使用反相高效液相色谱法（reverse-phase HPLC）对用于合成药物物质的生物催化剂中残留的蛋白质进行定量分析

《Journal of Chromatography A》：Quantification of residual protein from biocatalysts employed in the synthesis of pharmaceutical drug substances using reversed-phase HPLC

　　马修·R·斯沃耶（Matthew R. Swoyer）| 凯特琳·M·弗林（Kaitlyn M. Flynn）| 蒂莫西·A·布朗（Timothy A. Brown）| 菲利普·D·克莱曼（Phillip D. Clayman）| 艾米丽·L·吉尔（Emily L. Gill）| 安迪·D·罗伯逊（Andy D. Roberson）| 乔丹·M·希克（Jordan M. Shick）| 伊丽莎白·A·哈特内特（Elizabeth A. Hartnett）| 詹姆斯·P·格林尼亚斯（James P. Grinias）| 贾斯汀·M·戈迪尼奥（Justin M. Godinho）
GSK分析开发部门，美国宾夕法尼亚州科利奇维尔市南科利奇维尔路1250号，邮编19426

**摘要**
生物催化，即利用酶来催化化学转化，在制药物质的制造中正变得越来越重要。使用生物催化剂显著提高了工艺效率和可持续性，这与整个行业提高环保水平的努力相一致。尽管有这些优势，但生物催化剂也引入了额外的挑战，必须解决这些问题以确保患者安全和产品质量。特别是，必须通过工艺优化和精细的分析技术来控制生物催化剂的残留物。长期以来，已经建立了用于蛋白质定量的分析技术，但在这些技术中，许多在准确性、用户友好性、重复性和对基质干扰的敏感性方面存在不足。为了解决这些问题，本文提出了一种使用反相液相色谱（RPLC）结合紫外吸收检测的方法，以在药物物质和/或合成中间体存在的情况下定量生物催化剂残留物。初步数据表明该方法可广泛应用于小分子和寡核苷酸药物制剂。此外，该方法还被验证为一种有效的方法，可用于定量使用生物催化剂合成的后期小分子中间体中的残留蛋白质。该方法提供了一种用户友好、稳健且适用范围广泛的解决方案，克服了关键的分析限制，从而支持了生物催化路线在制药开发和制造中的持续扩展。

**引言**
近几十年来，生物催化剂在制药制造中的应用速度加快[1,2]。美国化学会绿色化学研究所制药圆桌会议（ACS Green Chemistry Institute Pharmaceutical Roundtable）对11家制药公司和1家农药公司进行的2025年调查显示，已有超过830种生物催化转化被研究用于合成，其中182种转化的规模超过了1克[2]。定向进化技术的进步（通过迭代引入有益突变来模拟自然进化）使得能够获得高度选择性的酶，这些酶能够高效地进行复杂的化学转化，这对制药化合物的工业规模合成非常重要[[3], [4], [5]]。例如，在阿托伐他汀（Lipitor的活性成分）的关键中间体的合成中使用了三种酶[6]；在西他列汀（Januvia的活性成分）的合成中使用了转氨酶[7]；以及在使用多酶级联反应的COVID-19抗病毒药物molnupiravir的合成中改进了工艺[8]。这些工艺分别获得了2006年、2010年和2022年的美国环境保护署总统绿色化学挑战奖[9]。生物催化转化的增加主要是由于其相对于传统化学方法的诸多优势：它们可以通过使用更温和的反应条件、提高能源效率、使用可再生材料、减少或消除有害催化剂和试剂以及减少合成步骤等措施来提高过程的可持续性和降低碳足迹[2,10,11]。这些优势可以降低过程质量强度（PMI）和E因子（每单位产品产生的废物量），这两个指标描述了过程在资源消耗和废物产生方面的效率[1,2,12,13]。通过计算PMI和E因子的值，可以直接比较含有和不含有生物催化剂的过程的效率，从而证明其在工业环境中的使用合理性。使用生物催化剂提高的工艺效率还与制造时间和成本的减少相关，为制造商带来了经济效益[14]。

