来自野生苦瓜叶的膳食三萜类化合物通过Ras/MEK/ERK/黏蛋白信号通路，在高果糖喂养的小鼠中重塑肠道微生物群稳态并改善肠病症状

《Journal of Agriculture and Food Research》：Dietary Triterpenoids from Wild Bitter Melon Leaves Reshape Gut Microbiota Homeostasis and Ameliorate Enteropathy via the Ras/MEK/ERK/Mucin Signaling Pathway in High-Fructose-Fed Mice

　　小凯-希斯·卢、朴正蔡、余俊林、梅玲张、平俊王、胜伟许、宏泽施、舒梅赖、秀妮孔
台湾国立大学医学院解剖学与细胞生物学研究生院，台北

**摘要**
高果糖摄入通常与加工食品相关，已被证明会损害肠道屏障功能并破坏肠道微生物群的平衡。野生苦瓜（Momordica charantia var. abbreviata）及其叶子是一种在亚洲饮食中传统上食用的植物；然而，其生物活性成分对肠道健康的相关功能仍不清楚。本研究调查了富含三萜类化合物的提取物（TEE）从野生苦瓜叶子中对高果糖摄入下肠道健康的影响。通过使用高果糖饮食的小鼠模型和肠道细胞系统，我们证明了这种提取物的膳食补充可以改善肠道屏障完整性，增强黏蛋白的产生，并提高杯状细胞的功能。此外，该提取物还促进了肠道微生物群的多样性，并增加了与肠道平衡相关的细菌Akkermansia muciniphila（AKK）的数量。支持性机制分析表明，调节炎症反应和NLRP6相关信号通路可能对这些有益效果有所贡献。总体而言，这些发现表明，野生苦瓜叶中的TEE可能作为一种功能性食品成分，在过量果糖摄入的情况下支持肠道屏障功能和微生物组平衡。

**引言**
现代饮食模式以过量消费加工食品和添加糖（尤其是果糖）为特征，已成为代谢和胃肠道疾病的主要驱动因素。高果糖摄入被认为会对肠道屏障功能产生不利影响，破坏肠道微生物群的平衡，并引发慢性低度炎症1,2。肠道黏膜是宿主与外部环境之间的最大界面，包括物理上皮屏障、化学黏液层和复杂的微生物生态系统3。这种多层系统的破坏会导致肠道通透性增加，即“肠漏”，使内毒素进入系统循环4。因此，迫切需要识别能够增强肠道完整性和在过量膳食果糖摄入下恢复微生物平衡的食品来源的生物活性化合物。

野生苦瓜（Momordica charantia var. abbreviata）是亚洲的一种传统可食用植物，因其多样的营养和功能特性而受到重视。虽然其果实常被食用，但最近的证据表明，野生苦瓜叶子中含有更高浓度的三萜类化合物，这些化合物以其强大的抗氧化和抗炎活性而闻名5。最近的研究表征了一种从野生苦瓜叶子中提取的富含三萜类化合物（TEE），该提取物通过调节促炎细胞因子的释放显示出显著的缓解肝纤维化的效果5。三萜类化合物是多种功能性食品中的生物活性化合物，例如人参（Panax ginseng）中的人参皂苷6、橄榄（Olea europaea）中的三萜酸7和灵芝（Ganoderma lucidum）中的灵芝酸8。值得注意的是，与这些传统来源相比，野生苦瓜叶子中的葫芦烷型三萜类化合物浓度显著更高，且种类更复杂，使其成为管理代谢和炎症疾病的潜在候选物9。然而，尽管有关苦瓜代谢益处的文献很多，但TEE在支持肠道屏障功能和肠道微生物组平衡方面的潜在作用仍大部分未得到探索。了解这些效果对于开发基于苦瓜的功能性成分以维护肠道健康至关重要。

胃肠道表面由主要由黏蛋白2（MUC2）组成的黏液层保护10，黏蛋白2由杯状细胞分泌，作为第一道防线和有益细菌的代谢栖息地11。常驻共生菌如Akkermansia muciniphila（AKK）通过刺激黏蛋白产生和增强屏障重组对于维持这一层至关重要12,13。最近的研究强调了炎性小体（特别是核苷酸结合寡聚化结构域富含亮氨酸重复序列和吡嗪结构域3（NLRP3）及核苷酸结合寡聚化结构域富含亮氨酸重复序列和吡嗪结构域6（NLRP6）在调节这一微妙平衡中的重要性。虽然NLRP3通常具有促炎作用，但NLRP6被认为是一种抗炎守护者，对黏液分泌和上皮细胞自我更新至关重要14,15。NLRP3和NLRP6信号通路之间的失衡，由营养素失衡引起，会导致线粒体膜电位下降、ATP产生减少以及紧密连接（如Zonula occludens-1 (ZO-1) 和Occludin）的完整性受损16。

在本研究中，我们假设TEE可以通过调节宿主/微生物群/黏液轴来缓解高果糖引起的肠道损伤。我们使用高果糖喂养的小鼠模型和肠道上皮细胞系统来研究TEE对屏障通透性、杯状细胞分化和微生物群组成的保护作用。此外，我们还探讨了潜在的机制，重点关注关键信号通路的激活。我们的发现旨在为TEE作为潜在的治疗剂和功能性食品成分提供科学依据，以应对现代饮食挑战。

