芸苔科植物籽粕及厌氧土壤消毒处理对重新种植果园中苹果树生长和产量的多年影响

《Journal of Agriculture and Food Research》：Multi-Year Effects of Brassicaceae Seed Meal and Anaerobic Soil Disinfestation Treatments on Apple Tree Growth and Yield at Replant Orchard Sites

　　萨拉·蒂安娜·杜邦|马克·马佐拉|沙希卡·赫瓦维塔拉纳|艾娜·巴罗|特蕾西·索梅拉
华盛顿州立大学，农业与自然资源系，温纳奇，华盛顿州98801，美国

**摘要**
种子粉土壤改良剂和厌氧土壤消毒处理作为熏蒸的替代方法，在控制苹果重植病害方面显示出良好的效果。在之前发表的一项研究中，我们评估了芸苔科植物种子粉和厌氧土壤消毒技术在三个果园地点进行商业规模试验中对苹果重植病害的控制效果。这两种生物修复技术都在四个实验中的三个实验中显著改变了根际微生物群落。在第一年，芸苔科植物改良土壤中的树木生长情况与熏蒸土壤相当或更好，在厌氧消毒土壤中，有三个实验的结果优于未经处理的对照组。本文报告了这些实验在种植后六年内对树木生长和产量的影响。在四个地点中的两个地点，芸苔科植物改良土壤中的树木年产量和累计产量均高于未经处理的对照组。在四个地点中的四个地点，厌氧消毒土壤中的树木年产量也高于未经处理的对照组。年产量和累计产量的变化与树木生长的差异相关。树木生长的促进主要发生在第一年，由于初始生长的改善，随着时间的推移，树木的大小保持更大。土壤处理在应用后的第一年降低了Pratylenchus penetrans的根密度，但到第四年时这种效果不再明显。在这项研究中，芸苔科植物种子粉的投资回报不如熏蒸高，但进一步研究降低使用量以及不断变化的法规和经济环境使得生物修复成为一种潜在的有用工具。

**1. 引言**
随着有机种植面积的增加和监管的加强，寻找替代预种植土壤熏蒸的方法以控制苹果重植病害变得至关重要，因为这种重要的土传病害会抑制树木生长并降低产量。苹果重植病害是由多种土壤传播的病原体引起的，包括根部感染的真菌、卵菌和线虫。在华盛顿州，这些病原体主要包括Ilyonectria robusta、Rhizoctonia solani anastomosis group (AG)-5和AG-6、多种植物病原菌属（如Phytophthora和Pythium）以及根结线虫Pratylenchus penetrans。华盛顿州管理着超过27,000英亩有机苹果种植园的生产者正在寻求经济可行且有效的控制方法，以便在整个果园改造过程中保持有机认证。随着投入和劳动力成本的上升，生产者在苹果树通常的十三年生命周期内获得正投资回报变得越来越困难。熏蒸剂1,3-二氯丙烯和氯吡硫磷被认为对施用者和环境具有高风险，新的限制措施可能会禁止其使用。研究表明，生物修复策略在控制苹果重植病原体方面与熏蒸相当或更有效。

**2. 材料与方法**
**2.1. 试验地点描述**
如[25]中所述，美国华盛顿州的三个不同果园地点进行了四个田间试验：位于Othello的5公顷商业果园（坐标46.933876, -119.392096，Othello1和Othello2）；位于Washington State University Sunrise Research Orchard的0.6公顷果园（坐标47.31988, -120.0663747）；以及位于Tonasket的0.4公顷商业果园（坐标48.810692, -119.505724）。Othello、Rock Island和Tonasket地区的土壤类型分别为Adkins非常细砂壤土（Xeric Haplocalcids）、Pogue细砂壤土（Aridic Haploxerolls）和Nighthawk壤土（Calcidic Haploxerolls）。在进行田间试验之前，通过100个子样本混合土样中的种子苗生物测定法评估了每个地点的病原体组成。在所有三个试验地点，从苹果根部分离出的主要病原体为Globisporangium (=Pythium) ultimum。Rhizoctonia类真菌的数量变化较大，其中R. solani AG-6在各个地点最为普遍，而在Rock Island和Othello果园中还分离出了Ceratobasidium sp. AG-G和AG-K。Ilyonectria robusta在所有三个地点都有发现，Pratylenchus penetrans的根密度范围为每根100-200条。

