纳米乳液模板制备的聚合物纳米颗粒进行共价功能化，以实现神经元水平上的基因沉默和抗氧化剂递送

《International Journal of Pharmaceutics》：Covalent functionalization of polymeric nanoparticles prepared from nano-emulsion templates for gene silencing and antioxidant delivery at neuronal level

　　马塔·贝尔-埃斯特韦（Marta Bel-Esteve）、马克·卡拉斯科（Marc Carrasco）、努里亚·莫拉尔（Núria Moral）、安娜·阿维尼奥（Anna Avi?ó）、卡梅·法布雷加（Carme Fàbrega）、拉蒙·埃里查（Ramon Eritja）、何塞·安东尼奥·德尔·里奥（Jose Antonio del Río）、霍尔迪·杜兰（Jordi Duran）、克里斯蒂娜·福尔纳瓜拉（Cristina Fornaguera）、卡洛斯·罗德里格斯-阿布雷乌（Carlos Rodríguez-Abreu）、圣地亚哥·格里哈尔沃（Santiago Grijalvo）
西班牙巴塞罗那Jordi Girona 18-26号IQAC，CSIC，邮编E-08034

**摘要**
基于聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）的聚合物纳米颗粒（PLGA NPs）已被证明是有效的药物递送系统。其表面存在的羧酸基团有助于开发多功能纳米颗粒，通过协同效应提高治疗效果。本研究描述了使用油包水（O/W）聚合物纳米乳液制备PLGA NPs的方法，该乳液是通过低能量乳化法生成的。迷迭香酸（RA）是一种具有神经保护作用的植物化学物质，而被选为要包封的植物化学物质；反义寡核苷酸（ASO）则被选为用于修饰PLGA纳米颗粒表面的配体，旨在增强ASO向神经细胞的递送。物理化学表征证实，RA和ASO的引入保持了胶体稳定性，对颗粒大小、表面电荷或形态没有不良影响。体外控制释放实验显示，在24小时内RA的累积释放量约为12%，这一过程遵循半Fickian扩散机制，并通过不同的方程模型进行了调整。重要的是，RA的包封显示出可测量的自由基清除能力，EC50值为76 ± 0.9 μg·mL?1。细胞培养实验证实了其在非癌细胞系（HEK293）和神经母细胞瘤细胞模型（SH-SY5Y）中的生物相容性。摄取研究表明，PLGA NPs能够被SH-SY5Y细胞和原代小鼠神经元有效内化，从而抑制荧光素酶的表达（53.7 ± 7.9%）。这些结果共同表明，这种PLGA纳米平台能够同时结合抗氧化剂载荷和共价接枝的反义寡核苷酸，允许独立评估神经模型中的氧化还原调节和基因沉默效果。