**材料与方法**
**小鼠模型**
所有小鼠实验程序均获得了台湾国立大学医学院动物中心动物护理委员会（IACUC: 20210405）的批准。使用从台湾国立大学医学院动物中心购买的12周龄雄性C57BL/6J小鼠。小鼠被安置在受控环境中（25 ± 1 °C，12小时光照-黑暗周期），并在整个实验期间自由提供食物和水。小鼠被随机分为3组（每组8只），分别喂食对照组饮食（D12450K，Research Diets, Inc.，新不伦瑞克，NJ，美国）（CTL组）、高果糖饮食（D02022704，Research Diets）以及是否口服TEE（FST和Fr.S组），持续14周。详细的饮食组成见补充表1。TEE是根据先前的研究从野生苦瓜叶子中提取的5。TEE的化学组成通过LC-MS进行表征5，主要由葫芦烷型三萜类化合物组成，为了确保当前生物测定的批次间一致性，对其进行了定量（补充表2）。每天测量食物和水的摄入量，每周测量体重，每月测量空腹血糖。在实验的最后一周进行了腹腔胰岛素耐受试验（IPITT）。通过心脏穿刺收集血液样本，然后以12000xg离心15分钟以获得血清。根据制造商的说明（Randox Laboratories Ltd.，Crumlin，安特里姆郡，英国）测量血清样本中的天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）。称量小肠和大肠的重量并测量长度。将小肠的空肠部分分为3部分用于后续实验（补充图1A，SI-Front），包括4%的戊二醛固定用于切片、蛋白质和RNA提取。

**肠道通透性测定**
禁食16小时后，给小鼠灌胃150 μl荧光异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖（80 mg/ml）（Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国）。4小时后收集血清，并以800xg离心（30分钟，4 °C）。使用SpectraMax ABS plus酶联免疫吸附测定（ELISA）读数器（Molecular Devices, LLC，圣何塞，CA，美国）在530nm和485nm处测量FITC-葡聚糖的荧光强度。

**组织染色**
将空肠（补充图1A中的SI-Front）嵌入石蜡中并切片。组织石蜡切片（7 μm）经脱蜡后进行多种染色，包括苏木精和伊红（H&E）、Periodic acid–Schiff（PAS）（Sigma-Aldrich，Merck KGaA，达姆施塔特，德国）和Alcian blue染色（Sigma-Aldrich，Merck KGaA，达姆施塔特，德国）。H&E用于形态观察，而PAS和Alcian blue染色用于观察杯状细胞的定位和数量。每只小鼠的5个切片中计数杯状细胞，每个切片每10个连续切片计数一次。

**RNA测序**
收集小鼠的肠道，并使用Trizol（Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国）按照标准协议提取总RNA。然后使用Illumina平台（AllBio Science, Inc.，台北，台湾）进行RNA测序。使用R软件（版本4.5）中的DESeq2包处理原始计数数据并标准化，随后进行差异基因表达分析。在不同p值阈值下鉴定出的差异表达基因随后使用KEGG（京都基因与基因组百科全书）和GO（基因本体）进行分析。还生成了显示基因表达谱的热图。

**蛋白质分析**
通过Western blot分析蛋白质表达。简要来说，将等量的蛋白质加载到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中，并通过电泳分离蛋白质。然后将蛋白质转移到硝基纤维素膜上。膜与一级抗体（ZO-1、occludin、p-MEK1/2，来自Cell Signaling Technology, Inc.，丹弗斯，MA，美国）；NLRP3、Caspase-1、白细胞介素-1β（IL-1β）、Wnt家族成员3a（Wnt3a）、Wnt家族成员5a（Wnt5a）、上皮特异性ETS转录因子1（ESE1）、p-p65、核因子κB（NFkB）p65、β-actin，来自GeneTex（GeneTex, Inc.，尔湾，CA，美国）；NLRP6、IL-18、MUC2、K-Rat肉瘤病毒蛋白（K-Ras），来自Abclonal（Abclonal, Inc.，新台北市，台湾）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、快速加速纤维肉瘤蛋白-1（p-Raf-1）、细胞外信号调节激酶（ERK1）、ERK2、Toll样受体4（TLR4），来自Santa Cruz（Santa Cruz Biotechnology, Inc.，达拉斯，TX，美国）；pT202/pY204 ERK1、pT185/pY187 ERK2，来自Abcam（Abcam plc，剑桥，英国）在4°C下孵育16小时。用Tris缓冲液和Tween 20（25mM Tris，0.15M NaCl，含1% Tween-20，Emperor Chemical，台北，台湾）洗涤几次后，膜与相应的二级抗体（The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，美国）孵育。使用UVP bioimage系统（UVP GelStudio Plus；Analytik Jena，耶拿，德国）和LumiLong Plus化学发光检测套件（T-Pro Biotechnology，新台北市，台湾）拍摄目标蛋白的图像。使用Image J（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，MD，美国）分析蛋白质水平。

**mRNA分析**
使用Trizol从肠道中提取RNA。简要来说，向样品中加入1 ml Trizol，然后加入100 μl 1-溴-3-氯丙烷（Sigma-Aldrich），混合后以4°C离心10000xg 10分钟。将上层转移到新管中，加入400 μl异丙醇，然后以4°C离心10000xg 8分钟沉淀RNA。用75%乙醇洗涤RNA沉淀物，然后用RNase free water溶解。使用Nanodrop（260/280nm和260/230nm）测量RNA的质量和数量。使用FIREScript? RT试剂盒（SOLIS BioDyne，塔尔图，爱沙尼亚）将mRNA逆转录为互补DNA（cDNA），然后使用QuantStudio? 3实时PCR系统（ThermoFisher Scientific，沃尔瑟姆，MA，美国）和Syber green混合液及各种引物（包括β-actin（F: ACCCACACTGTGTAC，R: TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA）、Il1β（F:GATCCACACTCTCCAGCTGCA，R:CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG）和Muc2（F: ATGCCCACCTCCTCAAAGAC，R: GTAGTTTCCGTTGGAACAGTGAA）进行定量PCR。

