基于超滤结合液相色谱串联质谱技术对mPEG-PLA共聚物的临界胶束浓度进行直接测定

《Journal of Chromatography A》：Direct measurement of critical micelle concentrations of mPEG-PLA copolymers based on ultrafiltration combined with liquid chromatography tandem mass spectrometry

　　

王浩然|王新怡|姚佳怡|孟向军

天津大学医学院药学科学与技术学院，中国天津300072

摘要

临界胶束浓度（CMC）是决定聚合物胶束在药物递送中形成和稳定性的关键参数。传统的CMC测定方法依赖于间接测量，受到灵敏度有限或潜在干扰等问题的限制。为了克服这些限制，本研究建立了一种基于超滤与液相色谱-串联质谱（UF-LC-MS/MS）联用的方法，用于直接测定不同PLA链长的甲氧基聚（乙二醇）-嵌段-聚（D,L-乳酸）（mPEG-PLA）的CMC。LC-MS/MS方法对mPEG₂₀₀₀-PLA₂₀₀₀、mPEG₂₀₀₀-PLA₃₀₀₀和mPEG₂₀₀₀-PLA₅₀₀₀的定量表现出良好的线性、准确性和精度。优化和验证的超滤过程确保了胶束与单体之间的选择性分离。通过识别测试样品中游离mPEG-PLA浓度的拐点，确定了mPEG₂₀₀₀-PLA₂₀₀₀的CMC为5.77 ± 0.16 μg/mL，mPEG₂₀₀₀-PLA₃₀₀₀为3.02 ± 0.16 μg/mL，mPEG₂₀₀₀-PLA₅₀₀₀为1.86 ± 0.04 μg/mL。这些结果与传统的芘荧光探针测定法相当，表明UF-LC-MS/MS是测定mPEG-PLA共聚物的CMC的可靠工具，具有广泛应用于其他两亲性聚合物的潜力。

引言

聚合物胶束作为一种新型药物递送系统受到了广泛关注[1,2]。其功能高度依赖于组成两亲性聚合物的临界胶束浓度（CMC）。在水溶液中，这些聚合物只有在超过CMC的浓度下才会自组装形成胶束。低于此阈值时，它们主要以单体的形式存在[[1], [2], [3], [4]]。作为与胶束稳定性密切相关的关键参数[1]，较低的CMC可以减少稀释过程中的胶束解离，从而提高稳定性[5,6]。因此，CMC在调节胶束稳定性方面起着关键作用，进而优化药物装载和释放[7]，并指导配方设计中的聚合物选择[[8], [9], [10]]。

用于测定CMC的传统技术包括表面张力法、电导率法、光散射法、染料溶解法和荧光探针法[[11], [12], [13], [14]]。然而，这些方法存在一些共同的限制。例如，表面张力和电导率测量方法的灵敏度通常较低，仅适用于测定相对较高的CMC值[15,16]。染料溶解法和荧光探针法的一个普遍挑战是染料或探针可能影响胶束的形成，从而影响所得CMC值[17]。重要的是，所有上述方法都是间接方法，通过观察接近CMC时特定物理化学性质的变化来推断CMC[18]。由于不同物理化学性质在CMC附近的改变模式存在差异，这些间接方法在比较不同技术获得的结果时可能导致不一致[18]。此外，通过间接测量确定的“临界”转变可能并不完全对应于分子水平的临界浓度，从而导致不准确性[19]。因此，直接测定两亲性聚合物CMC的方法是必要的。

直接测定两亲性聚合物的CMC需要分离胶束态和单体态，并对这两种状态之一或两者进行定量。虽然可以通过超滤根据大小分离胶束和单体，但膜吸附问题阻碍了有效分离[20,21]。此外，由于两亲性聚合物的多分散分子量，其定量也面临重大挑战[18]。

甲氧基聚（乙二醇）-嵌段-聚（D,L-乳酸）（mPEG-PLA）是一种由亲水性甲氧基聚（乙二醇）（mPEG）和疏水性聚（乳酸）（PLA）段组成的双嵌段两亲性共聚物[[22], [23], [24]]，广泛用于构建用于药物递送的聚合物胶束[25]。在本研究中，我们使用mPEG-PLA作为模型聚合物，通过将超滤与液相色谱-串联质谱（UF-LC-MS）结合，开发了一种直接测定三种不同分子量mPEG-PLA变体CMC的方法。超滤过程中的膜吸附问题得到了有效解决，mPEG-PLA通过源内碰撞诱导解离耦合多反应监测（ISCID-MRM）基于LC-MS/MS进行定量。超滤分离的选择性通过动态光散射分析得到验证，定量方法也经过了全面验证。通过识别超滤后游离mPEG-PLA浓度的拐点来确定CMC值。此外，还与传统的芘荧光探针方法进行了比较评估。结果表明，UF-LC-MS/MS方法在测定CMC方面具有稳健性、高灵敏度和特异性。

章节摘录

化学品和材料

mPEG₂₀₀₀-PLA₂₀₀₀、mPEG₂₀₀₀-PLA₃₀₀₀和mPEG₂₀₀₀-PLA₅₀₀₀由中国重庆渝思药业科技有限公司提供。HPLC级乙腈和异丙醇购自加拿大多伦多的Fisher Scientific公司。HPLC级甲酸购自中国上海的上海麦克林生化科技有限公司。分析级乙醇购自中国北京的北京英诺化学科技有限公司。丙酮购自天津江天

为了解决mPEG-PLA多分散分子量带来的定量挑战，开发了一种结合ISCID-MRM的LC-MS/MS方法。在离子源中生成了一系列来自mPEG-PLA的碎片离子，其中m/z为549的碎片显示出高且稳定的信号。鉴于PEG单元的相对分子质量为44 Da，PLA单元的相对分子质量为72 Da[30]，该离子对应于由一个PEG单元和七个PLA单元组成的mPEG-PLA片段

结论

本研究开发了一种UF-LC-MS/MS方法，比现有方法能更直接地测定mPEG-PLA的CMC。基于ISCID-MRM的LC-MS/MS定量方法在纳克级浓度下表现出高准确性和精度，超滤实现了胶束与单体的有效分离。mPEG-PLA的CMC随着PLA链长的增加而降低。与传统芘荧光探针方法的比较分析显示

王浩然：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，软件，方法学，研究，正式分析，数据管理，概念化。王新怡：研究。姚佳怡：研究。孟向军：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

我们感谢孙杰芳博士在胶束表征方面的帮助。本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：82304443）和天津市自然科学基金（项目编号：24JCQNJC01480）的支持。