关于超声响应型可植入药物输送系统的机制学见解

《International Journal of Pharmaceutics》：Mechanistic insights into ultrasound-responsive implantable drug delivery systems

　　鲁宇杰｜Mohammad Albraikat｜Juan L Paris｜高嘉琪｜杨海东｜Masoud Adhami｜Eneko Larra?eta
贝尔法斯特女王大学药学院，英国贝尔法斯特

**摘要**
刺激响应型药物输送系统已被广泛研究，以实现可控的、特定位置的药物释放。在各种刺激因素中，超声波作为一种外部触发器具有多项优势，包括成本效益高、深组织穿透能力强以及精确的时空控制能力。尽管与水凝胶和微泡相关的系统已得到充分研究，但储库型植入物由于其长期治疗的潜力却仍未被充分探索。本研究开发了一种可生物降解的聚合物储库植入物，该植入物配备有多孔的速率控制膜，并对其超声波响应行为进行了系统的评估。通过温度监测、机械指数计算和组织学分析评估了生物安全性，最终选择了3 MHz、3 W/cm2的超声波在5分钟内作用，温度升高9.13°C作为安全操作条件。在这种设定下，超声波显著增强了药物释放效果，大约提高了9.7倍，同时未改变释放膜的结构特性。总体而言，这些发现为超声波响应型储库植入物的机制提供了见解，并支持其在需要可控、按需药物释放的慢性疾病管理中的应用。

**1. 引言**
为了应对人体生理的复杂性和变异性，药物输送系统得到了广泛的发展，以实现可控的、特定位置的以及适应性药物释放。近年来，刺激响应型系统因能够通过特定触发器调节药物释放动力学或位置选择性而受到广泛关注。根据刺激的来源，这些系统大致可以分为内部刺激和外部刺激两类。内部刺激（如pH值、温度、氧化还原电位和酶活性）通常与病理组织的局部微环境相关（Liu等人，2017年）。当这些内部刺激被触发时，可以实现位置选择性的药物释放。然而，内部刺激响应系统的最大局限在于难以控制药物释放的程度，因为不同患者和疾病状态的生理条件存在差异，可能导致剂量不准确或局部毒性（Sun和Jiang，2023年）。相比之下，外部刺激（包括光（光响应）、电场（电响应）、磁场（磁响应）、热（热响应）和声波（超声波响应）（Zhang等人，2022年）允许通过精确的时空应用来调节位置选择性和“开-关”释放动力学。其中，超声波响应系统具有成本效率高、非侵入性、高组织穿透能力和精确的时空控制等优点（Boissenot等人，2016年；Zhang等人，2022年）。因此，超声波响应型药物输送系统在实现更可及且成本效益更高的治疗策略方面具有巨大潜力。作为一种诊断工具，超声波在临床应用中得到了广泛应用，因为其能量不会发生电离（Bader等人，2025年）。值得注意的是，尽管超声波不涉及电离，但在足够暴露下仍能产生显著的生物效应（Bader等人，2025年；Fowlkes等人，2008年）。治疗性超声波通过热效应和空化作用暂时增加细胞膜通透性（Sirsi和Borden，2014年；Tu等人，2021年）。在药物输送方面，这些效果为促进药物溶解和扩散提供了能量（Sirsi和Borden，2014年）。到目前为止，由于气泡的可压缩性，微泡系统与超声波响应系统已被广泛应用，而可植入设备仍处于研究阶段。作为宏观尺度的药物输送系统，可植入设备在长期治疗方面具有最大潜力（Sirsi和Borden，2014年；Zhang等人，2022年）。与其他依赖结构破坏的超声波响应系统不同，可植入药物输送设备提供了具有独特机制的长期平台，能够实现“开-关”释放模式（Sirsi和Borden，2014年）。当前的研究主要集中在基于水凝胶的系统中（Huebsch等人，2014年），而储库型植入物仍被忽视。与药物直接分散在生物相容性聚合物基质中的单体可植入设备不同，储库型植入物由一个载有药物的核心和一个聚合物膜组成，药物必须通过该膜释放（Siepmann和Siepmann，2012年）。储库型植入物的释放动力学主要由膜厚度和膜通透性决定，从而减少了浓度梯度的影响，而在单体系统中浓度梯度起了主导作用（Siepmann和Siepmann，2012年）。由于在药物释放过程中浓度梯度不断变化，这通常是单体植入物观察到的非线性释放行为的主要因素。通过减少浓度依赖性释放的影响，储库型植入物能够实现更精确控制的、接近零级释放曲线（Stevenson等人，2012年；Yang和Pierstorff，2012年）。传统上，储库型植入物中的聚合物膜由不可生物降解的材料制成，如硅胶，这需要在使用完药物后进行侵入性移除程序（Larra?eta等人，2021年）。近年来，越来越多的研究致力于通过用多孔的可生物降解速率控制膜替代不可生物降解膜来开发完全可生物降解的储库型植入物（Li等人，2021年；Picco等人，2022年；Waterkotte等人，2022年），本研究采用了这种设计。虽然零级释放可以确保单位时间内稳定剂量，但被动植入系统仍然采用“一刀切”的药物输送方法。相比之下，主动植入配置可以根据个别患者的需求提供定制剂量。