**免疫组化**
将石蜡包埋的小肠切片脱蜡、复水并回收抗原，然后在4°C下与anti-ZO1（ABclonal Technology, Inc., Woburn, MA, USA）或anti-Lgr5（Genetex）孵育过夜，之后与Biotin-SP结合的Affini Pure Goat Anti-Rabbit免疫球蛋白G（IgG）（Jackson Lab）或Goat Anti-Rabbit IgG Alexa Fluro 488二级抗体（Abcam）孵育1小时。对于ZO-1的DAB染色，将切片装片并在荧光显微镜（Leica Microsystems GmbH，韦茨拉尔，德国）下拍摄图像。使用Image J进行荧光强度的定量分析。

**透射电子显微镜**
通过透射电子显微镜（TEM）观察小肠上皮细胞的超微结构。组织用2P2G（2%戊二醛和2%戊二醛的磷酸盐缓冲液）固定1周，然后用1%锇四氧化物后固定1小时，再用75%、85%、95%、100%的乙醇脱水。然后将组织浸入丙酮（PO）中5分钟，然后浸入环氧树脂（Embed 812，EMS，哈特菲尔德，美国）中，比例为1:1（PO:环氧树脂），最后浸入纯环氧树脂中。环氧树脂样品在60°C下固化至少48小时，然后切片。超薄切片用尿酸和柠檬酸铅染色。使用TEM H-7100（Hitachi，东京，日本）拍摄图像。

**细胞培养**
从BCRC（新竹，台湾）购买IEC-6肠道上皮细胞，并在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，其中含有10%胎牛血清（FBS）（Gibco）、1%青霉素-链霉素（Gibco）和胰岛素（3.7 mg/l）。人类结肠腺癌细胞系HT29是由台湾国立大学医学院解剖学与细胞生物学系的黄敏川教授慷慨提供的，其在DMEM中培养，含有10% FBS和1%青霉素-链霉素，并在37°C下培养，含有5% CO2。

**shRNA敲低**
寡核苷酸序列（CCGGGACCTCCAAGAGGTGATCAATCTCGAGATTGATCACCTCTTGGA GGTCTTTTTTG）特异性针对Nlrp6（GACCTCCAAGAGGTGATCAAT）的小鼠编码区序列（CDS），并从RNAi core（台北，台湾）购买了含有针对Nlrp6的shRNA的构建慢病毒。表达特定Nlrp6敲低寡核苷酸序列（shNlrp6）或非靶序列（shNegative control，shNeg）的慢病毒根据RNAi核心的指导用于感染IEC-6细胞，感染复数（M.O.I）为3。线粒体膜电位（ΔΨm）使用Mitoview? 633（Biotium，Fremont，CA，美国）测量线粒体膜电位，这是一种电位荧光染料，其在线粒体基质中的积累与膜电位成正比。处理的活细胞在37°C下用Mitoview? 633（200 nM）染色30分钟，然后使用荧光显微镜（Leica）观察和成像红色荧光，或通过流式细胞术（Becton，Dickinson and Company，Franklin Lakes，NJ，美国）进行测量。

通过16S rRNA扩增子测序分析微生物群
在小鼠被处死后收集肠道中的粪便样本。根据制造商的说明（Qiagen，Hilden，德国）使用QIAamp Fast DNA Stool mini试剂盒分离微生物DNA。使用V3-V4区域引物（正向：5'- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 反向：5'GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）通过两步PCR制备16s宏基因组文库。微生物群分析在NTUCM（台湾国立大学医学院）的Microbiota中心使用Illumina MiSeq Sequencing 600循环进行。细菌分析的图表由NTUCM的Microbiota中心提供。

杯状细胞分化
杯状细胞的分化方案按照参考文献17进行。HT29细胞在DMEM中培养，并补充10% FBS，这是HT29细胞的标准培养基（SM）。在第0天，将2X10^6 HT29细胞接种到25平方厘米的塑料培养瓶中。然后在培养基中加入5 mM NaBT（丁酸钠，Merck KGaA，Darmstadt，德国），并每2天更换一次含有NaBT的培养基。在第11天，细胞被胰蛋白酶消化并分成25平方厘米的培养瓶，并在含有5 mM NaBT的培养基中维持。每2天更换一次培养基。在第25天，细胞再次被胰蛋白酶消化，并在不含NaBT的新鲜SM中培养至第30天。这种分化的细胞被称为“杯状细胞”，它们具有休眠特性并产生黏蛋白。

统计分析
所有体内实验都在两组独立的实验中进行，每组共有8只小鼠，体外实验至少进行三次生物学重复。结果以箱线图表示，其中中央水平线表示中位数，箱边界代表第25和第75百分位数， whiskers表示最小值和最大值。使用Shapiro-Wilk检验和Levene检验分别评估数据分布和方差的同质性。
对于两组之间的比较，由于所有数据集都遵循正态分布，因此使用非配对Student’s t检验。对于三个或更多组之间的比较，使用单因素方差分析（ANOVA），然后进行Tukey事后检验。在假设方差相等被违反的情况下，应用成对的Welch’s t检验并进行Bonferroni调整。对于非正态分布的数据，使用Kruskal-Wallis检验，然后进行Dunn的多重比较检验。为了评估微生物群的β多样性，基于UniFrac距离进行了主坐标分析（PCoA）。使用CLC Genomics Workbench和Microbial Genomics Module（QiAGEN，德国）在台湾国立大学的Microbiome中心进行了α多样性（特别是系统发育多样性）、PCoA和分类组成（包括堆叠条形图）的分析。所有其他统计分析和图表制作使用GraphPad Prism 8.0.2（GraphPad Software，LLC，San Diego，CA，美国）进行。所有其他统计分析均使用GraphPad Prism 8.0.2（GraphPad Software，LLC，San Diego，CA，美国）生成。统计显著性定义为p<0.05（用*、#或$等符号表示每个图例中定义的特定组之间的比较）。只有当个别样本不符合内部质量控制标准时才被排除（例如，蛋白质浓度不足或抗体信号失败），确保所有统计比较至少有n=3。