**2.2. 试验设计与处理方法**
**Othello1和Tonasket实验**采用随机完全区组设计，每个处理有四个重复次数：厌氧土壤消毒（ASD）、芸苔科植物种子粉（BSM）、熏蒸对照（FUM）和未处理对照（NTC）。需要注意的是，由于Othello1实验未能达到厌氧条件（通过土壤氧化还原电位转换衡量），因此该实验取消了ASD处理。因此，Othello2实验于2019年重新设计，仅包含ASD和NTC两种处理。
**Rock Island实验**采用分割区组设计，每个处理包含四个主要处理：ASD、BSM、FUM和NTC，以及两个子处理因素：砧木Malling 9-337（M9.337）和Geneva 41（G.41），每个处理有五个重复次数。Othello1的试验面积为0.3公顷（每行190米，每块地800棵树）；Rock Island和Tonasket的试验面积为743平方米（每行55至61米，每块地60至100棵树）；Othello2的试验面积为38平方米（每行16米，每块地13棵树）。详细信息见[25]。

**2.2.1. 土壤熏蒸**
三个地点均使用39% 1,3-二氯丙烯和59.6% 氯吡硫磷（Strike 60CP，Trident Ag Products，Woodland, WA）以187升/公顷的浓度进行土壤熏蒸。Othello1的熏蒸在2017年10月进行，当时土壤含水量为22%体积百分比（VWC），温度为10°C；Tonasket的熏蒸在2019年4月进行，含水量为27-30% VWC，温度为10.6°C；Rock Island的熏蒸在2018年10月进行，含水量为24% VWC，温度为10.6°C。

**2.2.2. 芸苔科植物种子粉处理**
如[25]所述，BSM处理在种植前一个季节进行，当土壤温度适宜时：Othello1在2017年7月（土壤温度24°C），Rock Island在2018年7月，Tonasket在2018年8月。处理前先灌溉使土壤达到田间持水量，然后让其干燥至适合拖拉机作业的湿度（22-24% VWC）。芸苔科植物种子粉（Brassica juncea和Sinapis alba的1:1混合物，Farmfuels Inc，Watsonville, CA）以2至2.1公斤/平方米的剂量施用于1.2米宽的树行带（相当于[9]中报告的6.7吨/公顷的剂量，其中42%的公顷面积接受了处理）。使用旋耕机将种子粉混入土壤，深度达到20–25厘米，并在混合后3小时内用完全不透气的薄膜（TIF，透明材质，Rock Island和Othello1使用Rock Island品牌，Tonasket使用黑色Vaporsafe品牌，Raven CLI，Sioux Falls, SD生产）密封。薄膜需保持三周。

**2.2.3. 厌氧土壤消毒处理**
如[25]所述，所有其他实验（Rock Island、Tonasket和Othello2）均达到了厌氧条件。处理在种植前的夏季进行（Rock Island在2018年7月；Tonasket和Othello2在2018年8月）。处理开始时，土壤温度范围为14至27°C。在施用有机材料之前，使用电容探针（EC-5，Decagon，Meter Group，Pullman, WA）将土壤含水量提高到21–33% VWC。随后将干草（Phleum pratense）切碎并施用于1.2米宽的树行带，每公顷18公斤。这些材料用旋耕机混入土壤，并在混合后10–30分钟内用不透气薄膜密封处理区域。此外，具有生物控制活性的微生物活动增强了对抗真菌/卵菌和线虫的能力。

**2.3.3. 树木生长和产量监测**
在之前的研究中，我们评估了芸苔科植物种子粉和厌氧土壤消毒技术在多个果园地点进行商业规模试验中对苹果重植病害的控制效果[25]。与熏蒸和未处理对照组相比，芸苔科植物种子粉处理显著改变了土壤和根际微生物群的组成，并且在所有三个试验地点的第一年，树木生长情况与熏蒸处理相当或更好。在同一研究中，厌氧土壤消毒也显著改变了根际微生物群的组成，并且在四个实验中的三个实验中，一年后的树木生长优于未处理对照组。迄今为止，关于生物修复果园土壤系统多年树木表现的研究尚缺乏。本文记录了这些土壤处理在果园建立后六年内对树木生长和产量的影响。在此期间，还通过监测苹果根部的Pratylenchus penetrans种群来评估芸苔科植物种子粉和厌氧土壤消毒处理的长期病害控制效果。

**3. 结果与讨论**
本文记录了这些土壤处理在果园建立后六年内对树木生长和产量的影响。在此期间，还通过监测苹果根部的Pratylenchus penetrans种群来评估芸苔科植物种子粉和厌氧土壤消毒处理的长期病害控制效果。果实从每棵树上采摘，选择淀粉含量适宜的时机进行商业收割（具体时间为9月下旬至10月中旬）。记录了所有收获果实的总重量。同时，对果实进行了分级，剔除有鸟啄痕迹、裂纹、严重日灼伤或绿斑的果实，以便出售。在Othello1地块，由于研究地块面积较大，所有果实都被收集到采摘箱中。每公顷的产量是根据每个地块的采摘箱数量估算的（2019-2021年使用925磅的采摘箱），或者通过称重所有采摘箱来计算（2022年）。产量数据从Othello2、Rock Island和Tonasket的三年生树木开始收集；Othello1则是根据2019年高价格带来的利润估算得出的（数据收集持续了四年）。