**引言**
纳米技术在制药领域的应用涉及制备生物相容性纳米结构，以促进靶向药物递送，包括在诊断、再生医学和成像中的多种应用（Durgam和Oroszi，2025；Carton和Malatesta，2025）。纳米颗粒（NPs）在提高活性物质的疗效和安全性方面发挥着关键作用，通过增强生物利用度、促进靶向递送以及延长其在特定器官或组织中的效果（Dolai等人，2021；Wang等人，2024）。
NPs可以由多种材料制成，包括金属、聚合物或脂质，这些材料为包封和容纳不同的活性成分（如化疗药物、蛋白质、造影剂或核酸）提供了灵活的平台。在这方面，聚合物NPs因其能够根据特定外部刺激定制适应性结构而受到广泛关注（Elsabahy和Wooley，2012）。事实上，这类NPs正在不断发展中，以改善多种疾病的治疗和诊断，特别是在癌症治疗方面。
聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）是一种可生物降解且生物相容的聚合物，已获得FDA批准用于人类使用，在生物医学应用中取得了显著成功。其降解产物为乳酸和羟基乙酸，这两种物质均天然存在于体内，并可通过克雷布斯循环有效代谢（Jain，2000）。已经开发了多种方法来控制PLGA NPs的参数，如粒径分布、形状或ζ电位。这些方法可以分为自下而上和自上而下的方法。前者包括从相应单体开始的乳化、微乳化、界面聚合或沉淀聚合。相比之下，后者可以通过乳液蒸发、乳液扩散或盐析过程使用预先形成的聚合物来获得NPs（Astete和Sabliov，2006）。尽管这两种方法可以互换使用，但使用预先形成的聚合物更具优势，因为它减少了引发剂或副产物的存在，并避免了不必要的交叉反应（Vauthier和Bouchemal，2009）。因此，自上而下的方法通常能提高系统的生物相容性，减少纯化步骤的需求。
许多PLGA NPs的制备方法依赖于纳米乳液（NE）模板（Grijalvo和Rodriguez-Abreu，2023）。NE的特点是液滴尺寸通常在20至200纳米之间，由于液滴的纳米级尺寸而表现出优异的动力学稳定性，并且看起来是透明到半透明的。这些特性使NE能够抵抗分层或沉淀的不稳定过程（Homs等人，2018）。NE可以通过低能量自发乳化技术生产，包括低能量相变温度（PIT）和低能量相变浓度（PIC）（Anton等人，2008；Solan斯和Solé，2012）。在低能量乳化方法中，PIC方法在可扩展制造方面具有明显优势，因为它依赖于渐进的组成变化而不是突然的温度变化，适用于含有热敏成分的系统。因此，与高能量乳化方法相比，该方法有利于生产更小尺寸的液滴，同时保持较低的聚分散指数（PDI），并保持恒定温度。此外，PIC过程不受POE型表面活性剂的限制，提供了更广泛的配方灵活性，同时仍广泛用于O/W和W/O NE的制备（Solan斯和Solé，2012；Solan斯等人，2005）。
植物化学物质在保护细胞和组织免受活性氧（ROS）积累引起的损伤方面非常有效（Holst和Williamson，2008；Hui等人，2024；Lan等人，2024）。事实上，高水平的ROS会导致氧化应激（OS），从而导致显著的细胞损伤和功能丧失。证据表明，ROS水平升高是许多神经退行性疾病的关键因素（Singh和Devasahayam，2020），包括阿尔茨海默病（Bai等人，2022）、帕金森病（Dorszewska等人，2021）或肌萎缩侧索硬化症（Xiong等人，2022）。迷迭香酸（RA）是一种咖啡酸衍生物，是一种强效的抗氧化剂和抗炎植物化学物质，已知可以调节与神经退行性疾病相关的关键途径，包括氧化应激的解毒、脂质过氧化的减少以及ROS驱动的神经元损伤的减轻。这些机制与氧化应激作为主要病理驱动因素的疾病直接相关（例如，阿尔茨海默病、帕金森病、ALS）（Gok等人，2018；Thingore等人，2021；Fadel等人，2011；Petersen，2013）。此外，Hase等人报告了一种新的机制，说明RA能够在动物模型中抑制β-淀粉样蛋白（Aβ）的积累（Hase等人，2019）。然而，其亲水性限制了其穿越血脑屏障（BBB）的能力，从而减少了其在大脑中的积累。此外，其快速的代谢、分布和清除特性突显了开发潜在药物制剂的必要性，以实现靶向和持续的作用（Hitl等人，2021；Wang等人，2025）。在这方面，已经发表了几篇关于利用植物化学物质封装以增强其治疗特性的综述文章（Squillaro等人，2018；Melim等人，2022；Ahmad等人，2021；Oladipupo等人，2025；Zuccari和Alfei，2023；Civelek等人，2024）。具体来说，已经提出了使用介孔二氧化硅NPs（Song等人，2025）、基于脂质的配方（包括脂质体载体Xue等人，2021）、固体脂质NPs（Campos等人，2014）、含有壳聚糖的聚合物载体（Huerta-Madronal等人，2023；Da Silva等人，2015）、PLGA（Solak等人，2025）、聚丙烯酰胺-心磷脂-PLGA NPs（Kuo和Tsai，2018）或聚乳酸（PLA）和PLGA微载体（Gimenez-Rota等人，2019）作为RA递送的潜在载体。值得注意的是，纳米沉淀（Solak等人，2025）或高能量乳化方法（结合PLGA聚合物核心和脂质成分Kuo和Tsai，2018）是PLGA基聚合物NPs中RA封装的主要/主导方法。
特别是，低能量乳化策略的应用，特别是通过PIC方法生成的油包水（O/W）NE模板，在RA的封装方面很少被探索。先前的研究表明，基于PIC的方法可能在室温下有效制备纳米颗粒。这种策略允许将RA纳入PLGA聚合物基质中，降低了处理复杂性，同时保持了包封植物化学物质的结构完整性（García-Melero等人，2022；Lopez-Mitjavila等人，2025）。
近年来，基于核酸的疗法因能够选择性地调节蛋白质编码和非编码遗传靶点而受到广泛关注（Naeem等人，2025）。多种类型的核酸制剂，如siRNA、mRNA、适配体和反义寡核苷酸（ASOs），已获得临床应用的监管批准（Liu等人，2025）。ASO疗法已成为治疗遗传疾病的验证策略。ASOs是单链核酸片段——通常长度在13到30个核苷酸之间——经过工程改造，能够通过Watson-Crick碱基配对选择性地结合目标mRNA序列。这种相互作用要么阻止蛋白质翻译，要么激活RNase H降解mRNA，从而沉默基因表达。近年来，FDA批准了多种基于ASO的药物，证明了其临床潜力（Kozlov等人，2025）。尽管取得了这些进展，ASO仍面临若干挑战，包括细胞摄取不良（Kim等人，2024）。
大量的研究工作继续致力于改进核酸的递送，包括依赖化学偶联（Kashyap和Booth，2024）或与核酸结合的载体系统（Gonzalez等人，2025）来增强其细胞内化。
PLGA纳米颗粒已被广泛研究作为治疗递送平台。定制其表面可以影响关键的物理化学性质和生物学行为（Elsabahy和Wooley，2012），并可能有助于改善PLGA基纳米载体在生理条件下的功能性和整体性能（El-Hammadi和Arias，2022）。
在我们正在进行的研究中，我们专注于为生物医学应用工程化PLGA基聚合物（NPs），最近报道了通过碳二亚胺反应和硫醇-Michael加成反应制备装饰有氟尿嘧啶寡聚体和叶酸的多功能聚合物纳米颗粒（Barnaud等人，2024）。基于这种方法，并利用PLGA NPs表面的羧酸基团，我们设想将反义寡核苷酸（ASO）接枝作为一种策略来促进基因表达抑制。
共递送系统已被证明可以通过促进协同效应来提高治疗效果，优于使用单一纳米载体的方法（Zeinali等人，2020；Ashrafizadeh等人，2020）。在这方面，已经报道了使用基于脂质的配方（Lee等人，2024；Jagaran等人，2024）或聚合物NPs（Stevanovi?等人，2025；Mennati等人，2022）同时递送核酸和天然化合物或小分子药物的策略。
与静电组装的核酸纳米载体或阳离子递送系统不同，当前策略依赖于共价ASO表面附着，结合在通过PIC低能量NE模板制备的可生物降解PLGA基质中的植物化学物质封装（图1）。这种设计的目的不是最大化ASO的释放或转染效率，而是建立一个稳定且模块化的平台，以便在神经元条件下同时研究表面结合的寡核苷酸递送和细胞内抗氧化剂的释放。使用Renilla荧光素酶靶向ASO作为模型序列，评估了细胞内化、基因沉默效率以及表面功能化对胶体稳定性的影响。这种报告系统有助于对递送平台进行稳健的验证，从而促进向治疗相关ASO序列的转化。
此外，我们还研究了蛋白质冠层（PC）形成对纳米颗粒行为的影响，包括RA释放动力学、抗氧化剂和活性氧（ROS）清除活性、生物相容性以及在神经细胞系（SH-SY5Y）和原代小鼠神经元培养中的细胞摄取。总体而言，这些发现为进一步优化纳米平台提供了基础，并可能为其适应涉及疾病相关寡核苷酸序列的更具代表性的神经疾病模型提供信息。