人工智能生成的内容（AIGC）
使用ChatGPT3.5来提高手稿的英语质量；该工具未进行科学解释或数据分析。

结果
饮食中的TEE独立于代谢状态改善了果糖引起的肠道屏障破坏和全身炎症
从三组小鼠中取出空肠部分，并用H&E染色进行结构观察。Fr.S小鼠的肠道上皮不完整（黑色箭头），绒毛的长度（长黑线和双头箭头之间的区域）较短，而在FST小鼠中，绒毛的完整性和长度都得到了恢复（图1A）。然后使用FITC-4K-Dextran检查肠道屏障的完整性，Dextran的荧光强度（FI）在Fr.S小鼠中显著较高，在FST小鼠中保持在基线水平（图1B）。随着肠道上皮完整性的受损，细菌可能通过泄漏部位进入血液并引起全身炎症18。可以在小鼠血清中检测到革兰氏阴性细菌和内毒素，Fr.S组的小鼠内毒素水平显著高于CTL组，而FST组的小鼠内毒素水平低于Fr.S组（图1C）。测量血清中的AST和ALT水平以观察全身炎症19。Fr.S小鼠的AST和ALT水平均升高，而在FST小鼠中保持在基线水平（图1DE）。肠道屏障的完整性由紧密连接的完整性维持20。Fr.S小鼠中紧密连接的关键蛋白ZO-1和occludin的表达减少，而在FST小鼠中增加（图1F）。ZO-1也用IHC标记，肠道屏障顶部的深棕色层（箭头）在Fr.S小鼠中较少，而在FST小鼠中得到恢复。然而，恢复并不完全，仍然有一些ZO-1的缺失部分（箭头）（图1G）。从电子显微镜图片来看，微绒毛（MV）无序，Fr.S小鼠的紧密连接完整性（白色箭头）低于CTL小鼠和FST小鼠（图1H）。这些结果表明，TEE通过抑制炎症和紧密连接的破坏来保护果糖引起的肠道损伤。

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图1. 饲喂过量果糖饮食和TEE的小鼠的肠道上皮完整性。(A) 不同食物组合处理的小鼠空肠的组织学改变。双头箭头：绒毛的高度。箭头：绒毛的顶端。血液中的Dextran（B）、内毒素（C）、AST（D）和ALT（E）水平。(n = 8，AB：非参数分析，C-E：单因素ANOVA) (F) 紧密连接组分的蛋白质表达，包括ZO1和occludin。(n = 6，单因素ANOVA) (G) ZO-1免疫组化的代表性图像。ZO-1的阳性染色区域由箭头指示。(比例尺：100 μm) (H) 肠道上皮细胞的TEM超微结构。紧密连接由白色箭头指示，线粒体由白色箭头指示。MV：微绒毛（比例尺：500 nm）。CTL：对照饮食。Fr.S：高果糖饮食。FST：每天补充TEE的高果糖饮食。

值得注意的是，这些对肠道屏障的保护作用没有显著改变小鼠的整体生理状态。虽然高果糖饮食增加了总热量摄入（表1）并导致相对胃肠道重量减少（补充图1B），但在14周的时间内，TEE补充并未影响体重曲线、空腹血糖或胰岛素敏感性（IPITT）（补充图1C–F）。此外，无论是否补充TEE，果糖喂养组的食物和水摄入量基本保持一致（补充图1G–J）。总体而言，这些发现表明TEE直接对抗果糖引起的肠病和全身炎症，其作用独立于宿主主要代谢参数的变化。

表1. 不同处理的小鼠热量摄入中三种主要营养素的比例。CTL：对照AIG饮食。Fr.S：高果糖饮食。FST：每天补充TEE的高果糖饮食。

TEE增强黏蛋白产生和杯状细胞功能
黏蛋白由杯状细胞产生，在肠道健康中起关键保护作用。为了研究TEE对黏蛋白分泌和杯状细胞的影响，测量了小肠中的杯状细胞数量。用PAS和Alcian blue在连续组织切片中染色含有多糖的杯状细胞（图2A和B，箭头），并计数杯状细胞的数量。TEE显著增加了杯状细胞的数量，而过量果糖并未影响杯状细胞的数量（图2C）。Muc2的RNA和蛋白质表达在Fr.S小鼠中减少，在FST小鼠中增加（图2，DE）。为了进一步研究TEE对黏蛋白产生的作用机制，从HT29肠道细胞分化出杯状细胞。分化后，细胞堆积成圆顶状，形成大颗粒（图2F，左侧面板），这些颗粒用Alcian blue染色呈蓝色（图2F，右侧面板，白色箭头）。杯状细胞表达了ESE1，这是杯状细胞的标记蛋白之一，并产生了MUC2蛋白（图2G）。在果糖处理下，黏蛋白产生途径被阻断，包括KRAS、p-Raf1、p-MEK1/2和最终产物MUC2也减少（图2H和补充图2A），然而NLRP6水平没有改变。TEE显著逆转了果糖对黏蛋白产生途径的影响，并增加了MUC2和NLRP6的表达（图2H，补充图2A和图2I）。给予Raf-1抑制剂regorafenib（rego）后，TEE中的蛋白质表达得到恢复，揭示了Raf-1/Ras/MEK/ERK途径在TEE对黏蛋白分泌保护作用中的重要性（图2I和补充图2B）。