**2. 材料与方法**
**2.1. 可植入设备的制备与表征**
基于药物储库的物理状态，制备了两种类型的可植入设备。对于固体药物装载，制备了一种圆柱形储库型植入物（图1），包括聚己内酯（PCL）盖子、聚乳酸（PLA）主体、聚合物释放膜和固体药物储库。

**图1.**
(A) 固体储库植入物的示意图；
(B) 液体储库圆顶形植入物的示意图；
(C) 两种类型植入物的制备过程示意图；
(D) 体外药物释放实验装置示意图；(左) 组织学样品制备实验装置：将小猪皮肤安装在充满PBS的乳胶气球上，将超声波换能器直接应用于皮肤表面，并通过传输凝胶耦合。

盖子是通过熔化PCL（CAPA?6506，MW = 50 kDa，Ingevity，美国）并切割成10毫米圆盘制成的。主体是通过熔融沉积建模（FDM）3D打印使用的PLA丝材（Ultimaker B.V.，荷兰）制造的。释放膜是根据Korelidou等人报告的方法（Korelidou等人，2022年）使用溶剂浇铸法制备的。使用3% w/v的PLA（3D850，MW = 190 kDa，Biopolymer Ingeo?，美国）和液态PCL（CAPA? 2054，MW = 550 Da，Ingevity，美国）以1:1的重量比在30毫升二氯甲烷（Merck，德国）中制备的。对于液体药物装载（图1），用熔化的PCL密封代替了PCL盖子以适应圆顶形设计。PLA主体和释放膜的制备方法与上述相同。

固体药物储库由25% w/w FLS（MW = 376.28 Da，Sigma-Aldrich，英国）和75% w/w聚乙二醇（PEG；MW = 10 kDa，Sigma-Aldrich，英国）组成。这些成分通过真空压缩模塑（VCM；MeltPrep?，奥地利）制成约200毫克的片剂。液体药物储库通过将1毫克/毫升FLS注入圆顶形的PLA主体中，在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4；Sigma-Aldrich，英国）中填充。图1c展示了制备过程。

组装好的植入物使用立体光学显微镜（Leica EZ4W?，Wetzlar，德国）和扫描电子显微镜（SEM；Hitachi Benchtop TM3030，东京，日本）进行检测。为了观察组装后的内部结构，使用了光学相干断层扫描（OCT；Thorlabs，新泽西，美国）。