2.3.3 Pratylenchus penetrans根际种群评估
2018年第一个生长季节结束时，在Othello1进行了根际采样；2019年在Tonasket和Rock Island进行了采样；2021年和2022年也继续了采样。使用消毒工具从每个处理地块的五棵树上采集了2至4段细根的样本，采样深度为5至20厘米。根际样本在4°C下保存直至处理。通过每棵树0.5克根际样本（每个地块2.5克）来测定Pratylenchus penetrans的种群数量。具体方法是将根际组织用自来水冲洗，然后分离出较大的根系，仅保留细小的初级根系。将冲洗后的根际组织放入含有70毫升无菌蒸馏水的150毫升烧瓶中，在旋转摇床上以140转/分钟的速度培养5天。之后通过45微米筛网过滤 nematode 提取物，并将其倒回计数板上，在40倍放大镜下进行计数。

2.4 统计分析
使用广义线性混合模型（GLIMMIX程序，SAS 9.2，SAS Institute inc., Cary, NC）分别分析了处理对树木生长（树径的累积增加）和树径的影响（针对每个实验：Tonasket、Othello1、Othello2和Rock Island）。重复次数被视为随机效应，采用标准高斯响应分布链接函数处理正态数据。由于处理与地点以及砧木之间的相互作用，Rock Island WA 38/M9.337、Rock Island WA 38/G.41、Othello1 WA 38/G.41、Othello2 WA 38/G.41 和 Tonasket TC2/B.10 的组合进行了单独分析。处理间的事后成对比较使用Tukey调整后的最小二乘均值差异检验进行。

产量数据使用广义线性混合模型（Glimmix，SAS 9.4）进行分析。模型拟合通过检查学生化残差图（包括学生化残差与预测值的关系、残差与树龄的关系）以及使用 PLOTS=residual 面板选项生成的常规分位数-分位数图来评估。模型离散性也通过广义皮尔逊卡方值除以自由度（DF）来评估（补充表1）[27]：接近1的值表示模型方差假设合适，而远大于1的值表示过度离散。在选择合适的分布后，通过?2对数似然值、AIC、皮尔逊卡方值/自由度（DF）和残差正态性来比较重复测量的协方差结构（独立、复合对称性和一阶自回归）（补充表1）。对于Othello1和Rock Island的数据收集了四年，Tonasket的数据收集了三年，Othello2的数据收集了两年（由于人力资源有限）。

3.1 树木生长
在Othello1，Rock Island WA 38/M9.337 的树木生长和树径显著大于NTC；从第一年到第四年，BSM处理的树木生长也显著大于FUM处理（表1，图1）。在同一地点，Rock Island WA 38/G.41 在BSM和ASD处理下的树木生长在第一年显著大于NTC处理（表1），但第三年差异不再显著（图1）。此后，该地点WA 38/G.41 处理下的树木生长在各处理间无显著差异。

表1. 根据土壤处理，树木生长以树径的累积增加（毫米）表示。
| 处理 | 栽培品种WA 38接种在砧木Malling 9-337（M9.337） | 第一年 | 第0至2年 | 第0至3年 | 第0至4年 |
|------|------------------|--------|--------|--------|--------|
| ASD | 4.1±0.2b* | 11.1±0.3a | 13.8±0.4b | 19.5±0.6bc | |
| BSM | 5.3±0.4a | 12.6±0.5a | 15.7±0.6a | 20.9±1.0ab | |
| FUM | 3.9±0.3bc | 12.2±0.5a | 16.0±0.5a | 22.4±0.9a | |
| NTC | 2.9±0.2c | 8.4±0.4b | 11.6±0.5c | 17.2±0.9c | |
P值 | 0.0005 | <0.0001 | <0.0001 | 0.0006 | |

| 处理 | 栽培品种WA 38接种在砧木Geneva 41（G.41） | 第一年 | 第0至2年 | 第0至3年 | 第0至4年 |
|------|------------------|--------|--------|--------|--------|
| ASD | 5.4±0.3a | 13.2±0.3a | 16.7±0.3a | 22.2±0.5a | |
| BSM | 5.9±0.4a | 13.1±0.5a | 16.4±0.7a | 21.9±0.7a | |
| FUM | 5.1±0.4ab | 13.3±0.4a | 16.6±0.8a | 22.3±0.8a | |
| NTC | 3.9±0.2b | 11.7±0.4a | 15.4±0.4a | 20.9±0.6a | |
P值 | 0.0074 | 0.0612 | 0.2789 | 0.2027 | |