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图2. 饲喂果糖或果糖和TEE的小鼠中的杯状细胞数量、黏蛋白分泌和杯状细胞分化。(A-C) 用PAS（A）和Alcian blue（B）染色计数肠道中的杯状细胞数量。PAS染色中的比例尺为100 μm，Alcian blue染色中的比例尺为200 μm。(n = 5，单因素ANOVA) 饲喂对照饮食（CTL）、果糖（Fr.S）或果糖和TEE（FST）的小肠中Muc2的RNA（D）和蛋白质（E）表达。(n = 5，单因素ANOVA) (F) 来自亲本HT-29细胞（CTL，上层面板）的杯状细胞分化（下层面板）。明场图像和Alcian blue染色显示了分化前后的细胞形态差异。黏蛋白产生由箭头指示。(G) 在用25 mM果糖处理48小时并预先用24小时TEE（1-5 μg/ml）或6 μM Raf1抑制剂regorafenib处理26小时后，杯状细胞中黏蛋白分泌标记物Muc2和杯状细胞标记物ESE1的蛋白质表达。(n = 5，单因素ANOVA) (HI) 在用25 mM果糖处理48小时并预先用24小时TEE（1-5 μg/ml）或6 μM Raf1抑制剂regorafenib处理26小时后，杯状细胞中的可能信号通路和Muc2的蛋白质表达。

TEE增加杯状细胞的分化
一旦杯状细胞受损，隐藏在隐窝中的肠道干细胞（ISC）必须被激活并分化为杯状细胞以替换受损细胞。Wnt3a和Wnt5a是杯状细胞更新和分化的经典和非经典信号通路22，在果糖处理下减少，而在TEE处理下增加。MUC2和ESE-1的产生也显示出与Wnt蛋白相同的趋势（图3A）。为了研究TEE对杯状细胞群体的恢复作用是否与肠道再生机制的激活有关，我们检查了Lgr5的表达，Lgr5是位于隐窝中的肠道干细胞的明确标记23。与杯状细胞数量减少一致，高果糖摄入显著抑制了隐窝区域Lgr5阳性细胞的存在（图3BC），表明饮食果糖压力损害了上皮更新所需的前体细胞池。然而，TEE补充有效地逆转了这种抑制，导致Lgr5荧光强度和蛋白质表达水平显著增加（图3B-D）。这些结果表明，TEE介导的黏液屏障恢复不仅仅是现有细胞的功能增强，还涉及激活肠上皮干细胞（ISC）微环境，并随后促进上皮细胞向分泌谱系分化。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像

图3. 果糖和TEE对杯状细胞分化的影响。(A) 在分化过程中，用25 mM果糖和TEE（1-5 μg/ml）处理的杯状细胞中，杯状细胞标志物Muc2和ESE-1以及杯状细胞分化标志物Wnt3a和Wnt5a的蛋白质表达。(n = 5 for MUC2和ESE1，n = 6 for Wnt3a和Wnt5a，单因素方差分析)(B) 肠道隐窝中LGR5的表达。LGR5用绿色荧光标记，而细胞核用Hoechst标记。(C) 通过Image J测量LGR5的荧光强度。(n = 6，单因素方差分析)(D) 肠道中LGR5的蛋白质表达及其定量。(n = 3，单因素方差分析) 样本大小的差异反映了技术损失或用于特定蛋白质定量组织的有限体积。

TEE重塑肠道微生物群组成并间接促进Akkermansia的富集

由于肠道是防止肠道内细菌入侵的屏障，因此肠道的完整性与微生物群密切相关。在Fr.S小鼠中，α多样性（代表微生物物种的多样性和丰富度）显著降低，而在FST小鼠中得到恢复（图4A）。值得注意的是，主坐标散点分析（PCoA）显示三个实验组有明显的聚类，表明TEE从根本上重塑了肠道微生物群结构，而不仅仅是部分恢复特定分类单元（图4B，绿色-CTL，紫色-Fr.S，红色-FST）。操作分类单元（OUT）也显示，在Fr.S组中，厚壁菌门（Bacteria Firmicutes）的增加和拟杆菌门（Bacteria Bacteroidetes）的减少导致厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比例显著增加（图4D）。与Fr.S组相比，FST组的F/B比例显著降低，而其他两个物种，疣微菌门（Bacteria Verrucomicrobia）和拟杆菌门/变形菌门（Bacteria Patescribatteria/Proteobacteria）在FST小鼠中增加（图4，CD）。在物种分析中，肽链球菌科（Peptostreptococcaceae）在Fr.S小鼠中成为优势菌群，而在FST小鼠中Akkermansia是主要菌群。研究表明Akkermansia与肠道完整性和宿主健康有关。为了确定TEE介导的Akkermansia muciniphila（AKK.）的扩增是由于直接的益生元刺激还是间接的宿主介导机制，我们使用两种不同的培养方法进行了体外生长实验（图4G–I）。有趣的是，虽然果糖本身略微促进了AKK.的生长，但添加TEE并未进一步加速AKK.的增殖。单独使用TEE也没有增加AKK.的增殖（图4G–I和补充图3）。这些关键观察结果排除了TEE对AKK.有直接刺激作用的可能性。相反，考虑到AKK.是一种专门的黏蛋白降解菌，这些结果强烈表明TEE可能通过改善宿主的肠道环境来促进AKK.的富集，特别是通过增加杯状细胞产生的黏液层这一主要营养来源。

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图4. 饲喂果糖或果糖和TEE的小鼠的微生物群变化。(A) 通过未加权的UniFrac分析肠道微生物群的α多样性。(B) 基于加权的UniFrac分析的肠道微生物群的β多样性，通过主坐标散点（PCoA）分析。（绿色-CTL，紫色-Fr.S，红色-FST）(C) 肠道微生物群在门水平上的物种差异。(D) 厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidetes）比例的变化。(n = 4，单因素方差分析)(E) 在不同食物组合喂养的小鼠中AKK.的含量变化。(n = 4，单因素方差分析)(GH) 在改良的GAM培养基中，通过微生物细胞计数试剂盒测量的AKK.的生长曲线，以及在不同处理下的生长情况。(I) 在改良的TSB培养基中，通过OD值在7-50小时测量的AKK.的生长曲线。