**2.2. 体外药物释放研究**
在体外药物释放研究之前进行了初步的温度表征。将60毫升PBS（pH = 7.4）放入乳胶气球中，并用透析夹具密封以减少空气进入。将治疗性超声波探头（Sun Medisys Super Pro 1300，新德里，印度）放置在气球上方，并应用超声波传输凝胶（Ana Wiz Ltd，Surrey，英国）以确保声学耦合。在超声波作用前后记录介质的温度。

植入物制作完成后进行体外药物释放评估。样品放置在60毫升PBS中，并在37°C的摇床上孵育。对于储库型植入物，在每次采样点前将释放介质完全更换为新鲜PBS。取出植入物并小心干燥后，再将其转移到新鲜的介质中以避免任何潜在的混淆效应。刺激在2小时的时间点施加，暴露时间如表1所示。然而，在超声波作用后，保留释放介质，仅抽取1毫升样品进行检测。取样体积立即用1毫升新鲜PBS补充，以保持总体积恒定。这种方法避免了在超声波作用后更换整个介质时可能出现的温度波动，从而保持了超声波诱导的热效应和温度调控的释放过程的连续性。

**表1. 不同体外释放组的超声波参数**
| 名称 | 频率（MHz） | 强度（W/cm2） | 持续时间（分钟） |
|---------------|---------|---------|-----------|组间差异通过单向方差分析（ANOVA）进行评估，用于涉及三个或更多组的比较，或者使用学生t检验进行两组之间的比较。统计显著性定义为p < 0.05。所有定量实验至少进行了三次重复（n = 3）。

3. 结果与讨论
本研究旨在设计一种可重复性的合成聚合物材料植入装置，并探讨超声波（US）如何影响这种聚合物储库型植入装置的作用机制。该植入装置易于制造，且所用原料易于获取且质量一致性好。因此，作为一种药物输送系统，这种设计能够装载不同的药物以实现不同的治疗效果，这为探索超声响应药物输送系统指明了方向。

3.1 植入物的表征
植入物是通过结合多种互补技术成功制备的（图2）。为了减少可能阻碍超声传播的空气层，设计了两种植入物几何形状（Ma等人，2020年）。这些储库包含基于PLA和PCL组合的控释膜（Korelidou等人，2022年）。载药核心使用了FLS作为模型药物，该药物与PEG通过VCM混合。有关载药核心的详细信息见支持资料。

图2：
(A) 3D打印PLA植入体的尺寸和结构特征。
(B)和(D) 显示了在光学显微镜下观察到的装载FLS的固体药物储库（直径=8毫米；高度约3毫米）。
(C) 液体储库植入体的光学显微镜图像及其尺寸。在两种设计中（A和C），释放膜朝上，底部用PCL密封。不同类型植入物的药物释放窗口尺寸保持一致。
(E) 固体储库植入体的OCT图像，其中蓝色表示释放膜，红色表示3D打印的PLA主体，绿色表示FLS药物储库，粉色表示PCL盖子。
(F) 释放膜在100倍放大下的SEM图像。

DSC、TGA、FTIR和拉曼显微镜分析（图S1）表明，在熔融过程中，PEG熔化，使得FLS颗粒分散在基质中。拉曼映射显示了FLS在基质中的分布。FTIR分析也揭示了基质中的特征FLS峰，而FLS含有片的DSC分析在大约100°C处显示出一个小的吸热峰，这是FLS的特征。相比之下，FLS含有片的TGA分析显示了FLS和PEG的特征重量损失。在植入系统的聚合物结构中存在药物晶体是常见的现象（Barrett等人，2018年；Costello等人，2023年；Zhong等人，2025年）。

3.2 体外药物释放研究
3.2.1 生物安全性的初步温度表征
超声波既会产生热效应也会产生机械效应，在不合适的条件下这两种效应都可能带来风险。已知当组织温度升高超过10°C时，蛋白质会迅速变性（Bader等人，2025年）。因此，在不同的超声强度和应用时间下测量了温度升高情况，以确保所设计植入物的生物安全性。在本研究中（图3b），1MHz、3W/cm2的连续超声照射10分钟后，介质温度升高了约13.6°C，而3MHz照射则使温度升高了15.1°C。这样的温度升高可能在几分钟内导致细胞损伤（Bader等人，2025年；Sapareto和Dewey，1984年）。