虽然生物催化剂在制药制造过程中的应用具有明显的好处，但为了成功实施还需要解决一些额外的挑战。一个主要问题是控制最终产品中残留的酶。目前，对于使用生物催化剂的小分子制造过程，还没有明确的监管指南。然而，各公司通常会采取控制措施，以确保生物催化剂残留物不会对产品质量和患者安全产生负面影响。行业领袖的讨论提供了有关最佳实践的宝贵见解，指出酶的质量、清除策略和分层风险评估是使用酶时的关键考虑因素[15]。分层风险评估考虑了药物的给药途径以及酶的纯度和来源作为主要区分因素。随后的一份报告强调了几个案例研究，其中类似的控制策略得到了分析测试的支持，并获得了监管机构的认可[16]。在每个案例中，定量分析测量结果都表明在工艺的不同阶段蛋白质被清除到了规定的水平以下，这对于获得监管机构的认可至关重要。

**分析技术**
有许多用于蛋白质定量的分析技术，其中许多可以用于定量生物催化过程中的残留蛋白质。常用的技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、比色测定（如Bradford测定、BCA测定）和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）[16]。ELISA是一种广泛使用且特异性的蛋白质定量技术，但其检测范围仅限于为其开发的蛋白质[17]。因此，ELISA无法可靠地定量总残留蛋白质，可能无法检测测试材料中存在的其他蛋白质（如宿主细胞蛋白质、降解产物）[18]。像Bradford测定和BCA测定这样的比色测定适合确定总蛋白质含量，但这些测试容易受到基质干扰和样品不稳定性的影响，限制了其适用性[16,19,20]。此外，重新溶解沉淀蛋白质所需的高浓度变性盐和样品稀释剂的酸性可能会影响这些测定的准确性[21,22]。SDS-PAGE是一种根据蛋白质分子量进行分离的定性技术。SDS-PAGE常与其他定量测定结合使用，以支持关于蛋白质身份和纯度的结论，并且还通过使用蛋白质标准溶液作为定性限值测试[16]。结合图像分析，SDS-PAGE已成功用于在含有小分子基质的情况下定量残留蛋白质，提供了关于蛋白质身份和数量的信息[23]。尽管如此，与更用户友好和更高通量的分析方法相比，SDS-PAGE仍然是一项劳动密集型且耗时的技术[24]。虽然这些技术是有价值的工具，可用于互补测量，但在定量生物催化剂残留物时，它们的选择性、基质干扰和易用性方面的局限性限制了其应用范围。

**分离技术**
可以采用分离技术来克服基质干扰和选择性问题。常用的总蛋白质定量分离技术是高效液相色谱（HPLC）[25]。首先进行水解程序，将样品中的蛋白质分解为其组成氨基酸，然后使用各种色谱模式对氨基酸进行分离，这些氨基酸可以通过紫外（UV）吸收、荧光或质谱（MS）检测器进行检测[16,18,26,27]。氨基酸分离也可以通过毛细管电泳（CE）实现，后者通常与MS检测结合使用[28]。特别是与MS结合使用的氨基酸分析可以是非常敏感和特异性的技术，能够全面测量样品中的总蛋白质含量。然而，样品制备所需的水解程序可能较长，如果处理不当可能会引入分析变异性[25,27]。这使得其在需要高通量和用户友好技术的过程开发等领域的常规应用变得困难。反相液相色谱（RPLC）结合紫外吸收检测是一种成熟的蛋白质分析技术[29]。与其他分离模式相比，RPLC在可用固定相的数量、柱子的稳健性和用户友好性方面具有优势。虽然RPLC用于生物催化剂残留物分析的例子通常仅限于上述的氨基酸分析[18]，但该技术也适用于测量未水解的蛋白质。RPLC已成功用于在聚合物和杀菌剂配方基质中定量肽和蛋白质[20,30]。然而，同样的方法并未常规用于在含有小分子药物物质或中间体的情况下定量生物催化剂残留物。