| 处理 | 栽培品种Howell TC2接种在砧木Budagovsky 10（B.10） | 第一年 | 第0至2年 | 第0至3年 | 第0至4年 |
|------|------------------|--------|--------|--------|--------|
| ASD | 4.8±0.2bc | 12.7±0.3ab | 16.6±0.6ab | 21.1±0.7a | |
| BSM | 5.8±0.4ab | 12.2±0.3ab | 16.2±0.5ab | 20.9±0.8a | |
| FUM | 6.1±0.2a | 14.0±0.4a | 17.6±0.6a | 22.1±0.7a | |
| NTC | 4.1±0.2c | 10.6±1.0b | 14.0±1.1b | 18.4±1.5a | |
P值 | 0.0008 | 0.0110 | 0.0290 | 0.1014 | |

| 处理 | 栽培品种Othello1接种在砧木Geneva 41（G.41） | 第一年 | 第0至2年 | 第0至3年 | 第0至4年 |
|------|------------------|--------|--------|--------|--------|
| ASD | 7.7±0.2a | 13.5±1.1a | 17.6±1.5a | 23.2±1.9a | |
| FUM | 9.0±0.4a | 15.6±0.5a | 19.6±0.5a | 26.0±1.0a | |
| NTC | 8.2±0.6a | 15.4±0.7a | 19.5±0.7a | 26.1±0.9a | |
P值 | 0.2316 | 0.2097 | 0.3387 | 0.2360 | |

| 处理 | 栽培品种Othello2接种在砧木Geneva 41（G.41） | 第一年 | 第0至2年 | 第0至3年 | 第0至4年 |
|------|------------------|--------|--------|--------|--------|
| ASD | 5.2±0.4a | 12.7±1.4a | 19.0±2.1a | 24.9±2.6a | |
| FUM | 3.2±0.6a | 11.0±2.5a | 18.8±2.5a | |
P值 | 0.0641 | 0.3695 | 0.9155 | 0.8217 | |

注：平均值±标准误差。缩写说明：ASD = 厌氧土壤消毒；BSM = 芥菜科植物-Sinapis alba种子粉制剂；FUM = 播前土壤熏蒸；NTC = 无处理对照。* 如果平均值之间的字母不同，则表示在α=0.05的概率水平下，通过事后成对比较t检验具有显著性差异。

在Tonasket TC2/B.10地块，BSM处理的树木生长显著大于NTC处理，但在第一年与FUM处理无显著差异。FUM处理的树木生长在第一至第三年显著大于NTC处理；然而，在所有四年中BSM和FUM处理间无显著差异（表1）。FUM处理的树木大小在整个生长季节结束时仍大于NTC处理（图1）。在同一实验中，Tonasket TC2/B.10地块的ASD处理树木生长处于中间水平，且在大多数时间点与NTC或FUM处理无显著差异（表1）。到第四年时，任何处理间均无显著差异。

在Othello1 WA 38/G.41地块，第一至第四年BSM、FUM和NTC处理下的树木生长无显著差异（表1），树径也无显著差异（图1）。在Othello2 WA 38/G.41地块，ASD处理土壤中的树木生长在任何时间点与NTC处理无显著差异，但在第一年有增长趋势（表1）。

3.2 产量
在Rock Island，ASD、BSM和FUM处理下的3年、5年和6年生M9.337砧木树木的年均总产量和年均市场可销售产量显著高于NTC处理（表2）（4年生树木因芽部受冻害被排除）。BSM处理下的3年生树木产量在霜冻年份为12吨/公顷，2024年达到42吨/公顷。当包含受霜冻损害的4年生树木的产量时，处理间总产量差异显著（P=0.0086），但市场可销售产量差异不显著（P=0.1308），且平均产量比排除4年生树木时低1至7吨/公顷（见补充表4）。在G.41砧木上，处理对年均总产量有显著影响（表2），ASD和BSM处理的年均总产量高于NTC处理（表2）。当包含受霜冻损害的4年生树木的产量时，处理间总产量差异显著（P=0.0383），但市场可销售产量差异不显著（P=0.1422），4年生树木的平均产量仅为10至12吨/公顷，而3至6年生树木为40至60吨/公顷（补充表5）。