图3. 不同超声设置下的温度升高（ΔT）
(A) 显示了x轴所示设置下5分钟超声应用后的温度升高，
(B) 显示了10分钟后的温度升高，
(C) 显示了3MHz、3W/cm2不同占空比（DC）下的温度升高。（n = 3）。
****: P ≤ 0.0001, ***: P ≤ 0.001, **: P ≤ 0.01, *: P ≤ 0.05, ns: P > 0.05。

多项研究表明，30分钟或更长时间的兆赫级超声照射可以增加药物释放（Fan等人，2024年；Sciurti等人，2020年；Zhou等人，2025年），但没有报告组织损伤的证据。然而，温度监测并未一致进行，这可能使得热安全性的评估变得复杂。总体而言，如果未实施适当的温度监测，长时间或高强度的超声照射可能会带来组织损伤的风险。

在较低频率下，根据方程（1），声吸收减少，从而降低了热生成（Ahmadi等人，2012年；Boissenot等人，2016年；Zhang等人，2022年）。在方程（1）中，吸收系数（α）与频率（f）呈单调关系，参考吸收系数（α0）和n是两个常数。

千赫级别的超声可以降低过热的风险，尽管强烈的机械效应仍然是一个问题。机械指数（MI）是一个标准化参数，用于估计空化的可能性和强度（Sirsi和Borden，2014年）。当MI ≤ 0.8时，气泡通常会经历稳定的空化，在多个周期内振荡而不会破裂；而当MI > 0.8时，可能会发生惯性空化，其特点是气泡在几个周期内剧烈破裂（Ahmadi等人，2012年；Boissanot等人，2016年；Polat等人，2011年），产生局部热量和剪切力（Abbott，1999年；Dalecki，2004年；Sirsi和Borden，2014年）。由于FDA（美国食品药品监督管理局，2008年）或IEC（国际电工委员会，2009年）没有定义具体的MI阈值，研究参数仍然具有很大变异性。许多研究使用20kHz的超声来利用空化效应而不引起明显的组织损伤（Ball等人，2025年；Husseini等人，2000年；Kubota等人，2021年；Meissner等人，2023年；Schoellhammer等人，2015年），尽管个体差异意味着不能排除风险。

在本研究中，超声参数经过精心选择以平衡热安全和机械安全。采用了5分钟的应用时间，因为在3MHz、3W/cm2、5分钟的条件下的最高温度升高仅为9.13°C（图3a），这需要超过15分钟才能引起细胞死亡（Bader等人，2025年；Sapareto和Dewey，1984年）。同时，还表征了脉冲超声应用下的热响应（图3c）。应用了50%占空比的超声10分钟，以维持相当的机械效应，同时让多余的热量散发到周围环境中。在脉冲设置下，温度仅升高了8.43°C，比连续超声应用时低0.7°C。

为了确保机械安全，遵循了机械指数（MI）≤ 1.9的标准（美国食品药品监督管理局，2023年），MI和峰值负压（Pr）通过方程（2）（Sirsi和Borden，2014年）和（3）（Walden等人，2018年）计算得出。尽管FDA指南（美国食品药品监督管理局，2023年）建议使用水听器测量Pr值，但在许多相关研究中无法获得这一数值。因此，MI值仅作为理论计算值报告，以估计潜在的机械生物安全性风险。

（2）MI = Prf
其中MI是机械指数，Pr是峰值负压，f是超声中心频率（美国食品药品监督管理局，2023年）。
（3）Pr = 2cρI
其中Pr是峰值负压，c是传输介质中的声速，ρ是传输介质的密度，I是超声强度。使用水的密度和声速值（ρ = 1000 kg/m3和c = 1480 m/s）（Lee等人，2019年），因为这些值与软组织的值相似（Chen等人，2022年）。