TEE减少过量果糖引起的肠道炎症

为了研究高果糖饮食对肠道的影响以及TEE的保护作用，进行了RNA测序。热图显示了三组之间的不同基因表达模式（图5A）。通过火山图进一步说明了CTL与Fr.S以及Fr.S与FST之间的基因差异（图5B）。上调（红色点）和下调（蓝色点）基因通过KEGG通路和GO富集进行分析。在CTL与Fr.S的比较中，确定了三个主要通路：肠道上皮细胞连接（红色点）、感染和炎症（紫色点）以及线粒体功能（绿色点）（图1C）。相比之下，Fr.S与FST的比较突出显示炎症反应是最显著改变的通路（图5D）。这些发现表明，高果糖饮食通过破坏连接、增加炎症和损害线粒体功能引起肠道损伤，而TEE主要通过减少炎症来缓解这些损伤。后续实验进一步研究了这些通路。

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图5. 给予果糖和TEE的小鼠的RNA测序结果和肠道炎症状态。(A) RNA测序的热图。(B) RNA测序结果的火山图。(C) 果糖（Fr.S）与CTL的KEGG通路分析。(D) TEE+果糖（FST）与果糖（Fr.S）的GO分析。(E) 肠道中炎性小体NLRP3和NLRP6以及炎症相关因子TLR4和TNF-α的蛋白质表达水平。(n = 6，单因素方差分析)(F) 肠道中NLRP6和IL-1β的RNA水平。(n = 5，单因素方差分析)

NLRP6信号通路和Ras/Raf/MEK/ERK通路可能有助于TEE的肠道保护作用

在Fr.S小鼠的肠道中，包括NLRP3在内的炎症标志物的蛋白质水平均增加，而在FST小鼠中降低（图5E）。炎症细胞因子IL-1β的RNA表达在Fr.S小鼠中也增加，在FST小鼠中降低（图5F）。另一种炎性小体NLRP6的蛋白质和mRNA水平在Fr.S小鼠中降低，而在FST小鼠中增加（图5EF）。在IEC6肠道上皮细胞培养的体外模型中，果糖处理后紧密连接蛋白ZO-1和occludin显著减少，而炎症蛋白TNFα、NLRP3和IL-1β显著增加（图6A和补充图2C）。TEE消除了果糖对紧密连接蛋白和炎症蛋白的影响（图6B）。NLRP6作为NLRP3的拮抗剂，其下游信号分子IL-18在果糖处理下的趋势与NLRP3相反，在同时接受果糖和TEE处理的细胞中增加（图6，AB和补充图2C）。为了进一步研究NLRP6在TEE介导的肠道上皮细胞保护中的作用，通过shRNA特异性敲低NLRP6。NLRP6和IL-18显著降低，而IL-1β和TNFα增加（图6C和补充图2D）。通过shRNA靶向NLRP6（shNLRP6）阻断了果糖处理下蛋白质表达的变化（图6D）。

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图6. NLRP6在TEE对肠道上皮细胞抵抗过量果糖引起的损伤中的保护作用。(AB) 在给予果糖24小时后，IEC-6肠道上皮细胞中紧密连接成分ZO1和occludin、炎症因子TNFα、IL-1b和IL-18以及炎性小体NLRP3和NLRP6的表达水平，无论是否同时给予TEE。(B: occludin和NLRP3的n = 5，其他指标的n = 4，单因素方差分析)(C) shRNA靶向Nlrp6对IEC6细胞中NLRP6和炎症因子IL-18、IL-1β和TNF-α表达水平的影响，与未进行shRNA处理的细胞（shNeg）相比。(D) 在给予果糖或果糖和TEE的IEC-6细胞中，炎性小体和炎症因子的蛋白质表达。(* p < 0.05与CTL或shNeg相比。# p < 0.05与果糖组相比。$ p < 0.05与相应的Fru+TEE组相比。n = 5，单因素方差分析)

TEE阻止了果糖引起的肠道上皮细胞线粒体损伤

由于测序结果表明线粒体可能在Fr.S引起的肠道损伤中起重要作用，因此检查了线粒体的形态和功能。通过TEM观察发现，与CTL和FST小鼠相比，Fr.S小鼠的肠道上皮细胞中的线粒体（箭头所示）出现肿胀，内线粒体膜的嵴减少，表明线粒体受到过量果糖的损伤，并通过TEE得到恢复（图7A）。为了进一步证明线粒体活性对TEE抵抗果糖引起的损伤的重要性，在IEC6细胞中使用了针对线粒体复合物I的抑制剂rotenone（Rot）。线粒体膜电位指示剂mitoview633的荧光强度（FI）在果糖处理的细胞（Fru）中降低，而在果糖和TEE处理的细胞（Fru+TEE）中显著增加，然后在同时接受果糖+TEE+rotenone处理的细胞（Fru+TEE+Rot）中进一步降低（图7B和补充图4）。代表性荧光图像显示了功能线粒体（MitoView? 633，红色）相对于细胞核（Hoechst 33342，蓝色）的分布（图7C）。在Fru+TEE+Rot细胞中，炎性小体和下游信号分子NLRP3和IL-1β均增加，表明线粒体膜电位对TEE抵抗果糖引起的肠道上皮细胞损伤的保护作用很重要。