表2. 根据土壤处理，不同年龄段树木的果实产量。
| 处理 | 栽培品种WA 38接种在砧木Malling 9-337（M9.337） | 3至6年生树木 | |
|------|------------------|--------|--------|--------|
| ASD | 28.9±1.6a | 35.6±2.5a | 92.2±4.8a | 114.7±7.9a | |
| BSM | 30±1.7a | 37.4±1.5a | 98.3±8.2a | 124.3±6.3a | |
| FUM | 29.6±1.9a | 38.3±2.1a | 94.3±8.2a | 124.7±7.3a | |
| NTC | 23.2±1.6b | 29.3±2b | 75±5.1b | 95.9±7.8b | |
P值 | 0.0161 | <0.0021 | 0.0329 | 0.0042 |

| 处理 | 栽培品种WA 38接种在砧木Geneva 41（G.41） | 3至6年生树木 | |
|------|------------------|--------|--------|--------|--------|
| ASD | 38.5±1.5a | 48.7±2.3a | 114.2±14.3a | 146.3±18a | |
| BSM | 37.2±1.8ab | 48.3±2.5a | 105.3±18.9a | 149.9±17.6a | |
| FUM | 35.4±1.8ab | 46.8±2.3a | 108.6±14a | 144.5±17.3a | |
| NTC | 31.9±1.9b | 42.3±2.4b | 97.6±12.5a | |
P值 | 0.0740 | 0.0065 | 0.3854 | 0.0201 |

在Tonasket TC2/B.10地块，BSM处理的树木生长显著大于NTC处理，但在第一年与FUM处理无显著差异。FUM处理的树木生长在第一至第三年显著大于NTC处理；然而，在所有四年中BSM和FUM处理间无显著差异（表1）。FUM处理的树木大小在整个生长季节结束时仍大于NTC处理（图1）。在同一实验中，Tonasket TC2/B.10地块的ASD处理树木生长处于中间水平，且在大多数时间点与NTC或FUM处理无显著差异（表1）。到第四年时，任何处理间均无显著差异。

在Othello1 WA 38/G.41地块，第一至第四年BSM、FUM和NTC处理下的树木生长无显著差异（表1），树径也无显著差异（图1）。在Othello2 WA 38/G.41地块，ASD处理土壤中的树木生长在任何时间点与NTC处理无显著差异，但在第一年有增长趋势（表1）。

3.3 Pratylenchus penetrans根际种群评估
2018年第一个生长季节结束时，在Othello1进行了根际采样；2019年在Tonasket和Rock Island也进行了采样；2021年和2022年再次采样。使用消毒工具从每个处理地块的五棵树上采集了2至4段细根样本，采样深度为5至20厘米。根际样本在4°C下保存直至处理。通过每棵树0.5克根际样本（每个地块2.5克）来确定Pratylenchus penetrans的种群数量。具体方法是将根际组织用自来水冲洗，分离出较大的根系，仅保留细小的初级根系。将冲洗后的根际组织放入含有70毫升无菌蒸馏水的150毫升烧瓶中，在旋转摇床上以140转/分钟的速度培养5天。之后通过45微米筛网过滤 nematode 提取物，并将其倒回计数板上，在40倍放大镜下进行计数注：平均值±标准误差。* 若平均值后面的字母不同，则根据事后比较T检验（最小二乘法显著水平P=0.05）表明两者存在显著差异。a 平均产量排除了因霜冻损害芽而导致的4年生树木。b 累计产量是测量期间年产量之和。

在同一地点，WA 38/M9.337的累计可销售产量和累计总产量在BSM、ASD和FUM处理下显著高于NTC（表2）。平均而言，这些增加量分别为累计可销售产量17至23吨/公顷和累计总产量19至29吨/公顷（表2）。对于Rock Island WA 38/G.41，累计总产量在处理间存在显著差异（表2），其中ASD、BSM和FUM的累计总产量分别为14至19吨/公顷，而NTC则较低。

在Tonasket TC2/B.10处理中，平均年可销售产量和年平均总产量有显著差异（表2），ASD和FUM的年平均总产量高于NTC，增加量分别为2至4吨/公顷。年平均总产量在18至42吨/公顷之间。当分析3至5年生树木的累计总产量和累计可销售产量时，处理间没有显著差异。然而，ASD、BSM和FUM的累计可销售产量始终比NTC高4至12吨/公顷（表2）。

在Othello1 WA 38/G.41处理中，2至5年生树木的平均年平均总产量在处理间差异较小（P=0.0736）（表2），其中FUM的累计总产量比NTC高约5吨/公顷，BSM的累计总产量介于两者之间，比NTC高2吨/公顷。BSM的累计总产量也与FUM和NTC无显著差异（表2）。