与之前的20kHz低频设置（Kubota等人，2021年；Schoellhammer等人，2015年）不同，本研究的设置下的MI值均低于0.8（表4）。这样的MI不会导致剧烈的惯性空化，尽管稳定的空化和超声产生的压力梯度仍可能增强药物释放。

表4. 不同超声参数下的机械效应
频率（MHz）强度（W/cm2）Pr（MPa）MI
1.0 1.0 0.17 20.17 21.0
2.0 0.24 30.24 31.0
3.0 0.29 80.29 8
3.0 1.0 0.17 20.09 9
3.0 2.0 0.24 30.14 0
3.0 3.0 0.29 80.17 20.02（20kHz）
2.5 0.27 21.9
24.0 0.2（20kHz）7.5 0.47 13.3

3.2.2 固体储库型植入物的体外药物释放测试
接下来评估了固体储库型植入物的体外药物释放行为。由于3W/cm2组显示出最佳的热效应和机械效应，因此选择3W/cm2的强度进行后续实验（图4）。为了模拟临床情况，使用了乳胶气球作为药物释放容器（图1d）。气球提供了灵活的、类似组织的屏障，并允许在换能器和气球表面之间使用超声传输凝胶，从而减少空气间隙，确保超声应用期间的有效声耦合。与玻璃小瓶不同，乳胶等橡胶类材料的声阻抗与水（PBS）相似（Cafarelli等人，2016年；Masroon等人，2021年），而玻璃则表现出较大的不匹配（Singh等人，2008年）。这种不匹配导致声波在界面处强烈反射，创造了与人体组织中超声应用截然不同的条件（Cafarelli等人，2016年；Singh等人，2008年）。尽管乳胶不能完全复制生物组织的声学特性，但它为体外药物释放研究提供了实用的近似模型。

图4：
(A) 不同刺激条件下植入物的累积药物释放曲线。
(B) 刺激应用后药物释放的增加情况，比较了治疗前2小时（预处理）与治疗后立即的情况。
(C) 不同实验设置下治疗前后的释放动力学比较。
(D) 不同实验设置下治疗后的释放动力学比较。（C）和（D）的统计分析使用了单向ANOVA。
(E）接受10分钟脉冲超声（50%占空比）处理的植入物的累积药物释放曲线与被动扩散对照相比。
(F) 10分钟脉冲超声应用前后药物释放的增加情况。（n = 3）。

在药物释放研究中，刺激在2小时施加5分钟（超声或在水浴中加热），并在处理前后立即收集样本。为了避免由于介质更换引起的浓度梯度重置而产生的假阳性结果，还包括了一个被动扩散组作为阴性对照。为了进一步评估机械效应对药物释放的贡献，应用了20kHz、12.5W/cm2、MI = 4.3的低频超声2小时。

与之前的研究（Huebsch等人，2014年；Meissner等人，2023年）不同，本药物释放曲线中没有立即出现显著增加。在这里，只有3MHz组在超声应用后立即显示出显著增加，与被动扩散组相比，增加了9.7倍（图4b）。与Huebsch等人报道的藻酸盐基水凝胶系统（Huebsch等人，2014年）不同，在其中药物直接释放到周围介质中并立即被检测到。本研究中开发的储库型植入物也表现出延迟释放反应，即使在去除刺激后药物释放速率仍继续增加（图4d）。只有在3.3.5组（3MHz，3W/cm2）和1.3.5组（1MHz，3W/cm2）中观察到药物释放速率在刺激应用期间和之后的显著增加，而20kHz组没有显示出任何释放速率的显著变化。这种效应可能是由于超声增强了固体药物储库的溶解，随后其扩散受到控释膜的限制，从而延长了释放增强效果。