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图7. 线粒体在TEE对抗果糖引起的肠道炎症保护中的作用。(A) 饲喂对照饮食（CTL）、高果糖饮食（FrS）或高果糖加TEE（FST）的小鼠的肠道上皮细胞超微结构。MV：微绒毛。N：细胞核。线粒体用白色箭头表示。比例尺：上图2 μm，下图500 nm。(B) 通过流式细胞术测量的IEC6在24小时接受25 mM果糖（Fru）、25 mM果糖和2.5 μg/ml TEE（Fru+TEE）或25 mM果糖和2.5 μg/ml TEE及1 nM rotenone（Fru+TEE+Rot，预处理16小时）处理后的线粒体膜电位（ΔΨm）。(n = 6，单因素方差分析)(C) 在接受果糖（Fru）、果糖和TEE（Fru+TEE）或果糖、TEE和rotenone（Fru+TEE+Rot）处理的IEC-6细胞中，用mitoview633（红色荧光）和Hoechst33342（蓝色荧光）染色的线粒体膜电位的代表性合并图像。比例尺：100 μm。(D) 在指定处理下的IEC-6中NLRP3和IL-1β的蛋白质表达水平。* p < 0.05与CTL相比。# p < 0.05与果糖组相比。$ p < 0.05与Fru+TEE组相比。(n = 5，单因素方差分析)

讨论

在这项研究中，我们证明了饮食中的TEE在过量摄入果糖的情况下对肠道健康具有显著的保护作用。TEE不是作为一种直接的药理干预，而是一种生物活性食物成分，它保持肠道屏障的完整性，调节杯状细胞分化，并促进有益的微生物群谱型。鉴于全球高果糖加工食品消费量的增加，我们的发现为将TEE作为功能性食品成分来缓解饮食相关的肠道稳态紊乱提供了有力的机制基础（图8）。