在Othello2 WA 38/G.41处理中（仅包括ASD和NTC），收集了WA 38/G.41树木在第三和第四生长季的两年总产量数据。与NTC相比，ASD的总产量分别高约3吨/公顷（年平均总产量）和6吨/公顷（累计总产量）（表2）。

3.3. 线虫
在第一个生长季结束时，Othello1、Tonasket和Rock Island的BSM处理中，苹果根部的P. penetrans线虫密度显著低于NTC（表3）。同样，在同一时期，ASD处理中的P. penetrans线虫密度也显著低于NTC，在Rock Island和Tonasket处理中与FUM处理相似（Othello1实验未进行ASD处理）。在Othello1的第二个生长季后以及Tonasket的第三个生长季后，BSM处理中的P. penetrans数量仍低于NTC，但在Rock Island则没有这种差异（表3）。在第四个生长季后，Rock Island、Tonasket和Othello1的处理间P. penetrans线虫种群密度没有显著差异。尽管如此，FUM处理下的P. penetrans种群密度增长更快，尤其是在Othello1，因为在第一个生长季后其种群密度已经与NTC相当。在Othello1的第五年也测量了P. penetrans线虫种群密度，处理间没有显著差异（数据未显示；P=0.679）。

表3. 不同土壤处理对Pratylenchus penetrans线虫密度的影响（每克根组织中的线虫数量）±标准误差（95%置信区间）。根样本在每个生长季的10月采集。

**年份** | **Tonasket TC2/B.10** | **Rock Island WA 38/M9.337** | **Othello1 WA 38/G.41** | **Othello2 WA 38/G.41** |
| -------- | ------------------ | ---------------------- | ---------------------- | ---------------------- |
| 线虫/克根 | ------------------ | ---------------------- | ---------------------- | ---------------------- |
| BSM | 5±3a | (-5-14) | 10±7a | (-6-25) | 363±129a | (-49-774) | ND |
| ASD | 2±1a | (-1-6) | 38±13b | (8-68) | ND | ND |
| FUM | 9±4a | (-4-22) | 44±13b | (15-73) | 1933±449b | (502-3362) | ND |
| NTC | 142±46b | (-2-287) | 197±33c | (123-272) | 997±31b | (899-1094) | ND |
| P值 | 0.003 | <0.000 | 0.004 | 0.004 |
| **年份2/3** | ------------------ | ---------------------- | ---------------------- | ---------------------- |
| Tonasket TC2/B.10 | Rock Island WA 38/M9.337 | Othello1 WA 38/G.41 | Othello2 WA 38/G.41 | ---------------------- |
| 线虫/克根 | ------------------ | ---------------------- | ---------------------- | ---------------------- |
| BSM | 18±14a | (-42-77) | 65±17b | (11-120) | 130±38a | (76-377) | NA |
| ASD | 35±14ab | (-25-95) | 54±4b | (43-66) | NA | 62±29a | (-63-187) |
| FUM | 69±15b | (3-134) | 31±4a | (17-45) | 352±45b | (58-652) | NA |
| NTC | 129±30b | (1-256) | 80±8b | (53-107) | 294±53b | (104-465) | 46±15a | (-17-109) |
| P值 | 0.05 | 0.004 | 0.017 | 0.74 |

4. 讨论
全球范围内，种植前土壤熏蒸被用作控制苹果重新种植病害的措施。然而，在许多地区，监管措施限制或禁止了某些常用化学熏蒸剂在农业系统中的使用，这些熏蒸剂用于管理土传病害。此外，随着有机果树产业的扩展，需要寻找与有机生产实践兼容的替代方法来控制苹果重新种植病害。已经提出了许多非化学替代措施来管理不同地区的苹果重新种植病害，包括改变肥力管理计划[27]、大量施用堆肥[28, 29]或使用耐病苹果砧木[30, 31]。但这些措施通常未能为这种多年生生产系统的植物生长和产量提供长期益处[32]，或者在果园重新种植地点的结果不一致[29]。当前研究的结果支持了先前的研究结果，表明种植前使用Brassicaceae种子粉改良土壤和厌氧土壤消毒可以有效控制苹果重新种植病害，其效果与土壤熏蒸相当。然而，在我们知情的范围内，这是首次在商业规模上实施Brassicaceae种子粉改良土壤和厌氧土壤消毒的研究，但在所有地点和所有指标上，处理效果并不总是优于无处理对照。

在这项研究中，2至6年生树木的产量在BSM或ASD处理下普遍高于无处理对照，这种增加与树木生长增加相对应。在BSM处理过的土壤中生长的树木在四个地点中的两个（Rock Island WA 38/M9.337、Rock Island WA 38/G.41）的年平均总产量和累计总产量高于无处理对照；在Rock Island WA 38/G.41和Tonasket TC2/B.10中差异不显著。BSM处理相对于NTC的年平均总产量增加幅度从13%（Rock Island WA 38/G.41）到28%（Rock Island WA 38/M9.337）不等。相比之下，FUM处理下的产量增加幅度从14%到30%不等。