**本文方法**
本文提出了一种使用RPLC结合紫外吸收检测的方法，以在含有药物物质和/或合成中间体的情况下定量生物催化剂残留物。该方法已广泛应用于小分子和寡核苷酸药物制剂中生物催化剂残留物的分析，并涵盖了多种具有合成相关性的酶类。在RPLC方法的基础上，开发并验证了一种用于后期小分子药物中间体的方法，实现了对制造过程中生物催化剂残留物的精确控制。该方法在简易实验室环境中的应用也得到了验证，展示了其在用户友好性和在加速工艺开发时间表下提供数据方面的优势。RPLC方法提供了一种用户友好、稳健且适用范围广泛的解决方案，克服了更传统技术的关键分析限制，从而支持了生物催化路线在制药开发和制造中的持续扩展。

**实验部分**
小分子药物中间体、小分子药物物质、寡核苷酸药物物质、最终酮还原酶（KRED）以及定向进化产生的几代产物（包括亚胺还原酶（IRED）、胺转氨酶（ATA）、苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）和用于寡核苷酸药物物质制造的连接酶，以及免疫球蛋白G（IgG）均由英国伦敦的GSK plc生产。小分子测试溶液1中含有尿嘧啶、茶碱等成分。

**RPLC方法的概述和适用性**
本文探讨了一种使用RPLC结合紫外吸收检测的方法，以在含有小分子药物物质和/或合成中间体的情况下定量生物催化剂残留物。该方法的关键在于能够将残留蛋白质与含有小分子药物的样品基质分离。为此，使用了一种填充了宽孔表面多孔颗粒（HALO 1000 ? Diphenyl，2.7 μm）的色谱柱。孔径是色谱柱的一个重要特性。

**结论**
随着合成工艺的发展和向更可持续路线转变的趋势，生物催化剂在制药物质制造中的使用将继续增加。为了确保产品质量和患者安全，必须采取措施确认合成过程中生物催化剂的残留物得到控制。本文描述的RPLC方法可以作为测量用于小分子药物物质制造的生物催化剂残留物的起点。

**作者贡献**
马修·R·斯沃耶（Matthew R. Swoyer）：概念化、方法论、验证、研究、初稿撰写、审稿与编辑。
凯特琳·M·弗林（Kaitlyn M. Flynn）：研究、审稿与编辑。
蒂莫西·A·布朗（Timothy A. Brown）：研究、审稿与编辑。
菲利普·D·克莱曼（Phillip D. Clayman）：研究、审稿与编辑。
艾米丽·L·吉尔（Emily L. Gill）：研究、审稿与编辑。
安迪·D·罗伯逊（Andy D. Roberson）：验证、审稿与编辑。
乔丹·M·希克（Jordan M. Shick）：验证、审稿与编辑。
伊丽莎白·A·哈特内特（Elizabeth A. Hartnett）：验证、审稿与编辑。

**利益冲突声明**
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：詹姆斯·P·格林尼亚斯（James P. Grinias）表示获得了美国国家科学基金会化学部门化学测量与成像计划（Chemical Measurement and Imaging Program）的财政支持。M.R.S、K.M.F、T.A.B、P.D.C、E.L.G、A.D.R、J.M.S、J.M.G受雇于GSK。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系。

**致谢**
J.P.G.获得了美国国家科学基金会化学部门化学测量与成像计划（Grant CHE-2045023）的支持。作者感谢凯特琳·格林尼亚斯（Kaitlin Grinias）、安妮·佩恩（Anne Payne）、丹尼尔·法布里（Daniel Fabry）、瑞安·鲁特科斯基（Ryan Rutkoski）、以赛亚·库阿特罗（Isaiah Cuartero）和约瑟夫·霍斯福德（Joseph Hosford）对手稿的贡献和/或审稿。