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图8. TEE缓解高果糖引起的肠道稳态紊乱的提出机制。TEE通过调节宿主/微生物群/黏液轴发挥多靶点保护作用，对抗果糖引起的肠病。具体来说，TEE通过几个关键通路对抗高果糖引起的肠道损伤：(1) 增强黏液屏障：TEE激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路以促进黏蛋白（MUC2）的分泌，并上调Wnt3a/Wnt5a信号通路，驱动肠道干细胞的自我更新和杯状细胞分化。由此增加的黏蛋白可用性为Akkermansia muciniphila的扩增提供了有利的生态位。(2) 抑制炎症：TEE作为NLRP6的强效激活剂，拮抗NLRP3介导的炎性小体激活，从而减少促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α）并防止全身性内毒素血症。(3) 增加干细胞更新：TEE通过Wnt3a增加杯状细胞的自我更新，并通过Wnt5a促进杯状细胞分化。这些效应有助于保持细胞完整性：TEE能够恢复线粒体膜电位并稳定紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin），从而维持肠道屏障的物理完整性。总体而言，这些发现表明TEE是一种具有生物活性的功能性成分，能够在饮食中的糖分压力下保护肠道稳态。肠道上皮细胞是宿主与外部环境之间的关键接口。观察到过量果糖会导致线粒体肿胀，这可以归因于果糖独特的代谢途径。与葡萄糖不同，果糖由酮己糖激酶（KHK）进行代谢，而酮己糖激酶缺乏负反馈机制。这导致果糖迅速磷酸化并伴随ATP耗竭，进而引起细胞内ADP和AMP的积累。随后AMP的降解会产生过多的尿酸，从而引发氧化应激和线粒体形态变化，如肿胀和嵴结构紊乱。我们的RNA-seq分析和TEM超微结构观察显示，TEE显著减轻了果糖引起的线粒体肿胀和嵴结构丧失。维持线粒体活性至关重要，因为像ZO-1和Occludin这样的紧密连接蛋白的组装是一个能量依赖的过程。通过稳定线粒体功能，TEE确保了维持物理屏障所需的能量，从而降低了全身内毒素血症和肝脏炎症标志物（AST/ALT）的水平。本研究的一个关键发现是，TEE不仅通过加强上皮密封作用来保护肠道，还增强了生物屏障——黏液层。虽然过量果糖会损害黏蛋白的生成，但TEE显著增加了杯状细胞的数量和MUC2的表达。我们的数据表明TEE具有双重作用机制：首先，TEE通过Wnt3a/Wnt5a信号通路促进Lgr5+肠道干细胞分化为杯状细胞；其次，它激活Ras/Raf/MEK/ERK通路以增强成熟杯状细胞的分泌功能。抑制Raf-1显著阻断了这些效应，证实TEE利用这一经典信号通路来维持黏液层。此外，TEE成分激活Ras/Raf/MEK/ERK级联的具体分子机制值得进一步探索。三萜类化合物，包括来自Momordica charantia的三萜类化合物，是高度亲脂的分子，能够渗透到肠道上皮细胞膜中。这种相互作用可能会改变膜流动性或脂质筏的组织结构，而脂质筏被认为是Ras蛋白聚集和随后Raf/MEK/ERK激酶级联磷酸化的重要平台。此外，先前的研究表明，某些植物来源的五环三萜类化合物可以作为G蛋白偶联的胆汁酸受体1（GPBAR1，也称为TGR5）的激动剂，该受体调节肠道屏障完整性和抗炎反应。激活这些膜受体可能将TEE成分与我们在研究中观察到的下游NLRP6和Wnt/β-连环蛋白信号通路联系起来。特别是，杯状细胞特异性转录因子ESE-1的上调表明TEE也可能影响使肠道干细胞向分泌谱系分化的核事件。未来使用细胞热位移测定（CETSA）或分子对接的方法将有助于确定TEE主要成分的直接结合靶点。肠道微生物群组成的变化是果糖诱导的代谢压力的标志，其特征是Firmicutes/Bacteroidetes比例增加。F/B比例是肠道菌群失调和疾病（如炎症性肠病（IBD）或乳腺癌）的指标。TEE的应用成功逆转了这种菌群失调，并显著增加了AKK的数量。AKK是一种专门的黏蛋白降解细菌，在维持肠道稳态和抗炎反应中起关键作用。有趣的是，我们的体外结果显示TEE并不直接刺激AKK的生长，而是通过增加内源性黏蛋白的可用性来促进AKK的扩增，而内源性黏蛋白是AKK的主要营养来源。这表明TEE的益生元效应可能是通过宿主来源的代谢微环境而非直接微生物刺激来实现的。在分子水平上，我们确定NLRP6是TEE介导保护作用的核心调节因子。与促炎性的NLRP3炎症小体不同，NLRP6对黏液分泌和防止菌群失调至关重要。高果糖摄入会抑制NLRP6的表达，导致NLRP3的激活和促炎细胞因子（如IL-1β、TNF-α）的释放。TEE恢复了NLRP6的表达，有效对抗了果糖引起的肠道炎症。使用shRNA-NLRP6进行的失功能实验进一步证实，TEE的抗炎和屏障保护作用在很大程度上依赖于NLRP6信号通路。此外，我们的研究中使用MitoView? 633这种依赖电位的染料发现，TEE不仅恢复了ΔΨm，还显著增强了其值。这表明TEE可能通过激活NLRP6-线粒体轴来作为线粒体自噬调节剂或电子传递链的增强剂。即使在罗通宁（一种复合物I抑制剂）存在的情况下，ΔΨm的稳定维持表明TEE可能激活了替代的呼吸途径或为肠道上皮提供了额外的代谢韧性。我们的转录组分析提供了对TEE保护作用更深入的机制理解。高果糖摄入显著上调了参与“代谢劫持”的酶，如酮己糖激酶（KHK）、醛缩酶B（ALDOB，由Aldob编码）和三激酶以及FMN环化酶（TKFC，由Tkfc编码），同时还上调了与糖异生相关的基因[果糖-二磷酸酶1（FBP1）和葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基1（G6PC1）]。这种代谢过载，加上抗氧化基因[谷胱甘肽S转移酶μ1（Gstm1，一种参与中和氧化应激产物的关键II期酶]和顶端转运蛋白[solute carrier family 5成员12（Slc5a12）]的下调，可能导致了观察到的线粒体耗竭和随后的NLRP6抑制。重要的是，TEE治疗有效抵消了这些病理变化。我们观察到与蛋白质稳态修复和蛋白质翻译相关的基因显著上调，包括真核生物翻译延长因子1α1（Eef1a1）、真核生物翻译延长因子2（Eef2）、核糖体蛋白S2（Rps2）和核糖体蛋白L3（RPL3），表明TEE恢复了细胞合成连接复合体和黏液屏障所需结构蛋白（如MUC2）的能力。此外，TEE下调了促炎和应激响应基因[干扰素诱导的具有四肽重复序列的蛋白质1（Ifit1）、组织相容性2、囊胚（H2-BL）和富含脯氨酸的酸性蛋白质1（Prap1），同时稳定了与线粒体相关的表达[如线粒体编码的NADH:泛醌氧化还原酶核心亚基4（mt-ND4）]并促进了替代能量利用途径[如3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合成酶2（Hmgc2）]。虽然这些转录组趋势提供了一个连贯的生物学框架，但这些基因与NLRP6/Wnt轴之间的精确功能层次需要在未来的研究中进一步验证。此外，我们还研究了TEE的效果是否是由于抑制了果糖通过酮己糖激酶-C（KHK-C）的代谢。结果表明，TEE并未改变肠道细胞（补充图5AB）和组织（补充图5C）中的KHK-C表达，表明其保护机制独立于果糖的初级代谢。这强调了TEE直接作用于宿主的保护性信号通路（NLRP6和Wnt）以及微生物群-黏液界面，以提供对果糖诱导损伤的抵抗力。总之，我们的研究表明TEE是肠道/微生物群/黏液轴的强效调节剂。通过激活NLRP6和Ras/MEK/ERK通路，TEE恢复了线粒体功能，促进了杯状细胞的分化，并促进了有益细菌（如AKK）的生长（图8）。这些多方面的效应共同保护了肠道生态系统，突显了TEE作为预防过量果糖引起的肠病的有希望的饮食策略。研究局限性本研究存在一些局限性需要承认。使用12周大的C57BL/6J小鼠意味着它们在高果糖干预之前的早期发育和饮食不在我们的直接控制范围内。尽管这些小鼠来自标准化设施，但12周时已建立的基线微生物群可能会影响它们对饮食果糖和TEE的后续反应。未来追踪从出生开始的肠道发育的纵向研究将提供对TEE保护作用的更全面理解。作者贡献声明Hsiu-Ni Kung：撰写——原始草稿、监督、资源管理、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。Kai-His Lu：撰写——审阅与编辑、软件使用、方法学、正式分析、数据管理。An Hsiao：方法学、研究、正式分析、数据管理。Yu-Jui Lin：方法学、研究、数据管理。Po-Jung Tsai：撰写——审阅与编辑、可视化、资源管理。Ping-Jun Wang：方法学、数据管理。Mei-Ling Chang：撰写——审阅与编辑、资源管理、方法学。Sheng-Wei Hsu：方法学、数据管理。Shu-Mei Lai：方法学、数据管理。Horng-Tzer Shy：方法学、数据管理。利益声明所有作者均无与本文发表直接或间接的商业利益关联。数据可用性声明支持本研究结果的数据可从通讯作者Kung处获得，如需可合理请求。未批准产品的披露作者声明作者报告没有需要声明的竞争利益。披露未批准产品产品TEE尚未标记为可用于讨论，且仍处于研究阶段。写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT 3.5来改进语言。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。