在ASD处理过的土壤中生长的树木在四个地点中的四个（Rock Island WA 38/M9.337、Rock Island WA 38/G.41、Tonasket TC2/B.10和Othello2 WA 38/G.41）的年平均产量以及三个地点中的三个（Rock Island WA 38/M9.337、Rock Island WA 38/G.41、Othello2 WA 38/G.41）的累计产量均高于NTC。ASD处理相对于NTC的年平均产量增加幅度从14%（Rock Island WA 38/G.41）到26%（Othello2）不等。产量增加与树木生长情况相关：在Rock Island WA 38/M9.337中，BSM处理的树木生长在第一至第四年高于NTC；在Rock Island WA 38/G.41和Tonasket TC2/B.10中，第一年也高于NTC。在Tonasket TC2/B.10中，由于2022年螨虫和蚜虫压力较高以及2023年火疫病（Erwinia amylovora）造成的树木损害，导致产量不稳定。此外，2023年灌溉受限以控制火疫病，这也导致了水分胁迫，从而影响了果实大小和产量。在Othello1 WA 38/G.41中，BSM和FUM处理的树木生长和产量相似；然而，NTC处理的树木生长情况与处理组无显著差异。

土壤处理的效果因实验而异，可能受到苹果砧木的影响。Rock Island实验中，使用了WA 38品种种植在易感病害的M9.337砧木上，以及耐病害的G.41砧木上。对于嫁接在M9.337砧木上的树木，BSM和FUM处理的树径增加幅度在所有年份都大于NTC（图1）。相比之下，嫁接在G.41砧木上的树木仅在第一年表现出比NTC更大的生长。就年平均总产量和年平均可销售产量而言，所有土壤处理都提高了WA 38品种的产量，无论嫁接在易感病害（M9.337）还是耐病害（G.41）砧木上；然而，G.41砧木上的累计可销售产量虽然有所增加，但差异不显著。先前的研究发现，对于易感和耐病砧木，土壤处理的效果相似。例如，Wang和Mazzola [10] 发现，种植前使用BSM或熏蒸处理可以显著提高‘Gala’苹果的产量，无论嫁接在易感病害的M.26砧木还是耐病害的G.41砧木上。另一项早期研究 [9] 也记录了BSM处理对‘Gala’苹果的生长和产量有类似提升效果，优于土壤熏蒸。

BSM和厌氧土壤消毒处理对树木生长和产量的改善与先前文献中记录的土壤微生物群落变化一致[25]。在这些实验中，BSM处理显著改变了根际微生物群落，减少了Ilyonectria robusta（所有实验）和Rhizoctonia spp. 的数量，并增加了具有潜在生物控制活性的真菌属（如Talaromyces、Chaetomium、Gelasinospora和Hypocrea/Trichoderma）的相对丰度[25]。ASD处理也改变了微生物群落，包括减少了I. robusta、Penicillium spp. 和Chaetomium spp. 的数量。

通过增加特定有益微生物群体的总体丰度来促进抑制性根际环境的形成，已被证明可以更持久地控制P. penetrans[34]。在本研究中，BSM处理在两个实验中的三年内有效降低了P. penetrans的种群密度。相比之下，FUM仅在Tonasket的第一年以及Rock Island的前三年内显著降低了P. penetrans的种群密度。尽管1,3-二氯丙烷和氯吡硫磷等熏蒸剂能够在施用后短时间内减少线虫数量，但这些化合物的广谱作用会导致病原体密度在一年到三年内恢复到处理前水平[35]。此外，P. penetrans能够栖息在熏蒸无法到达的深层土壤中，或者存在于旧果园的根材中，这使它们能够避免暴露于高浓度的熏蒸剂中[37]。