为了确定超声增强药物释放的主要机制，引入了一个水浴组。该组的热输入与3.3.5条件相当，但没有超声诱导的机械效应。值得注意的是，仅热处理的（水浴）组在药物释放行为上没有显著变化（图4）。结合20kHz组的结果来看，这些结果表明，单独的热效应或机械效应都不足以产生有意义的药物释放增强。相比之下，尽管3.3.5组的机械指数最低（表4），但它产生了最大的整体增强效果。总体而言，这些发现表明，需要机械效应和热效应的协同作用才能有效地促进药物穿过控释膜并实现最大的释放增强。

还包括了一个脉冲3MHz、3W/cm2的超声组，以评估占空比调节是否可以最小化潜在的混杂效应，并有助于分离机械效应对药物释放行为的贡献（图4e和f）。然而，在50% DC脉冲超声下观察到的热响应与连续超声暴露没有显著差异，表明在当前实验配置下未能有效分离热效应和机械效应。尽管如此，对美国应用模式的评估确定，在当前实验条件下，50%的直流调制并没有显著影响热量积累或药物释放行为。据我们所知，超声波对储库型植入物中药物释放的影响尚未得到评估。本研究中开发的储库型植入物对超声波刺激表现出响应性。虽然释放膜减弱了超声波引起的爆释幅度，但这些结果为如何利用超声波实现药物控制释放提供了机制上的见解。然而，这些结果并未明确药物释放的增加是由于膜通透性的提高还是由于药物含核心内药物溶解度的增加，从而导致膜两侧的浓度梯度增大。这两种效应都会导致更高的药物释放比率。不过，膜通透性的增加是暂时的，因为它仅发生在超声波应用期间，而药物在核心内的溶解度增加则会导致更明显的变化。改变药物浓度梯度将产生更持久的效果，即使停止超声波应用后也能观察到。这些方面已经进行了评估，结果将在后续章节中呈现。

观察到的释放速率增加幅度较小。然而，值得注意的是，一旦植入，药物释放就直接发生在肿瘤周围的微环境中，而不会影响药物的生物利用度（Larra?eta等人，2021年）。例如，在慢性疾病管理中，基础释放可以在目标组织周围建立高浓度的“环境”。在这种条件下，即使大约0.5毫克的短暂额外释放也可能足以提高局部药物浓度并引发不成比例的强烈治疗效果，尽管绝对剂量很小。理想情况下，基础释放应维持慢性治疗阶段，而超声波刺激可以在需要时按需释放脉冲剂量以管理急性发作。

3.2.3. 基于PEG的固体药物储库的药物释放研究
在储库型植入物中观察到的药物释放延迟增强表明，超声波影响了药物的溶解过程。为了验证这一假设，使用相同的实验设置单独评估了药物储库（图1d）。基于先前的发现，3 MHz组产生了最强的反应，因此本研究使用了3 MHz、3 W/cm2的超声波持续5分钟。超声波分别在10分钟和30分钟后施加。

在没有释放膜的情况下，一旦溶解开始，就从储库片中检测到了药物释放。相比之下，尽管超声波增强了整个植入物的溶解过程，但药物释放受到膜的限制，从而导致更持久的增加。在这项研究中，排除了储库型植入物释放中的渗透成分，从而隔离了药物溶解行为。在10分钟后施加超声波时观察到了显著的释放增加（图5a）。然而，在30分钟后没有观察到类似的增加，因为大部分药物已经释放。统计分析确认，超声波施加前后的释放增加量显著大于5分钟被动扩散期间的增加量（图5b）。从动力学角度来看，超声波应用期间释放速率显著加快（图5c）。因此，通过超声波的机械和热效应的协同作用，可以显著增强药物的溶解速率。

下载：下载高分辨率图像（131KB）
下载：下载全尺寸图像
图5. (A) 基于PEG的药物储库的释放曲线。(B) 超声波应用前后药物释放的增加。统计显著性通过t检验评估。(C) 基于PEG的药物储库的释放动力学。(n = 3)