**材料**
所有溶剂和化学品均为试剂级，按原样使用。聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）（分子量104 g·mol?1）购自Boehringer Ingelheim（德国Ingelheim am Rhein），用作生物相容且可生物降解的聚合物。纯度为97%的迷迭香酸（RA）购自Alfa Aesar（美国马萨诸塞州Haverhill）。聚山梨酯80（Tween 80）购自Croda（英国Snaith）。用于制备磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）的氯化钠（NaCl）

**功能化聚合物纳米颗粒的制备和表征**
低能量乳化和PIC方法为将小分子封装在聚合物网络中提供了直接的方法。这种方法允许精确控制颗粒大小，从而获得低PDI值的纳米颗粒（NPs）。未包封RA的PLGA NPs（原始NPs，1）和包封了0.2 mg·mL?1 RA的PLGA NPs（负载RA的PLGA NPs，2）是通过O/W NE模板并采用蒸发过程制备的（García-Melero等人，2022）。

**结论**
基于PLGA的聚合物纳米颗粒（原始和负载RA的）是通过PIC方法的低能量乳化从O/W NE模板制备的。这些纳米平台的目的是并非要超越现有的ASO递送技术，而是提供一个多功能框架，该框架能够在低能耗条件下将共价寡核苷酸的释放与抗氧化剂的封装整合到同一个PLGA载体中。因此，利用纳米颗粒（NP）上存在的羧基团……

**生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的声明**
在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT v3.5来改进语言表达和文章的流畅性。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对出版物的内容负全责。

**作者贡献声明**
Marta Bel-Esteve：方法学、研究、形式分析。
Marc Carrasco：方法学、研究、形式分析。
Núria Moral：方法学、研究、形式分析。
Anna Avi?ó：写作——审稿与编辑、方法学、研究。
Carme Fàbrega：写作——审稿与编辑、验证、监督。
Ramon Eritja：写作——审稿与编辑、监督、资金获取。
Jose Antonio del Río：写作——审稿与编辑、研究。
Jordi Duran：写作——审稿与编辑、资金获取、形式分析。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

**致谢**
本研究得到了以下项目的支持：
- （AEI）PID2021-122187NB-C31和PID2024-159704OB-I00（由MCIN/AEI/10.13039/50110 00110 33资助，分别针对CR和CF）；
- 欧洲区域发展基金（ERDF）“A way of making Europe”；
- 卡洛斯三世健康研究所（ISCIII）（CB06/01/1058和CB06/01/0019）。
作者还感谢西班牙科学与创新部（MCIU/FEDER/AEI）（PID2020-118699GB-100）以及Ramón Areces基金会对JD的支持。CF感谢……

（注：部分内容在翻译过程中进行了简化和调整，以保持清晰性和准确性。）