BSM相对于FUM的产量优势并未超过五年到六年实验期间的成本增加。在本试验中使用的剂量（2.2公斤/平方米）下，BSM处理的包括材料和劳动力在内的成本约为每英亩5900美元，而1,3-二氯丙烷-氯吡硫磷熏蒸的成本为每英亩900美元[25]。如果每箱果实可销售收入为270美元[38]，则BSM在Rock Island M9.337品种上的前四个收获期的累计产量增加28.4公吨/公顷（相当于每英亩27.4箱），每英亩收入增加7398美元，而FUM在相同条件下的收入为7500美元，每公顷28.8公吨（每英亩27.8箱）。虽然BSM的投资回报率为每英亩1498美元，低于FUM的每英亩6600美元，但在最近的研究中发现的有效剂量（1公斤/平方米，覆盖42%的处理面积）下，BSM的投资回报率会更高。在这种情况下，如果效果和收益持续提高，使用降低45%的十字花科种子粉（价格为0.85美元）可以将处理成本降至2758美元，并在五到六年内将每英亩的投资回报提高到4640美元，接近熏蒸处理的6600美元。虽然土壤熏蒸相对于十字花科种子粉生物修复处理在许多地区具有潜在的更高财务回报，但由于许多熏蒸剂的注册被取消，其他地区的种植者无法采取任何合适的措施来控制苹果重植病害。例如，历史上1,3-二氯丙烯熏蒸剂曾与氯opicrin一起用于整个加拿大的苹果重植病害控制。但由于制造商撤销了该熏蒸剂在加拿大的注册，种植者失去了有效的替代方案。同样，在其他司法管辖区（如欧盟），土壤熏蒸的使用也受到限制，因为截至2022年，氯opicrin被视为禁用农药（欧洲议会法规（EC）第1107/2009号）。在这种情况下，采用十字花科种子粉改良或厌氧土壤消毒等做法可能是控制商业生产系统中苹果重植病害的可行措施。此外，尽管华盛顿州的熏蒸成本特别低，但美国其他地区对土壤熏蒸的应用有更严格的法规（加利福尼亚州农药管理局2024年法规第3篇第6448-6452节）。这些法规可能包括熏蒸后覆盖土壤的要求，以及重大的限制措施，这些措施可能会使果园土地无法用于生产，从而降低果园的整体潜在产量。这些法规要求显著增加了土壤熏蒸的成本，包括劳动力和材料方面。

为了成功采用十字花科种子粉和厌氧土壤消毒技术，需要解决一些农艺问题。目前，本试验中使用的种子粉配方尚未被注册为杀菌剂或杀线虫剂。此外，需要仔细选择十字花科种子粉的配方。当前研究中使用的配方包含针对引起重植病害的特定类型的种子粉，而其他配方可能无效甚至会刺激根部感染[13]。材料的研磨和加工方式也会影响产品的效果[39, 40]。厌氧土壤消毒的应用具有挑战性，涉及许多田间操作步骤，如碳源施用、切碎、混入土壤、覆盖和淹水。需要水来使土壤饱和，这在轻质土壤类型中尤其困难。

5. 结论
总之，十字花科种子粉和厌氧土壤消毒处理的好处与植前土壤熏蒸相似。2年至6年生树木的产量通常在BSM或ASD处理下高于未处理对照组，这与树木生长增加相关。树木生长的促进主要在第一年观察到，随着时间的推移，由于初始生长的改善，树木的大小保持较大。然而，效果因地点和砧木组合而异，因此需要进一步研究以改进技术和提高可靠性。尽管在华盛顿州使用十字花科种子粉目前不具备成本效益，但进一步的研究表明可以降低种子粉的用量[10]，并且正在进行大规模的降低用量的田间试验。这对于寻找有机生产系统和无法使用化学熏蒸剂的地区的可行替代方案尤为重要。随着我们对当地土壤微生物群及其动态的理解加深，我们利用不同土壤改良剂综合控制苹果重植病害的能力也在增强[41]。

**作者贡献声明**
Tracey Somera：撰写——审阅与编辑。
Shashika Hewavitharana：撰写——审阅与编辑、方法学、调查。
Aina Baró：撰写——审阅与编辑、原始草稿撰写、调查、正式分析、数据管理。
Sara Tianna DuPont：撰写——审阅与编辑、原始草稿撰写、项目管理、方法学、调查、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。
Mark Mazzola：撰写——审阅与编辑、资源、方法学、概念化。

**利益冲突**
作者声明没有利益冲突。资助者未参与研究的设计、数据收集、分析或解释、手稿撰写或结果发表的决定。

**数据可用性声明**
本研究中的数据可在公共仓库[Research Exchange at https://rex.libraries.wsu.edu/esploro/project/research/MULTI-YEAR-EFFECTS-OF-BRASSICACEAE-SEED-MEAL/1028203267970001842?institution=01ALLIANCE_WSU]中公开获取。

**资金**
该项目得到了华盛顿州果树研究委员会（Grant # 10211000）和美国农业部作物保护计划（Grant # 2017-70006-27267）的资助。感谢Gold Crown Nursery、Cameron Nursery、Progene Seed、Trident Ag Products和Farm Fuel Inc.的支持，以及Mike Robinson、Jim Baird和Sam Godwin在劳动力、材料和设备方面的慷慨提供。