基于PEG的药物储库既作为植入体内的储库也作为整体植入物。由于PEG的高溶解度，药物在1小时内就完全释放了，使其不适合持续治疗。这种可控的按需释放行为突显了超声响应系统在空间和时间上精确释放药物的潜力。临床上，它可以支持局部治疗，如镇痛、抗炎或抗菌治疗，其中剂量的动态控制至关重要。此外，这些结果表明，增加核心的溶解度改变了药物浓度梯度，导致停止超声波应用后观察到的释放速率更高，如图5A所示。

3.2.4. 液体储库植入物的药物释放研究
在本研究的植入物设计中，药物释放包括两个阶段：溶解和扩散。为了具体评估超声波对膜扩散的影响，使用了液体储库植入物，从而消除了溶解步骤。由于空气层的存在可能会阻挡声波的传播（Ma等人，2020年），因此对液体储库植入物进行了修改，以在保持相同的释放窗口面积和形状的同时尽量减少被困的空气（图1），而实验设置保持不变。2小时后释放后，5分钟的超声波应用导致药物释放出现急剧增加，一旦移除超声波源，释放量又回到了基线水平（图6a）。这种行为与48小时的释放曲线一致（图6d），其中第二次超声波应用时由于浓度梯度减小，爆发幅度减小。在5分钟的应用期间，药物释放量显著大于被动扩散控制（图6b），释放动力学也明显增加（图6c）。这些发现表明，在测试条件下，超声波增强了扩散和渗透过程。

然而，在基于PEG的固体储库中，溶解基质的粘度与液体储库系统中使用的FLS-PBS溶液的粘度不同。尽管实验上很难确定药物释放期间PEG的确切浓度，但先前的研究表明，PEG 10 K溶液的粘度几乎与浓度成线性增加（Kirin?i?和Klofutar，1999年）。在固体储库植入物设计下，局部PEG浓度可能足够高，从而显著增加介质的粘度，从而阻碍药物的扩散。这种增加的粘度可能会降低渗透速率，从而减弱超声波对固体储库植入物中药物释放的增强效果。

3.3. 膜属性表征
对于储库型植入式设备，药物释放在很大程度上取决于速率控制膜的属性（Siepmann和Siepmann，2012年）。在这项研究中，通过分析不同持续时间超声波应用下的孔隙分布来评估膜的孔隙率（图7）。SEM图像在QuPath中进行了分析（Bankhead等人，2017年），使用直方图识别和量化孔隙，结果表明中心孔隙分布没有明显变化。尽管平均孔径略有差异，但这些差异不太可能影响膜的扩散动力学。为了进一步确认这一点，使用并联扩散细胞评估了扩散动力学。如扩散曲线和动力学图（图7c）所示，与对照组相比没有观察到显著差异。这些发现表明，超声波并没有显著改变膜的扩散能力，与孔隙分布分析（图7a和7b）一致。因此，液体储库植入物中药物释放的增加很可能是由于超声波应用期间产生的热效应和负压造成的。

下载：下载高分辨率图像（350KB）
下载：下载全尺寸图像
图7. (A) 300倍放大下的释放膜的SEM图像。(B) 孔径分布直方图，区间范围为1至26微米，间隔为1微米。(C) 并联扩散细胞中的药物释放（左）和计算出的扩散动力学（右）。(n = 3)

相比之下，在Delaney等人（Delaney等人，2025年）的先前研究中，超声波破裂了基于PLA的膜以触发药物储库中的抗生素释放，而本研究的结果不同。两种系统之间的关键区别在于，Delaney等人加入了微气泡作为声敏剂以增强空化效应，他们的膜要薄得多。在本研究中使用的膜厚度为0.24±0.02毫米，大约是前者的五倍。这些观察结果表明，结构变化不太可能是由热效应单独引起的。因此，在相对安全的超声波条件下，加入声敏剂可能是调节膜属性的一种有前景的未来策略。

3.4. 组织学评估
选择死产小猪的皮肤作为研究对象，因为其皮肤与人皮肤非常相似（Summerfield等人，2015年），同时避免了使用活体动物所涉及的伦理问题。该模型的主要限制在于，在储存和运输死产动物过程中可能会因反复的冷冻-解冻循环而产生伪影。

在所有组中，都观察到了毛囊周围的裂口，并将其归类为伪影（图8a和8d）。在空白组和3.3.5组中，角质层（SC）和真皮-表皮交界处（DEJ）完整、坚硬且没有裂口（图8b和8e）。相反，20 kHz组表现出严重的DEJ脱离（黑色箭头），这会导致水泡形成和局部水肿（Russo等人，2018年），这是由于其强烈的机械效应。值得注意的是，在20 kHz组中，绿色箭头指示了表皮脱离的起始位置，这很可能是由于绿色箭头上方的表皮位于有效超声波场之外（图8c和8f）。

在Schoellhammer等人的研究中（Schoellhammer等人，2015年），直肠黏膜上皮没有表现出明显的变形，因为声波是平行于上皮层传播的。然而，在本研究中，声波垂直穿过皮肤组织，使上皮暴露于不同的超声波剂量下，从而导致不同的结构效应。因此，组织学分析表明，20 kHz超声波的临床应用性受到限制，因为它与严重的潜在副作用相关。这样的设置必须谨慎使用，并需要密切监测。对于患有慢性疾病（如慢性疼痛）的患者来说，这将需要频繁的医院就诊和依赖高风险的治疗方法，这可能是不理想的，并可能导致患者依从性差。

由于组织破坏的严重性，20 kHz组的超声波暴露时间被限制在1分钟，因为5分钟的应用会导致皮肤穿孔，使得组织样本制备变得不可行。这种暴露时间与Schoellhammer等人的研究结果一致，他们在同一频率下使用较低的超声波强度在1分钟内就观察到了显著的生物效应。因此，对20 kHz条件进行了生物安全性评估，使用的是1分钟的暴露时间。在第3.2.2节中（图4），为了便于实验组之间的直接比较，超声波应用时间被保持为一个受控变量。

为了验证缩短超声波暴露时间是否改变了总体结论，纳入了一个额外的1分钟20 kHz超声波组，以评估应用间隔对药物释放行为的影响（图9）。如第3.2.2节所讨论的，机制解释基于5分钟的数据集，这些数据集与1分钟20 kHz条件没有直接的定量可比性。因此，1分钟20 kHz组的结果仅进行了定性描述。在超声波应用后立即观察到累积释放的轻微增加。然而，这种短暂的变化很可能是由于介质替换引起的浓度梯度重新分布（Pant，2024年），而不是质量传输的真实增强。

4. 结论
本研究系统地阐明了超声响应型储库式植入设备的释放机制。超声波应用显著增强了药物释放，机制分析显示，机械和热效应的协同作用加速了药物的溶解和扩散，而膜的内在结构在暴露下保持稳定。通过温度监测、理论建模和组织学评估，严格评估了生物安全性，支持了系统在定义参数内的操作安全性。尽管乳胶气球模型不能完全复制人体皮肤的声学特性，但它为受控的体外研究提供了一个临床相关的近似值。总体而言，这些研究结果表明膜是一个关键的设计变量，对其物理化学性质的合理优化对于提升药物响应性以及实现药物释放性能的精确、可调控至关重要。

CRediT作者贡献声明：
吕玉杰：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、数据可视化、方法论设计、实验研究、数据分析、概念化。
穆罕默德·阿尔布拉伊卡特（Mohammad Albraikat）：方法论设计、实验研究。
胡安·L·帕里斯（Juan L. Paris）：撰写——审阅与编辑。
高家琪（Jiaqi Gao）：方法论设计。
杨怀东（Huaidong Yang）：实验研究。
马苏德·阿德哈米（Masoud Adhami）：方法论设计。
埃内科·拉拉涅塔（Eneko Larra?eta）：撰写——审阅与编辑、项目监督、资金筹措、概念化。